一種提高大豆發(fā)狀根陽性轉(zhuǎn)化率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種提高大豆發(fā)狀根陽性轉(zhuǎn)化率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆（GlycinemaxL.Merr.)是重要的糧油兼用作物，也是目前轉(zhuǎn)基因品種種植 面積最大的作物。2013年，全球轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積已達(dá)8450萬公頃，約占世界大豆種 植總面積的79%，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為大豆新品種培育的重要手段。目前使用較為廣泛的大 豆轉(zhuǎn)化體系，W根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化體系和基因槍介導(dǎo)的幼胚轉(zhuǎn)化體系為主。但 兩個轉(zhuǎn)化體系均存在轉(zhuǎn)化周期較長、轉(zhuǎn)化效率較低等問題，不利于目標(biāo)基因在大豆中育種 應(yīng)用價值快速評估工作的開展。
[0003] 近年來，隨著基因功能分析研究需求的不斷增加，發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆發(fā)狀根 轉(zhuǎn)化體系越來越受到重視。該轉(zhuǎn)化體系具有轉(zhuǎn)化周期短、轉(zhuǎn)化效率高、單細(xì)胞分化而來的發(fā) 狀根變異性低等突出優(yōu)點。盡管目前尚不能用運種方法獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，但已在固氮、 抗病、耐鹽等與根系密切相關(guān)的基因功能分析和育種價值評價等方面發(fā)揮了重要作用。利 用適宜的培養(yǎng)條件，還可將誘導(dǎo)出的發(fā)狀根進(jìn)一步誘導(dǎo)出愈傷組織，從而進(jìn)一步拓展基因 功能分析的范圍。
[0004] 常用的大豆發(fā)狀根轉(zhuǎn)化體系，在轉(zhuǎn)化過程中不使用篩選劑對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選，盡 管能夠產(chǎn)生較多的發(fā)狀根，但由于其中非轉(zhuǎn)化體的頻率通常高達(dá)70%W上，后期需對其進(jìn) 行大量的鑒定工作，識別出轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根用于后續(xù)研究和工作，鑒定工作量巨大，費時、費 力。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]本發(fā)明的一個目的是提供一種使外源DNA導(dǎo)入植物產(chǎn)生發(fā)狀根的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的使外源DNA導(dǎo)入植物產(chǎn)生發(fā)狀根的方法包括如下步驟：
[0007] 1)將外源DNA導(dǎo)入植物外植體，得到轉(zhuǎn)入后外植體；
[0008] 2)將所述轉(zhuǎn)入后外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到帶有發(fā)狀根的外植體；
[0009] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)體系為含有草下麟的培養(yǎng)體系。
[0010] 上述方法中，所述草下麟在所述培養(yǎng)體系中的濃度為1. 5-2. 5mg/L。
[0011] 上述方法中，所述草下麟在所述培養(yǎng)體系中的濃度為2mg/L。
[0012] 上述方法中，所述含有草下麟的培養(yǎng)體系為含有草下麟的1/2MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng) 基。
[0013] 上述方法中，所述含有草下麟的1/2MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為將草下麟、1/2MS液體培 養(yǎng)基和凝固劑混勻得到的培養(yǎng)基。
[0014] 上述方法中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為22-26°C ;
[0015] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的光量子為100-150mol/m2s;
[0016] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的光照周期為16h光照/她黑暗；
[0017] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為23-27天。
[0018] 上述方法中，在步驟1)和2)之間，還包括將所述轉(zhuǎn)入后外植體進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)的步 驟。
[0019] 所述恢復(fù)培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基，采用的培養(yǎng)條件為24°C、光量 子為100-150mol/m2s、光照周期為1化光照/化培養(yǎng)2d。
[0020] 上述方法中，步驟1)中，所述外源DNA通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入植物外植體。
[0021] 上述方法中，所述植物外植體為植物的子葉； 陽02引所述外源DNA為GUS基因；
[0023] 所述外源DNA通過重組菌與所述植物外植體共培養(yǎng)，實現(xiàn)導(dǎo)入植物外植體。
[0024] 上述方法中，所述重組菌為將重組載體pGFPGUS-bar導(dǎo)入農(nóng)桿菌得到的菌； 陽0巧]所述重組載體pGFPGUS-bar為將bar基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體的多克隆位點中得 到的載體。
[0026] 上述方法中，所述農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌；所述發(fā)根農(nóng)桿菌具體為發(fā)根農(nóng)桿菌 K599 ;所述表達(dá)載體為pGFPGUSplus載體。
[0027] 所述重組載體pGFPGUS-bar為將pGFPGUSplus載體的EcoRI和化〇I酶切位點 間的DNA片段替換為bar基因表達(dá)盒，且保持pGFPGUSplus載體的其他序列不變得到的載 體。
[0028] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種使外源DNA導(dǎo)入植物產(chǎn)生發(fā)狀根的培養(yǎng)體系。
[0029] 本發(fā)明提供的使外源DNA導(dǎo)入植物產(chǎn)生發(fā)狀根的培養(yǎng)體系包括含有草下麟的 1/2MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基；所述草下麟在所述含有草下麟的1/2MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度 為 1. 5-2. 5mg/L。
[0030] 上述培養(yǎng)體系中，所述草下麟在所述含有草下麟的1/2MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃 度為2mg/L。
[0031] 本發(fā)明還有一個目的是提供上述方法或上述培養(yǎng)體系的新用途。
[0032] 本發(fā)明提供了上述方法或上述培養(yǎng)體系在提高植物發(fā)狀根的陽性轉(zhuǎn)化率中的應(yīng) 用。
[0033] 上述應(yīng)用中，所述發(fā)狀根的陽性轉(zhuǎn)化率的計算公式=導(dǎo)入外源DNA的發(fā)狀根的個 數(shù)/發(fā)狀根的個數(shù)。
[0034] 上述方法或上述培養(yǎng)體系或上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物；所述雙子葉植 物為大豆。
[0035] 本發(fā)明提供了一種提高植物發(fā)狀根的陽性轉(zhuǎn)化率的方法。本發(fā)明將外源DNA導(dǎo)入 大豆子葉中，然后依次經(jīng)過發(fā)芽培養(yǎng)、恢復(fù)培養(yǎng)和誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)體系為含有草 下麟的培養(yǎng)體系，最后得到轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根。通過試驗證明：本發(fā)明的提高植物發(fā)狀根的陽 性轉(zhuǎn)化率的方法降低了發(fā)狀根中非轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的數(shù)量和比例，提高了轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的比 例，減少了后期的篩選、鑒定工作量，提高工作效率。
【附圖說明】
[0036] 圖1為重組質(zhì)粒pGFPGUS-bar的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0037] 圖2為經(jīng)過草下麟適宜篩選臨界濃度篩選后所獲發(fā)狀根的GUS檢測。其中，CK:非 轉(zhuǎn)化發(fā)狀根的GUS檢測；A:吉林小粒I號巧：吉育47;C:中黃30。
【具體實施方式】
[0038] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 下述實施例中的大豆品種吉林小粒1號：吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院于1979年W栽培品 種平頂四為母本，半野生大豆GD50477為父本，通過種間有性雜交，經(jīng)系統(tǒng)選育而成。1988 年吉林省糧油食品進(jìn)出口公司將該品系命名為吉林小粒1號，1990年經(jīng)吉林省農(nóng)作物品 種審定委員會認(rèn)定推廣。"吉林小粒1號"在國家農(nóng)作物種質(zhì)保存中屯、（依托單位為中國 農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所）長期保存，可免費提供給國內(nèi)從事大豆科研工作的研究人 員使用；"吉林小粒1號"在文獻(xiàn)"吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所主編.中國大豆品種志 (1978-1992)，農(nóng)業(yè)出版社，1993年5月第1版，96-97"中公開過；公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所獲得。
[0041] 下述實施例中的大豆品種吉林47(吉育47):吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院1990年W海交 8403-74為母本，[合豐25X(吉林20X魯豆4號）Fl]Fl為父本進(jìn)行有性雜交，采用系譜 法選育而成。1999年經(jīng)吉林省農(nóng)作物品種審定委員會審定推廣，又名吉育47。"吉林47" 在國家農(nóng)作物種質(zhì)保存中屯、（依托單位為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所）長期保存，可 免費提供給國內(nèi)從事大豆科研工作的研究人員使用；"吉林47"在文獻(xiàn)"國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物 科學(xué)研究所、吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究中屯、主編.中國大豆品種志（1993-2004)，中國農(nóng) 業(yè)出版社，2007年12月第1版，123"中公開過；公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 獲得。
[0042] 下述實施例中的大豆品種中黃30 :中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所W中品661為 母本、中黃14為父本進(jìn)行有性雜交，采用摘芙法選育而成。2006年通過國審，2009年通過 北京市審定，品種權(quán)號為CNA20060446. 5。"中黃30"在國家農(nóng)作物種質(zhì)保存中屯、（依托單 位為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所）長期保存，可免費提供給國內(nèi)從事大豆科研工作的 研究人員使用；"中黃30"在文獻(xiàn)"黃玉鋒，王康寧.大豆中黃30栽培密度研究.寧夏農(nóng)林 科技，2012, 53(04) :8-9"中公開過；公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。
[0043] 下述實施例中的pGFPGUSplus載