一種新的轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明名為“一種新的轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌檢測試劑盒及其檢測方法”，涉及轉(zhuǎn)基因微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明通過巧妙地設(shè)計(jì)針對轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌特異序列的帶標(biāo)記引物和探針，結(jié)合PCR擴(kuò)增和核酸試紙條檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的高效快速檢測。該方法特異性強(qiáng)，靈敏度局和穩(wěn)定性好，對于提局轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的準(zhǔn)確性、縮短檢測時(shí)間具有非常顯著的作用。本檢測試劑盒使用方便快捷，節(jié)約成本和時(shí)間，原理和操作簡單，可用于快速檢測轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌。
【專利說明】一種新的轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌檢測試劑盒及其檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種利用PCR擴(kuò)增和核酸試紙條 技術(shù)相結(jié)合的快速檢測轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的試劑盒，適用于轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的快速 檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，是細(xì)菌中的一個常見 種，廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。有的菌株是a-淀粉 酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌。
[0003] 目前在酶制劑產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因微生物檢測的技術(shù)還是主要依靠傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的 形態(tài)學(xué)檢測方法，檢測靈敏度低，而且檢測周期需要幾天時(shí)間。近些年來，隨著分子生物學(xué) 檢測技術(shù)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)成了微生物快速檢測的常用手段，但是擴(kuò)增產(chǎn)物需要凝膠電 泳，紫外凝膠成像，步驟多，耗時(shí)長，而且存在核酸染色劑環(huán)境污染的問題。
[0004] 本研究通過巧妙地設(shè)計(jì)針對轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的帶標(biāo)記的特異性引物和探針， 應(yīng)用PCR擴(kuò)增和核酸試紙條檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的高效快速準(zhǔn)確檢測。 該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高和穩(wěn)定性好，對于轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌檢測的準(zhǔn)確性、檢測效率 的提高具有重要的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供用于檢測轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的兩套特異性 引物和探針。
[0006] 本發(fā)明需要解決的另一問題是提供包含上述引物的核酸試紙條檢測試劑盒。
[0007] 本發(fā)明用于檢測轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的兩套PCR引物及探針序列為：

【權(quán)利要求】
1. 兩套用于轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌檢測的特異性引物和探針，其特征在于，序列為：
2. -種用于檢測轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的試劑盒其特征在于，包括如下成分： (1) 陽性對照轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌DNA模板和陰性對照野生型枯草芽孢桿菌DNA模板 (2) 轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌Spo、NprE特異序列上下游特異引物和探針
(3) IOXTaq PCR Buffer，ddH20，2. 5mM dNTP，5U/ii I Taq 酶 (4) 生物素（Biotin)、熒光素（Fite)抗原標(biāo)記的薄膜層析試紙條。
3. -種轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的快速檢測方法，包括如下步驟： (1) PCR反應(yīng)體系：
PCR 反應(yīng)條件：94 °C 預(yù)變性 I min，94 °C變性 30 s，60.8 °C °C退火 30 s，72 °C延 伸30 s，30個循環(huán)，72 °C延伸5 min (2) 探針雜交：擴(kuò)增結(jié)束后，加入探針（IOii mol/L) 2 iil，94 °C變性30 s，60 °C退火 30 s (3) 取4 ii L擴(kuò)增、雜交產(chǎn)物加到試紙條的樣品墊上，然后滴加2-3滴緩沖液，5 min后 判讀并記錄結(jié)果 (4) 判定結(jié)果：用Spo、NprE兩套特異引物探針進(jìn)行擴(kuò)增、雜交，PCR產(chǎn)物用試紙條檢 測，兩套引物、探針控制線正常，檢測線都呈現(xiàn)陽性時(shí)，則說明該樣品含有轉(zhuǎn)基因枯草芽孢 桿菌，若有一套或兩套引物、探針試紙條檢測結(jié)果顯示為陰性，則判定樣品中沒有轉(zhuǎn)基因枯 草芽孢桿菌。
【文檔編號】C12Q1/04GK104212907SQ201410484737
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】張?jiān)＞? 賀艷, 趙衛(wèi)東, 趙璟源, 鄭文杰 申請人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心