穿梭質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種穿梭質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該穿梭質(zhì)粒載體，穿梭質(zhì)粒載體能夠在酵母及大腸桿菌中穿梭，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明提供的該穿梭質(zhì)粒載體，與現(xiàn)有技術(shù)相比，該質(zhì)粒載體實現(xiàn)了在酵母、細(xì)菌內(nèi)穿梭，同時具備酵母中同源重組克隆、自我復(fù)制、重組子篩選的能力，以及在細(xì)菌中穩(wěn)定性復(fù)制和保持、便于DNA純化分離操作的特質(zhì)。
【專利說明】穿梭質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種穿梭質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng) 用。 【背景技術(shù)】
[0002] 由于細(xì)胞生命過程涉及到復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，在大多數(shù)情況下受多基因或基因 簇的控制，這些調(diào)控往往與幾百甚至幾千kb的DNA片段遺傳信息密切相關(guān)，為了更好的對 這些基因或基因簇的功能進(jìn)行分析，研究細(xì)胞生命現(xiàn)象中的生物學(xué)規(guī)律和意義，這就需要 新的技術(shù)來選擇性地分離或人工合成改造一些大于20kb的基因組DNA片段，以全面加速基 因組學(xué)和基因組功能區(qū)段的研究進(jìn)程。
[〇〇〇3]目前，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)是實驗室用于從復(fù)雜的基因組中分離得到目的基因 片段的最直接有效的技術(shù)手段。盡管PCR方法應(yīng)用廣泛，但是仍存在一個關(guān)鍵的技術(shù)性瓶 頸：PCR得到的DNA片段的大小一般難以超過20kb。為了克服該技術(shù)瓶頸，在20世紀(jì)90年 代發(fā)展了一項新的技術(shù)，即轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的重組（TAR)克隆方法。TAR克隆的原理是利用酵母體 內(nèi)重組系統(tǒng)對DNA大片段進(jìn)行拼接合成。具體的方法是：將具有同源末端的基因組DNA片 段和線性化的TAR載體共同轉(zhuǎn)染到酵母原生質(zhì)體中，利用酵母細(xì)胞中高效的重組系統(tǒng)，使 載體與基因組DNA的同源序列間進(jìn)行重組，即可產(chǎn)生帶有目的DNA片段的酵母人工染色體 (YACs)克隆。近年來，研究者們不斷對轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的克隆方法進(jìn)行優(yōu)化，同時致力于利用其在 基因組DNA大片段人工合成中的應(yīng)用探索。
[0004] 現(xiàn)在利用最優(yōu)化條件下的重組介導(dǎo)的克隆方法不僅能夠在兩周內(nèi)拼接合成大至 250kb的基因組DNA片段，其精確度與PCR方法相近，并且能夠得到30%的陽性克隆率。更 為引人注目的是，2008年，Venter JC團(tuán)隊用改進(jìn)后的重組介導(dǎo)的克隆方法成功地合成了一 種原核生物（生殖支原體Mycoplasma genitalium)的基因組DNA，將人類人工全合成DNA 大片段的記錄刷新至近600kMb，這標(biāo)志著重組介導(dǎo)的克隆方法在目前的DNA大片段人工合 成【技術(shù)領(lǐng)域】占據(jù)著重要地位。
[0005] 在相關(guān)技術(shù)中，具體的，為了實現(xiàn)在酵母細(xì)胞中的有效重組，利用轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的克隆 方法通常需要特殊的載體，這種載體的構(gòu)成核心元件一般包括酵母的中心粒序列（yeast centromere sequence，CEN)、篩選標(biāo)記（如HIS3、URA3、LUE2等）、維持重組質(zhì)粒在酵母中自 主復(fù)制和穩(wěn)定遺傳的復(fù)制起始位點(diǎn)（autonomously replicating sequence，ARS)以及與目 的片段兩端序列同源的同源臂序列。但是，由于酵母人工染色體質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中不穩(wěn)定， 同時通過瓊脂糖凝膠分離純化獲得的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和數(shù)量均達(dá)不到后期分子生物學(xué)、細(xì) 胞學(xué)實驗的要求；因此，提供一種能夠在酵母和細(xì)菌之間穿梭，且同時具備在酵母中重組克 隆、自我復(fù)制、重組子篩選，且還能夠在細(xì)菌穩(wěn)定的復(fù)制和保存，便于DNA純化與分離的穿 梭質(zhì)粒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的一個技術(shù)問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種穿梭質(zhì)粒載體，以解決上述的技術(shù)問題。本發(fā)明的另 一個目的在與提供上述穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。
[0007] 在本發(fā)明的實施例中提供了穿梭質(zhì)粒載體，所述穿梭質(zhì)粒能夠在酵母及大腸桿菌 中穿梭，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。該穿梭質(zhì)粒載體通過對現(xiàn)有的載體進(jìn)行改造， 其將核心元件（酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3)加入到具備DNA大片段容納性的細(xì) 菌人工染色體（bacteria artificial chromosomes, BAC)中，進(jìn)而獲得穿梭質(zhì)粒載體。與 現(xiàn)有技術(shù)相比，該質(zhì)粒載體實現(xiàn)了在酵母、細(xì)菌內(nèi)穿梭，同時具備酵母中同源重組克隆、自 我復(fù)制、重組子篩選的能力，以及在細(xì)菌中穩(wěn)定性復(fù)制和保持、便于DNA純化分離操作的特 質(zhì)。另外，其用于合成改造的DNA長片段序列信息不受限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的限制；此外，其 可對經(jīng)人工改造設(shè)計的DNA基因組全長進(jìn)行拼接合成，合成產(chǎn)物可用于病毒載體疫苗和原 核生物能源工程的研究利用，并可主要應(yīng)用于DNA大片段（>30kb)的人工合成拼接、大DNA 病毒全基因組人工合成及反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建等領(lǐng)域，其克服了現(xiàn)有技術(shù)中的載體，由于酵 母人工染色體質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中不穩(wěn)定，同時通過瓊脂糖凝膠分離純化獲得的質(zhì)粒DNA的 質(zhì)量和數(shù)量均達(dá)不到后期分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)實驗的要求，以及現(xiàn)有技術(shù)中的載體自身不 能在酵母和細(xì)菌中穿梭，并且不能同時具備酵母中同源重組克隆、自我復(fù)制、重組子篩選的 能力及在細(xì)菌中穩(wěn)定性復(fù)制和保持等技術(shù)問題。
[0008] 可選的，所述穿梭質(zhì)粒為將酵母質(zhì)粒元件插入到細(xì)菌人工染色體組合而成；其中： 所述酵母質(zhì)粒元件包括位于4555?5073的復(fù)制起始位點(diǎn)ARS4和酵母中心粒CEN6、位于 5451?6300的編碼營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因 HIS3及其啟動子序列；所述細(xì)菌人工染色體包括 F因子復(fù)制子、質(zhì)粒分配因子partA/B/C、高拷貝復(fù)制起點(diǎn)oriV及細(xì)菌篩選標(biāo)記氯霉素抗性 基因 chi。
[0009] 上述穿梭質(zhì)粒載體在DNA大片段的人工合成拼接、DNA病毒全基因組人工合成及 反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[〇〇1〇] 一種上述穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0011] 1)、以黏粒PRS313載體為模板，通過設(shè)定引物進(jìn)行PCR，獲得核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示的HIS3篩選元件；2)、合成CEN6-ARSH4酵母復(fù)制序列，并在其兩端分別引入 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamH I和EcoR I后連接到pUC19質(zhì)粒中；3)、將含有CEN6-ARSH4酵 母復(fù)制序列的PUC19質(zhì)粒利用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切處理，得到核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示的CEN6-ARSH4酵母復(fù)制元件；4)、以所述HIS3篩選元件和所述CEN6-ARSH4 酵母復(fù)制元件作為模板，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，得到酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3 ; 5)、將環(huán)化pCCIBAC質(zhì)粒利用內(nèi)切酶Afe I進(jìn)行酶切處理，得到線性化的pCCIBAC質(zhì)粒； 在所述酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3的兩端引入與所述線性化的pCCIBAC質(zhì)粒末 端相對應(yīng)的同源序列，得到末端延長的酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3 ;6)、將所述線 性化的pCCIBAC質(zhì)粒和所述末端延長的酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3共同轉(zhuǎn)化導(dǎo) 入到酵母菌VL6-48的原生質(zhì)體中，通過酵母自身的同源重組系統(tǒng)，使酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3片段插入到pCCIBAC質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)Afe I處，得到穿梭質(zhì)粒載體。
[0012] 可選的，在步驟1)中：所用的引物為YF1和YR1，其核苷酸序列依次如SEQ ID N0.4 和 SEQ ID NO. 5 所示。
[0013] 可選的，在步驟4)中，具體包括：
[0014] 以所述HIS3篩選元件和所述CEN6-ARSH4酵母復(fù)制元件作為模板進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0015] 以所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以核苷酸序列如SEQ ID N0. 6所示的特異性引物YF2 以及核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示引物YR1作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3。
[0016] 可選的，在步驟5)中：所述在所述酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3的兩端引 入與所述線性化的PCC1BAC質(zhì)粒末端相對應(yīng)的同源序列，得到末端延長的酵母復(fù)制篩選元 件CEN6-ARSH4-HIS3的步驟中，具體包括：
[0017] 以所述酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3為模板，以序列分別如SEQ ID N0. 7、 SEQ ID NO. 8所示的TAR-F1和TAR-R1為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到末端延長的酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3。
[0018] 可選的，在步驟3)中：所述雙酶切處理的反應(yīng)體系包括：10XK buffer5y l、BamH 12.5以13(：〇1?12.5 4 1、口阢19質(zhì)粒5 4 1、(1(1!12035以1;反應(yīng)溫度為371：、反應(yīng)時間為1小 時。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 為了更清楚地說明本發(fā)明【具體實施方式】或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體 實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的 附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前 提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。
[0020] 圖1為本發(fā)明實施例一提供的穿梭質(zhì)粒載體的物理圖譜；
[0021] 圖2為本發(fā)明實施例二提供的穿梭質(zhì)粒載體構(gòu)建方法的流程圖；
[0022] 圖3為本發(fā)明實施例的質(zhì)粒載體（pGF)的BamH I酶切鑒定（左）及 CEN6-ARSH4-HIS3元件PCR鑒定電泳圖（右）；
[0023] 圖4為本發(fā)明實施例的穿梭質(zhì)粒載體（pGF)進(jìn)行DNA長片段合成酶切電泳鑒定 圖。 【具體實施方式】
[0024] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行 清楚、完整的描述，基于本發(fā)明中的【具體實施方式】，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性 勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬于本發(fā)明所保護(hù)的范圍。
[0025] 在本發(fā)明的實施例中提供了穿梭質(zhì)粒載體，所述穿梭質(zhì)粒能夠在酵母及大腸桿菌 中穿梭，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示（其物理圖譜請參考圖1)。具體的，所述穿梭質(zhì) 粒為將酵母質(zhì)粒元件插入到細(xì)菌人工染色體組合而成；其中：所述酵母質(zhì)粒元件包括位于 4555?5073的復(fù)制起始位點(diǎn)ARS4和酵母中心粒CEN6、位于5451?6300的編碼營養(yǎng)缺陷 型標(biāo)記基因 HIS3及其啟動子序列；所述細(xì)菌人工染色體包括F因子復(fù)制子、質(zhì)粒分配因子 partA/B/C、高拷貝復(fù)制起點(diǎn)oriV及細(xì)菌篩選標(biāo)記氯霉素抗性基因 chi。
[0026] 該穿梭質(zhì)粒載體通過對現(xiàn)有的載體進(jìn)行改造，其將核心元件（如：酵母復(fù)制篩 選元件CEN6-ARSH4-HIS3)加入到具備DNA大片段容納性的細(xì)菌人工染色體（bacteria artificial chromosomes, BAC)中，進(jìn)而獲得，穿梭質(zhì)粒載體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該質(zhì)粒載體 實現(xiàn)了在酵母、細(xì)菌內(nèi)穿梭，同時具備酵母中同源重組克隆、自我復(fù)制、重組子篩選的能力， 以及在細(xì)菌中穩(wěn)定性復(fù)制和保持、便于DNA純化分離操作的特質(zhì)。另外，其用于合成改造的 DNA長片段序列信息不受限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的限制；此外，其可對經(jīng)人工改造設(shè)計的DNA基 因組全長進(jìn)行拼接合成，合成產(chǎn)物可用于病毒載體疫苗和原核生物能源工程的研究利用， 并可主要應(yīng)用于DNA大片段（>30kb)的人工合成拼接、大DNA病毒全基因組人工合成及反 向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建等領(lǐng)域，其克服了現(xiàn)有技術(shù)中的載體，由于酵母人工染色體質(zhì)粒在酵母細(xì) 胞中不穩(wěn)定，同時通過瓊脂糖凝膠分離純化獲得的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和數(shù)量均達(dá)不到后期分 子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)實驗的要求，以及現(xiàn)有技術(shù)中的載體自身不能在酵母和細(xì)菌中穿梭，并且 不能同時具備酵母中同源重組克隆、自我復(fù)制、重組子篩選的能力及在細(xì)菌中穩(wěn)定性復(fù)制 和保持等技術(shù)問題。
[0027] 為了使得本發(fā)明上述實施例的穿梭質(zhì)粒載體得到更好的應(yīng)用，更加有效應(yīng)用到生 物【技術(shù)領(lǐng)域】中，本發(fā)明還在上述內(nèi)容的基礎(chǔ)之上提供了實施例一，實施例一給出了上述穿 梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，現(xiàn)做詳細(xì)的闡述和解釋，請參考圖2。
[0028] 實施例一
[0029] 本發(fā)明實施例提供的這種穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，請參考圖2,包括以下步驟：
[0030] 步驟101 :以黏粒pRS313載體為模板，通過設(shè)定引物進(jìn)行PCR，獲得核苷酸序列如 SEQ ID N0. 2所示的HI S3篩選元件；
[0031] 在步驟101中，依據(jù)GenBank(U03439)上的核苷酸序列信息結(jié)合黏粒PRS313的信 息，設(shè)定特定的引物，并且通過PCR操作獲得HIS3篩選元件；其序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0032] 步驟102 :合成CEN6-ARSH4酵母復(fù)制序列，并在其兩端分別引入限制性內(nèi)切酶位 點(diǎn)BamH I和EcoR I后連接到pUC19質(zhì)粒中；
[0033] 步驟103 :將含有CEN6-ARSH4酵母復(fù)制序列的pUC19質(zhì)粒利用BamH I和EcoR I 進(jìn)行雙酶切處理，得到核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的CEN6-ARSH4酵母復(fù)制元件；
[0034] 通過步驟102和步驟103,即可實現(xiàn)CEN6-ARSH4酵母復(fù)制元件的獲取，通過人工合 成CEN6-ARSH4酵母復(fù)制序列，并在其兩端引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamH I和EcoR I;然后 再連接到PUC19質(zhì)粒中將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，得到核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示 的CEN6-ARSH4酵母復(fù)制元件。
[0035] 步驟104 :以所述HIS3篩選元件和所述CEN6-ARSH4酵母復(fù)制元件作為模板，進(jìn)行 兩輪PCR擴(kuò)增，得到酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3 ;
[0036] 步驟104實現(xiàn)了酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3的構(gòu)建，具體的，通過回收 PCR擴(kuò)增的目的條帶，再將其載入pTA2載體（購自Τ0Υ0Β0公司）中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α， 挑單克隆子進(jìn)行測序，進(jìn)而驗證測序結(jié)果與所設(shè)計序列的吻合性。
[0037] 步驟105 :將環(huán)化pCCIBAC質(zhì)粒利用內(nèi)切酶Afe I進(jìn)行酶切處理，得到線性 化的PCC1BAC質(zhì)粒；在所述酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3的兩端引入與所述 線性化的pCCIBAC質(zhì)粒末端相對應(yīng)的同源序列，得到末端延長的酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3 ；
[0038] 將環(huán)化的pCCIBAC質(zhì)粒利用內(nèi)切酶Afe I進(jìn)行酶切處理，得到線性化的pCCIBAC 質(zhì)粒，具體的，單酶切反應(yīng)的過程中，其總體積為20μ 1 :具體包括：10X0酶切緩沖液2μ 1 ; Afe Ι2μ 1 ;質(zhì)粒（ρ(Χ1ΒΑ(Μ)2μ 1 ;(ΜΗ2014μ 1，37°C 2h ;65°C 20min。一次同時做 20 個反 應(yīng)，共得400 μ 1酶切產(chǎn)物；酶切產(chǎn)物用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分離驗證，將驗證正確的目的 條帶凝膠切下后用OMEGA回收試劑盒對其進(jìn)行回收濃縮。另外，通過在酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3的兩端引入與所述線性化的pCCIBAC質(zhì)粒末端相對應(yīng)的同源序列，得到 末端延長的酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3,進(jìn)而便于后續(xù)重組拼接操作。
[0039] 步驟106 :將所述線性化的pCCIBAC質(zhì)粒和所述末端延長的酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3共同轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到酵母菌VL6-48的原生質(zhì)體中，通過酵母自身的同源重組 系統(tǒng)，使酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3片段插入到pCCIBAC質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)Afe I 處，得到穿梭質(zhì)粒載體。
[0040] 為了使得本發(fā)明上述實施例的構(gòu)建方法得到更好的應(yīng)用，更加有效應(yīng)用該穿梭質(zhì) 粒載體的構(gòu)建中，本發(fā)明還在上述實施例的基礎(chǔ)之上提供了實施例二，實施例二給出了上 述實施例的構(gòu)建方法進(jìn)一步細(xì)化或者增加，現(xiàn)做詳細(xì)的闡述和解釋：
[0041] 實施例二
[0042] 在本實施例中，穿梭質(zhì)粒載體的制備方法包括以下步驟：
[0043] S1 :與上述步驟101 -致，具體的，所用的引物為YF1和YR1，其核苷酸序列依次如 SEQ ID N0. 4 和 SEQ ID N0. 5 所示。
[0044] 具體的，引物YF1和YR1 (其中上游引物YF1前23bp與酵母復(fù)制元件CEN6-ARSH4 末端序列同源，如下粗體下劃線部分所示）。
[0045] YF1:GTTACAGGCAAGCGATCCGTCCGGAAACCATTATTATCATGACATTAACCT ；
[0046] YR1:TCCCCCGGGACGCATCTGTGCGGTATTTC。
[0047] PCR的具體條件為：
[0048] 反應(yīng)總體積為 25 μ 1 :包括 10XK0D-PLUS 緩沖液 2. 5 μ 1 ;2mM dNTPs2. 5 μ 1 ;25mM MgS041.2y 1 ;模板 pRS3131y 1 ;引物 YFlly 1 ;引物 YRlly 1 ;K0D-PLUS 聚合酶 0·5μ 1 ; ddH2015. 3 μ 1 ;反應(yīng)程序為：94 °C 2min ;94 °C 15sec，59 °C 25sec，68 °C 2min，30 循環(huán)； 68°C 5min延伸；4°C 5min ;PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳結(jié)果在理 論值大小位置出現(xiàn)了單一的特異性條帶，將含目的條帶的凝膠切下，用OMEGA回收試劑盒 對其進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果與已報告的序列相吻合。
[0049] S2 :與上述步驟102 -致。
[0050] S3 :與上述步驟103-致。具體的，所述雙酶切處理的反應(yīng)體系包括：10XK buffer5y l、BamH Ι2· 5μ l、EcoR Ι2· 5μ l、pUC19質(zhì)粒5μ 1、(ΜΗ2035 μ 1 ;反應(yīng)溫度為 37°C、 反應(yīng)時間為1小時。
[0051] S4 :以所述HIS3篩選元件和所述CEN6-ARSH4酵母復(fù)制元件作為模板進(jìn)行第一輪 PCR擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0052] 具體的，在第一輪PCR擴(kuò)增的過程中，反應(yīng)總體積為25μ 1 :包括10XK0D-PLUS 緩沖液 2. 5 μ 1 ;2mM dNTPs2. 5 μ 1 ;25mM MgS041. 2 μ 1 ;模板 HIS1. 5 μ 1 ;模板 CEN6-ARSH4L 5 μ 1 ;K0D-PLUS 聚合酶 0· 5 μ 1 ;ddH2015. 3 μ 1 ;反應(yīng)程序為：94 °C 2min ; 94°C 15sec，55°C 25sec，68°C 2min，35 循環(huán)；68°C 5min 延伸；4°C 5min。
[0053] S5 :以所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的特異性引物 YF2以及核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示引物YR1作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到酵母復(fù)制篩選元 件 CEN6-ARSH4-HIS3 ;
[0054] 具體的，取第一擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用引物YF2和YR1對酵母復(fù)制篩選原件 CEN6-ARSH4-HIS3進(jìn)行特異擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為25 μ 1 :10XK0D-PLUS緩沖液2. 5 μ 1 ;2mM dNTPs2. 5 μ 1 ;25mM MgS041. 2 μ 1 ;模板 1 μ 1 ;引物 YF21 μ 1 ;引物 YR11 μ 1 ;K0D-PLUS 聚合 酶0· 5μ 1 ;ddH2015. 3μ 1 ;反應(yīng)程序為：94。。2min ;94。。15sec，58。。25sec，68。。2min，28循 環(huán)；68°C 5min 延伸；4°C 5min。
[0055] S6 :將環(huán)化pCCIBAC質(zhì)粒利用內(nèi)切酶Afe I進(jìn)行酶切處理，得到線性化的pCCIBAC 質(zhì)粒；在所述酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3的兩端引入與所述線性化的pCCIBAC質(zhì) 粒末端相對應(yīng)的同源序列，得到末端延長的酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3 ;
[0056] 具體的，在S6中，所述在所述酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3的兩端引入與 所述線性化的pCCIBAC質(zhì)粒末端相對應(yīng)的同源序列，得到末端延長的酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3的步驟中，具體包括：
[0057] 以所述酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3為模板，以序列分別如SEQ ID N0. 7、 SEQ ID NO. 8所示的TAR-F1和TAR-R1為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到末端延長的酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3。
[0058] 在擴(kuò)增的過程中，反應(yīng)的總體積為25ul :包括10 X K0D-PLUS緩沖液2. 5 μ 1 ; 2mM dNTPs2. 5 μ 1 ;25mM MgS041. 2 μ 1 ;模板 1 μ 1 ;引物 TAR-F11 μ 1 ;引物 TAR-R11 μ 1 ; K0D-PLUS 聚合酶 0· 5μ 1 ;ddH2015. 3μ 1 ;反應(yīng)程序為：94°C 2min ;94°C 15sec，58°C 25sec， 68°C 2min，28循環(huán)；68°C 5min延伸；4°C 5min。一次同時做6個反應(yīng)，共得150μ 1。
[0059] 另外,在利用Afe I進(jìn)行酶切處理的過程中，反應(yīng)總體積為20μ 1 :10Χ0酶切緩沖 液 2μ 1 ;Afe Ι2μ 1 ;質(zhì)粒（ρ(Χ1ΒΑ01)2μ 1 ;(ΜΗ2014μ 1，37°C 2h ;65°C 20min。一次同時 做20個反應(yīng)，共得400 μ 1。
[0060] S7 :將所述線性化的pCCIBAC質(zhì)粒和所述末端延長的酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3共同轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到酵母菌VL6-48的原生質(zhì)體中，通過酵母自身的同源重組 系統(tǒng)，使酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3片段插入到pCCIBAC質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)Afe I 處，得到穿梭質(zhì)粒載體；
[0061] 步驟S7為用酵母轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的重組克隆拼接法構(gòu)建BAC穿梭質(zhì)粒載體pGF的操作。 具體的，其包括如下步驟：
[0062] A、酵母原生質(zhì)粒的制備
[0063] 挑新制備的VL6-48單克?。ㄖ睆?-3mm)至50ml YPA液體培養(yǎng)基中，30°C，250rpm 過夜培養(yǎng)（15h);用50ml離心管收集菌體，1600g，4°C，3min，棄上清；用50ml滅菌的ddH20 重懸細(xì)胞，1600g，4°C，3min棄上清；用20mllM SORBITOL溶液重懸細(xì)胞，4°C放置>4h ;用 1600g，4°C，3min，棄上清，收集菌體。
[0064] B、轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的同源重組拼接
[0065] 用20ml預(yù)冷的SPE solution重懸細(xì)胞，加入40 μ 1破壁酶溶液，40 μ 114πιΜβ-巰 基乙醇，混勻，50rpm，30°C，40min (此時在37°C培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱S0RB-HIS平板）；在重懸液中 加入 1MS0RBIT0L 溶液至 45ml，輕搖混勻，1600g，4°C，5min ;棄上清，加入 45ml 1M SORBITOL 溶液，輕搖混勻，1600g，4°C，5min ;棄上清，加入2ml STC溶液，輕輕重懸沉淀；取200μ 1 重懸液，室溫靜置l〇min ;加入彡40 μ 1轉(zhuǎn)化DNA(所要拼接的線性DNA片段），室溫靜置 lOmin ;加入lml PEG/CaC12溶液，勿大力吹打，室溫靜置20min ;1500g，4°C，8min ;棄上清， 加入800 μ 1 SOS溶液重懸，30°C，恒溫孵育30min ;在孵育的30min里，融化分裝上層瓊脂 糖培養(yǎng)基至50ml離心管（12ml/管），80°C水浴保存?zhèn)溆茫淮盅b的S0RB-T0P-HIS上層培 養(yǎng)基充分冷卻（但不能凝固），加入孵育產(chǎn)物，充分混勻后平鋪至預(yù)熱的S0RB-HIS平板上； 30°C，恒溫孵育3-4天，通過HIS氨基酸營養(yǎng)缺陷篩選，出現(xiàn)酵母單克隆。
[0066] C、用牙簽挑選12個酵母單克隆至SD/-HIS缺陷培養(yǎng)基上，30°C，恒溫孵育3-4天， 再次篩選。從中選取長勢良好的菌斑轉(zhuǎn)入5ml SD/-HIS液體缺陷培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-24h，用 TIANGEN酵母質(zhì)粒小提試劑盒小量提取質(zhì)粒。
[0067] D、以上述酵母小提重組質(zhì)粒為模板，用引物TAR-F1和TAR-R1對CEN6-ARSH4-HIS3 片段進(jìn)行特異性檢測。將經(jīng)〇. 8 %瓊脂糖凝膠電泳驗證正確后的重組質(zhì)粒載體pGF熱擊轉(zhuǎn) 化大腸桿菌EPI300。
[0068] E、挑取12個單克隆，轉(zhuǎn)入5ml LBA12. 5μ g/ml氯霉素）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 16-22h，用OMEGA試劑盒提取質(zhì)粒，通過BamH I進(jìn)行單酶切驗證（如附圖3)。將鑒定結(jié)果 與理論符合的克隆子進(jìn)行測序，測序結(jié)果與所設(shè)計序列吻合，如序列SEQ ID No. 1所示。
[0069] 另外，本實施例還提供了利用上述的穿梭質(zhì)粒載體（pGF)進(jìn)行DNA長片段噬藻體 PP(PartABC)的合成拼接的具體操作，包括如下步驟：
[0070] 1、待拼接片段及拼接用BAC穿梭質(zhì)粒載體pGF的準(zhǔn)備；
[0071] 請參考圖1，以噬藻體PP的基因組中約31kb片段為待拼接模板，將之分為 PratA(12kb)、PartB(12kb)及 PartC(7kb)三個片段。將 PartA(12kb)分為長 3kb 的片段共 4個，PartB (12kb)分為長3kb的片段共4個，PartC (7kb)分為長約3. 5kb的片段共2個，設(shè) 計引物從PP基因組中PCR獲得這些待拼接片段；以本發(fā)明實施例所述的穿梭質(zhì)粒載體pGF 為模板，設(shè)計引物XAF及XAR，利用PCR的方法獲得具有同源序列末端的線性化載體pGF ;
[0072] 具體的，在PCR的過程中，反應(yīng)總體積為25μ 1 :10XK0D-PLUS緩沖液2. 5μ 1 ; 2mM dNTPs2. 5 μ 1 ;25mM MgS041. 2 μ 1 ;模板 pRS3131 μ 1 ;引物 XAF1 μ 1 ;引物 XAR1 μ 1 ; K0D-PLUS 聚合酶 0· 5μ 1 ;ddH2015. 3μ 1 ;反應(yīng)程序為：94°C 2min ;94°C 15sec，59°C 25sec， 68°C 2min，30循環(huán)；68°C 5min延伸；4°C 5min。利用上述同樣的方法拼接PartB及PartC。
[0073] 2、酵母轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的同源重組拼接如實施例一中S6部分所述，其中片段及載體的 摩爾濃度比控制在1 :1到2 :1。
[0074] 3、用牙簽挑選12個酵母單克隆至SD/-HIS缺陷培養(yǎng)基上，30°C，恒溫孵育3-4天， 再次篩選。從中選取長勢良好的菌斑轉(zhuǎn)入5ml SD/-HIS液體缺陷培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-24h，用 TIANGEN酵母質(zhì)粒小提試劑盒小量提取質(zhì)粒。
[0075] 4、以上述酵母小提重組質(zhì)粒為模板，用引物對相應(yīng)片段進(jìn)行特異性檢測。反應(yīng)總 體積和反應(yīng)程序同前S6所述。將經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳驗證正確后的插入PartA、PartB 或PartC的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌EPI300 ;
[0076] 5、挑取12個單克隆，轉(zhuǎn)入5ml LBA12. 5μ g/ml氯霉素）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 16-22h，用OMEGA試劑盒提取質(zhì)粒。將克隆子進(jìn)行測序，保留拼接中間體PartA、PartB及 PartC測序結(jié)果與所設(shè)計序列吻合的重組菌；
[0077] 6、將轉(zhuǎn)化于大腸桿菌EPI300中鑒定正確的拼接中間體PartA、PartB及PartC以 Not I酶切釋放出具有同源末端序列的三個片段。單酶切反應(yīng)總體積為20μ1:包括10XH 酶切緩沖液 2μ 1 ;Not Ι2μ 1 ;質(zhì)粒 2μ 1 ;(ΜΗ2014μ 1，37°C 2h ;65°C 20min。一次同時做 20 個反應(yīng)，共得400 μ 1。同時，以本發(fā)明所述的BAC穿梭質(zhì)粒載體pGF為模板，利用正向引物 (XAF)與反向引物XAR以PCR方法獲得具有同源末端序列的線性化載體pGF，PCR方法如上 所述。
[0078] 7、再次進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的同源重組拼接如實施例一中S6部分所述，其中片段 及載體的摩爾濃度比控制在1 :1到2 :1。
[0079] 8、用牙簽挑選12個酵母單克隆至SD/-HIS缺陷培養(yǎng)基上，30°C，恒溫孵育3-4天， 再次篩選。從中選取長勢良好的菌斑轉(zhuǎn)入5ml SD/-HIS液體缺陷培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-24h，用 TIANGEN酵母質(zhì)粒小提試劑盒小量提取質(zhì)粒。
[0080] 9、以上述酵母小提重組質(zhì)粒為模板，用引物對插入片段進(jìn)行特異性檢測。反應(yīng)總 體積和反應(yīng)程序同前2. 2所述。將經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳驗證正確后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化 大腸桿菌EPI300。
[0081] 10、挑取12個單克隆，轉(zhuǎn)入5ml LBA12. 5μ g/ml氯霉素）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 16-22h，用OMEGA試劑盒提取質(zhì)粒，通過EcoR I或Not I進(jìn)行單酶切驗證（如附圖4)。將 鑒定結(jié)果與理論符合的克隆子進(jìn)行測序，測序結(jié)果與所設(shè)計序列吻合。
[0082] 綜上，本發(fā)明實施例提供的這種穿梭質(zhì)粒載體，其可以實現(xiàn)DNA大片段（>30kb)拼 接，同時具備在酵母中重組克隆、自我復(fù)制、重組子篩選的能力，以及在細(xì)菌中穩(wěn)定復(fù)制和 保持、便于DNA純化分離操作的特質(zhì)；另外，拼接合成的目的DNA片段長度可遠(yuǎn)大于一般聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)合成的上限；合成改造的DNA大片段序列信息不受限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 的限制。
[0083] 另外，本發(fā)明實施例提供的這種穿梭質(zhì)粒載體在DNA大片段的人工合成拼接、DNA 病毒全基因組人工合成及反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建領(lǐng)域中的應(yīng)用也理應(yīng)屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[〇〇84] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0001] 序列表 PA1401436CD < 110> 中國科學(xué)院武漢病毒研究所 < 120> 穿梭質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用 <160 8 <210 1 <211> 10112 <212> D^A <2丨3> 人工序列 <400> 1
[0002]
[0003]
[0004]
[0005]
[0006]
【權(quán)利要求】
1. 一種穿梭質(zhì)粒載體，其特征在于，所述穿梭質(zhì)粒載體能夠在酵母及大腸桿菌中穿梭， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的穿梭質(zhì)粒載體，其特征在于，所述穿梭質(zhì)粒為將酵母質(zhì)粒元 件插入到細(xì)菌人工染色體組合而成； 其中，所述酵母質(zhì)粒元件包括位于4555?5073的復(fù)制起始位點(diǎn)ARS4和酵母中心粒 CEN6、位于5451?6300的編碼營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因 HIS3及其啟動子序列； 所述細(xì)菌人工染色體包括F因子復(fù)制子、質(zhì)粒分配因子partA/B/C、高拷貝復(fù)制起點(diǎn) oriV及細(xì)菌篩選標(biāo)記氯霉素抗性基因 chi。
3. 權(quán)利要求2所述的穿梭質(zhì)粒載體在DNA大片段的人工合成拼接、DNA病毒全基因組 人工合成及反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建領(lǐng)域中的應(yīng)用。
4. 一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 、以黏粒PRS313載體為模板，通過設(shè)定引物進(jìn)行PCR，獲得核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的HI S3篩選元件； 2) 、合成CEN6-ARSH4酵母復(fù)制序列，并在其兩端分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamH I和 EcoR I后連接到pUC19質(zhì)粒中； 3) 、將含有CEN6-ARSH4酵母復(fù)制序列的pUC19質(zhì)粒利用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切 處理，得到核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的CEN6-ARSH4酵母復(fù)制元件； 4) 、以所述HIS3篩選元件和所述CEN6-ARSH4酵母復(fù)制元件作為模板，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò) 增，得到酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3 ; 5) 、將環(huán)化pCCIBAC質(zhì)粒利用內(nèi)切酶Afe I進(jìn)行酶切處理，得到線性化的pCCIBAC質(zhì)粒； 在所述酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3的兩端引入與所述線性化的pCCIBAC質(zhì)粒末端 相對應(yīng)的同源序列，得到末端延長的酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3 ; 6) 、將所述線性化的pCCIBAC質(zhì)粒和所述末端延長的酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3共同轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到酵母菌VL6-48的原生質(zhì)體中，通過酵母自身的同源重組 系統(tǒng)，使酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3片段插入到pCCIBAC質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)Afe I 處，得到穿梭質(zhì)粒載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟1)中：所用 的引物為YF1和YR1，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟4)中，具體包 括： 以所述HIS3篩選元件和所述CEN6-ARSH4酵母復(fù)制元件作為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò) 增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物； 以所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的特異性引物YF2以 及核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示引物YR1作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟5)中：所述 在所述酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3的兩端引入與所述線性化的pCCIBAC質(zhì)粒末端 相對應(yīng)的同源序列，得到末端延長的酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3的步驟中，具體 包括： 以所述酵母復(fù)制篩選元件CEN6-ARSH4-HIS3為模板，以序列分別如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8所示的TAR-F1和TAR-R1為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到末端延長的酵母復(fù)制篩選元件 CEN6-ARSH4-HIS3。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟3)中： 所述雙酶切處理的反應(yīng)體系包括：l〇XK buffer5y 1、BamH 12. 5μ 1、EcoR 12. 5μ 1、 pUC19質(zhì)粒5μ 1、(ΜΗ2035 μ 1 ;反應(yīng)溫度為37°C、反應(yīng)時間為1小時。
【文檔編號】C12N15/81GK104087610SQ201410351890
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】肖庚富, 侯政, 周拯, 王宗林, 王薇 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所