用于防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌BS04(Bacillus subtilis BS04)，屬農(nóng)業(yè)病害生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】，其特征在于分離自辣椒根際土壤中，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2014294。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BS04對(duì)辣椒疫病菌、煙草黑脛病菌、棉花黃萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和萵苣灰霉病菌的病原真菌具有抑菌作用，對(duì)原菌抑菌率在40％-80％之間，對(duì)辣椒疫病菌的抑菌率達(dá)80％以上。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BS04從健康植物根際的土壤中分離獲得，無(wú)生態(tài)毒性，安全性高，抑菌譜廣，且培養(yǎng)簡(jiǎn)單，周期短，在植物病害的生物防治中具有十分廣泛的應(yīng)用前景。
CCTCC NO：M2014294
2014.06.26
【專利說(shuō)明】用于防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌，屬農(nóng)業(yè)病害生物防治技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】：
[0002] 辣椒疫病俗稱"死秧病"，由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici)引起，是主要的 辣椒根莖病害之一，在我國(guó)及世界其他國(guó)家的辣椒生產(chǎn)區(qū)都嚴(yán)重發(fā)生，給辣椒生產(chǎn)造成巨 大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 辣椒疫霉菌通常分布在土壤中，致病性變異強(qiáng)，易產(chǎn)生抗藥性。目前，對(duì)于辣椒疫 病的防治大多采用化學(xué)防治，而大量使用化學(xué)藥劑導(dǎo)致了環(huán)境的嚴(yán)重污染，破壞了農(nóng)業(yè)的 生態(tài)平衡，對(duì)人類的身體健康產(chǎn)生了不利影響。同時(shí)，由于辣椒抗疫病品種較少，且多為中 抗或耐病品種，難以有效地控制辣椒疫病。因此，尋找安全有效的防治措施成為控制辣椒疫 病的一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。
[0004] 在采用化學(xué)防治和培育抗病品種難以有效控制辣椒疫病發(fā)生的情況下，生物防治 是目前辣椒疫病防治中重要的途徑。在植物病害的防治上，生物防治具有對(duì)人畜安全，不污 染環(huán)境，不產(chǎn)生抗性，以及由于僅殺傷或抑制防治對(duì)象，能參與生態(tài)環(huán)境調(diào)控，保持生態(tài)平 衡，起到長(zhǎng)效的作用，具有廣闊的發(fā)展前景。
[0005] 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)作為目前應(yīng)用較為普遍的生防菌，具有顯著 的生防能力，又是自然界中廣泛存在的非致病細(xì)菌，且對(duì)人畜無(wú)害、不污染環(huán)境，備受各國(guó) 研究工作者的青睞。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于防治辣椒疫病的枯草 芽孢桿菌，從健康植物根際的土壤中分離獲得，對(duì)辣椒疫病具有較高的防治效果，同時(shí)也對(duì) 棉花黃萎病菌、棉花枯萎病菌、煙草黑脛病菌等多種病原菌具有拮抗作用，無(wú)生態(tài)毒性，安 全性高，抑菌譜廣。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明的一種用于防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌BS04(Bacillus subtilis BS04)，分離自湖北省荊州市辣椒根際土壤中，已于2014年6月26日送交湖北省武漢市武 漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，其保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2014294。
[0009] 本發(fā)明采用平板稀釋法從辣椒根際土壤中分離得到若干株根際細(xì)菌，并測(cè)定了對(duì) 辣椒疫病菌的拮抗作用，篩選得到拮抗作用較強(qiáng)的BS04菌株，根據(jù)其菌落形態(tài)特征、生理 生化特性及16S rDNA的序列測(cè)定，確定BS04菌株為枯草芽孢桿菌。
[0010] 本發(fā)明采用平板對(duì)峙法測(cè)定了 BS04菌株對(duì)辣椒疫病菌、煙草黑脛病菌、棉花黃 萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和萵苣灰霉病菌等病原真菌的拮抗作用，抑菌率在 40% -80%之間，其中對(duì)辣椒疫病菌的抑菌率達(dá)80%以上。
[0011] 本發(fā)明提供了 BS04菌株培養(yǎng)液處理辣椒疫病菌后，辣椒病原菌的菌絲分支增多， 頂端出現(xiàn)畸形，生長(zhǎng)緩慢，還出現(xiàn)了細(xì)胞壁加厚，原生質(zhì)濃縮呈球形或橢圓形的現(xiàn)象，表明 BS04菌株對(duì)辣椒疫病菌的菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。
[0012] 本發(fā)明還通過(guò)對(duì)BS04菌株抗性的篩選，獲得了卡那霉素抗性BS04突變株。將6 葉期的辣椒幼苗在濃度為2X 108cfu/mL的菌懸液中浸根處理，檢測(cè)BS04菌株在辣椒根際 的定殖規(guī)律。結(jié)果表明BS04菌株能夠在辣椒根際定殖，處理后35天內(nèi)定殖密度比較穩(wěn)定。
[0013] 本發(fā)明還測(cè)定了 BS04菌株對(duì)辣椒疫病的應(yīng)用防治效果，對(duì)辣椒疫病的防治效果 可以達(dá)到85. 81%。
[0014] 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心用于專利程序的培養(yǎng)物保藏受理通知書(shū)（收據(jù)）
[0015] 分類命名枯草芽孢桿菌BS04
[0016] 保藏日期2014年6月26日
[0017] 保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)
[0018] 保藏編號(hào) CCTCC NO :M2014294
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有如下有益效果：
[0020] 1、本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BS04從健康植物根際的土壤中分離獲得，無(wú)生態(tài)毒性， 安全性高。
[0021] 2、本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BS04具有較廣的抑菌譜，對(duì)常見(jiàn)的土傳病原真菌（辣椒 疫病菌、煙草黑脛病菌、棉花黃萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌）及萵苣灰霉病菌等 具有較好的抑制效果。
[0022] 3、本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BS04菌株對(duì)辣椒疫病具有較高的防治效果，且培養(yǎng)簡(jiǎn) 單，周期短，在植物病害的生物防治中具有十分廣泛的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為本發(fā)明的BS04菌株的16S rDNA擴(kuò)增電泳圖。
[0024] 圖2為本發(fā)明的BS04菌株的16S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖。
[0025] 圖3為本發(fā)明的BS04菌株處理辣椒疫病菌后的菌絲形態(tài)圖。
[0026] 圖a :無(wú)菌水處理后辣椒疫病菌的菌絲形態(tài)圖；
[0027] 圖b_d :BS04菌株處理后辣椒疫病菌的菌絲形態(tài)圖。
[0028] 圖4為本發(fā)明的BS04菌株對(duì)不同病原真菌的抑制作用圖。
[0029] 圖A :辣椒疫病菌；圖B :煙草黑脛病菌；圖C :棉花黃萎病菌；圖D :棉花枯萎病菌； 圖E :油菜菌核病菌；圖F :萵苣灰霉病菌。

【具體實(shí)施方式】：
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0031] 實(shí)施例1 :枯草芽孢桿菌BS04的分離、篩選與鑒定
[0032] (1)分離與篩選：從湖北武漢、荊州、宜昌和荊門等辣椒種植區(qū)疫病發(fā)生嚴(yán)重的田 地，利用五點(diǎn)采樣法從健康辣椒根際采集土樣。采樣時(shí)鏟去表層5cm的土層，取新鮮土樣 500g，用保鮮袋帶回。
[0033] 稱取土樣10g加入裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中，三角瓶中裝有玻璃珠若干，28°C、 120r/min振蕩30min,靜止后獲得土壤懸液。
[0034] 將土壤懸液稀釋成1(Γ5、10'10'吸取不同稀釋度的土壤懸液100 μ L涂布于NA 培養(yǎng)基上，置于28°C培養(yǎng)48小時(shí)，挑取顏色、形態(tài)等不同的細(xì)菌單菌落并純化、保存。
[0035] 采用平板對(duì)峙法測(cè)定分離到的細(xì)菌對(duì)辣椒疫病菌的抑菌活性。將辣椒疫病菌在 PDA平板上活化，用打孔器在菌落邊緣打取菌塊（直徑5_)，接種到PDA平板中央。培養(yǎng)1 天后，在距離辣椒疫病菌塊2cm處的4個(gè)對(duì)接點(diǎn)接種待測(cè)細(xì)菌，28°C培養(yǎng)，5天后觀察抑菌結(jié) 果，每個(gè)處理重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果表明，BS04菌株對(duì)辣椒疫病菌的拮抗作用較強(qiáng)。
[0036] (2)鑒定：將篩選到的抑菌效果較好的BS04菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列測(cè)定鑒定。
[0037] 形態(tài)學(xué)觀察：將BS04菌株在NA培養(yǎng)基平板上劃線接種，28°C培養(yǎng)1-3天，觀察菌 落特征。菌落初為圓形，邊緣整齊，白色不透明，隆起。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌落邊緣不整齊， 出現(xiàn)褶皺狀；菌體為桿狀，有芽孢。
[0038] 生理生化特征：菌株BS04的生理生化特征見(jiàn)表1。
[0039] 表1 :BS04菌株的生理生化特征
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于防治辣椒疫病的枯草芽孢桿菌BS04(Bacillus subtilis BS04)，其特征在 于分離自辣椒根際土壤中，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，其保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2014294〇
2. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌BS04,其特征在于對(duì)辣椒疫病菌、煙草黑脛病菌、棉 花黃萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌和萵苣灰霉病菌的病原真菌的抑菌應(yīng)用，對(duì)原菌 抑菌率在40% -80%之間，對(duì)辣椒疫病菌的抑菌率達(dá)80%以上。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK104232511SQ201410382695
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】孫文秀, 李偉 申請(qǐng)人:長(zhǎng)江大學(xué)