長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株及其制備方法和應(yīng)用，其解決了現(xiàn)有長(zhǎng)鏈二元酸菌種改造效果不顯著的技術(shù)問(wèn)題，其分類命名為假絲酵母菌(Candida?sp.)TDTC016，其保藏編號(hào)為：CGMCC?No.8928。本發(fā)明可廣泛用于長(zhǎng)鏈二元酸的制備領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種菌種及其制備方法和應(yīng)用，具體說(shuō)是一種長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]長(zhǎng)鏈二元酸是重要化工原料，具有極其廣泛的用途，能夠合成香料、特種尼龍、高級(jí)潤(rùn)滑油等一系列高附加值的化學(xué)品。長(zhǎng)鏈二元酸可應(yīng)用在軍用領(lǐng)域、航空航天器的涂層、管路、汽車的表面涂層及油管等；在民用領(lǐng)域，可應(yīng)用于汽車、日化香料、工程塑料、尼龍行業(yè)等十多個(gè)高新科技行業(yè)，可開(kāi)發(fā)出更多的下游產(chǎn)業(yè)，形成新興的產(chǎn)業(yè)鏈。
[0003]以往，長(zhǎng)鏈二元酸采用化學(xué)合成法生產(chǎn)，其專利技術(shù)被國(guó)外所擁有?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸，不僅產(chǎn)品種類單一，且合成工藝復(fù)雜、成本高、污染大。我國(guó)是世界上唯一能夠采用微生物發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)多種長(zhǎng)鏈二元酸大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的國(guó)家。此前，我國(guó)二元酸生產(chǎn)菌種的改良均是通過(guò)不同方式誘變等傳統(tǒng)育方法實(shí)現(xiàn)的。傳統(tǒng)育種方法具有很大隨機(jī)性，篩選復(fù)雜。通過(guò)傳統(tǒng)育種的方法已經(jīng)很難進(jìn)一步提高菌株的性能。當(dāng)前長(zhǎng)鏈二元酸工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中仍有許多瓶頸問(wèn)題，如底物轉(zhuǎn)化率有待提高、生產(chǎn)能耗非常巨大等等。
[0004]代謝工程技術(shù)可以在基因水平上有針對(duì)性的進(jìn)行菌種分子改造，獲得性能更加優(yōu)良的新菌株。如圖1、圖2所示，二元酸代謝途徑主要包括ω-氧化途徑和β-氧化途徑，其中前者為二元酸合成途徑，后者涉及二元酸降解途徑。代謝工程的目的是通過(guò)分子改造手段來(lái)提高ω-氧化活性，并降低β-氧化活性。國(guó)際上，Henkel公司(后來(lái)的Cognis公司)有專利報(bào)道(US005254466A)，用基因敲除方式來(lái)優(yōu)化二元酸生產(chǎn)菌株，依次將4個(gè)POX基因敲除，達(dá)到完全阻斷氧化，使底物轉(zhuǎn)化率提高為100%。在此基礎(chǔ)上，該公司進(jìn)一步通過(guò)代謝工程手段共表達(dá)CYP單加氧酶和還原酶，以達(dá)到增強(qiáng)ω-氧化的目的，產(chǎn)量提高30% (World Patent W0/91/06660)。
[0005]但是利用該菌株進(jìn)行批式發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，其工藝仍無(wú)法與當(dāng)時(shí)其他二元酸生產(chǎn)工藝競(jìng)爭(zhēng)，而最終沒(méi)有進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。Henkel公司對(duì)菌種進(jìn)行分子改造所使用的篩選標(biāo)記為尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型。Henkel公司發(fā)明專利的缺點(diǎn)為:1、出發(fā)菌株不是工業(yè)化生產(chǎn)所用的高產(chǎn)菌株；2、發(fā)酵法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸所用的假絲酵母為二倍體，即每個(gè)細(xì)胞具有兩套染色體，每個(gè)基因都有對(duì)應(yīng)的等位基因，而且催化每步體內(nèi)生化反應(yīng)的酶往往由多個(gè)基因編碼。因此，通過(guò)代謝工程手段來(lái)增強(qiáng)或減弱某個(gè)體內(nèi)生化反應(yīng)的活性，需要對(duì)編碼該酶的關(guān)鍵基因進(jìn)行分子改造才有顯著效果。否則，改造后效果也不會(huì)顯著。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有菌株生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸效果不顯著的技術(shù)問(wèn)題，提供一種生產(chǎn)效率高的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株及其制備方法和應(yīng)用。
[0007]為此，本發(fā)明提供一種長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株，其分類命名為假絲酵母菌(Candidasp.)TDTC016，所述菌株于2014年3月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；其保藏編號(hào)為:CGMCC N0.8928。
[0008]本發(fā)明中的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株基因組里增加了一個(gè)拷貝的CYP單加氧酶基因，其堿基序列如序列表的序列7所示。該基因?yàn)樵摼昊蚪M中編碼該酶的多個(gè)基因中對(duì)于長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)最為關(guān)鍵的一個(gè)。
[0009]本發(fā)明同時(shí)提供一種長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，其包括如下步驟:(I)準(zhǔn)備引物CandidaCYP-F、CYP-R、GEMura-F和Ura-R ；⑵準(zhǔn)備長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，并制備感受態(tài)細(xì)胞；(3)使用步驟(1)中的引物進(jìn)行擴(kuò)增分別得到CYP單加氧酶基因片段(CandidaCYP-F和CYP-R)和Ura3基因片段(GEMura-F和Ura-R)，再經(jīng)過(guò)一輪重疊PCR將兩個(gè)片段連接起來(lái)，再將此重疊PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物整合到尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株基因組里；(4)通過(guò)PCR擴(kuò)增、純化、電轉(zhuǎn)、篩選、鑒定，得到長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株，為尿嘧啶自養(yǎng)型菌株。
[0010]優(yōu)選地，本發(fā)明中長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，篩選步驟中使用的篩選標(biāo)記為 Ura3o
[0011]優(yōu)選地，長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，步驟(2)中的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株假絲酵母(Candida sp.) DC12，并制備尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。
[0012]本發(fā)明同時(shí)提供長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸中的應(yīng)用。
[0013]優(yōu)選地，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液加熱至70~80°C;再將pH調(diào)至9~9.5，除去菌體沉淀，保留上清；脫色，溫度保持在70~90°C，得到濾清液，用酸酸化至pH2.5，70~90°C保溫，冷卻，離心或壓濾，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到長(zhǎng)鏈二元酸。
[0014]本發(fā)明中的長(zhǎng)鏈二元酸是指含有十個(gè)以上碳原子的直鏈二羧酸，是一種重要的精細(xì)化工中間原料，特別是十二碳二元酸(DC12)、十四碳二元酸(DC14)、十六碳二元酸(DC16)和十八碳二元酸(DC18)。
[0015]本發(fā)明的有益效果是，為了突破生產(chǎn)菌種遺傳改造的瓶頸，本發(fā)明通過(guò)解析生產(chǎn)菌株的基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，分析ω-氧化和β_氧化代謝途徑，在基因組全局水平上確立了二元酸代謝相關(guān)的一些關(guān)鍵靶位點(diǎn)，再通過(guò)代謝工程手段對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行分子改造，并經(jīng)過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，獲得了性能更加優(yōu)良的菌株。本發(fā)明的TDTC016菌株(保藏號(hào):CGMCC N0.8928)，相比DC12菌株，轉(zhuǎn)化率得到顯著提高，而且相較DC12和脂酰輔酶A合成酶單拷貝敲除的TDTC002菌株，TDTC016對(duì)甲醇的耐受性明顯加強(qiáng)，對(duì)月桂酸甲酯的轉(zhuǎn)化率明顯提高，而且發(fā)酵周期縮短，為規(guī)?；a(chǎn)帶來(lái)有益效果。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明涉及到的長(zhǎng)鏈二元酸合成相關(guān)ω-氧化代謝途徑；
[0017]圖2為本發(fā)明涉及到的長(zhǎng)鏈二元酸降解相關(guān)β -氧化代謝途徑；
[0018]圖3為本發(fā)明涉及到的基因整合流程圖；
[0019]圖4為本發(fā)明涉及到的尿嘧啶自養(yǎng)型菌株的篩選；
[0020]圖5為HPLC分析DC12發(fā)酵生產(chǎn)的長(zhǎng)鏈二元酸；
[0021]圖6為HPLC分析TDTCO16發(fā)酵生產(chǎn)的長(zhǎng)鏈二元酸。
[0022]本發(fā)明的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株，其分類命名為假絲酵母菌(Candida sp.)TDTCO16 ;其保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCji址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期為2014年3月18日，保藏號(hào)編號(hào)為=CGMCC N0.89280
【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明的序列表中序列名稱如下:序列1:GEMura_F ;序列2:Ura-R ;序列3:CandidaCYP-F ;序列 4:CYP-R ;序列 5: Int-U ;序列 6: Int-D ;序列 7:CandidaA06129 (CYP 單加氧酶編碼區(qū)、上游啟動(dòng)子和下游終止子序列);序列8:質(zhì)粒pGEM-ura3。
[0024]以下實(shí)施例中觀察到的菌落及菌體形態(tài)歸納如下:
[0025]固體培養(yǎng)基平板上，菌落奶酪狀，表面光滑，乳白色，飽滿凸起，菌落直徑約為2mm。酵母樣單細(xì)胞，大小約為10x6 μ m。大多情況下，以酵母樣單細(xì)胞形式，同時(shí)會(huì)有假菌絲體形成，如在某些生長(zhǎng)階段或某種外界條件刺激下，假菌絲比例會(huì)顯著增加。
[0026]以下實(shí)施例中使用了下面所列的培養(yǎng)基:
[0027]1、YH)培養(yǎng)基，其配方為:1%的酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。上述百分比為質(zhì)量體積百分比，即每100毫升培養(yǎng)基所需該組分的克數(shù)。若要添加抗生素，液體培養(yǎng)基在使用時(shí)加入至相應(yīng)終濃度。固體培養(yǎng)基在高壓滅菌后冷卻至50攝氏度左右時(shí)，加入抗生素至相應(yīng)終濃度，混勻后立刻倒如無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，待凝固后倒直，放于4攝氏度冰箱,兩周內(nèi)使用。
[0028]2、種子培養(yǎng)基的配方:酵母膏I~8g/L,玉米衆(zhòng)I~8g/L,鹿糖5~25g/L,KH2P044~12g/L，尿素0.5~4g/L，重蠟40~70g/L，121°C滅菌30分鐘。其中，蔗糖和尿素分開(kāi)單獨(dú)110°C滅菌20分鐘，滅菌后再合并混勻。
[0029]3、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:酵母膏I~8g/L，玉米漿I~8g/L，蔗糖5~30g/L，KH2P044 ~15g/L，尿素 0.5 ~4g/L，KN035 ~15g/L,NaCl0.5 ~2.5g/L, 121°C滅菌 30 分鐘。其中，蔗糖和尿素分開(kāi)單獨(dú)滅菌，110°C滅菌20分鐘，滅菌后再合并混勻。另外配制75%葡萄糖溶液，105°C滅菌20分鐘，發(fā)酵初期進(jìn)行流加。
[0030]以下實(shí)施例中使用了下面所列的菌體培養(yǎng)及發(fā)酵液處理方式:
[0031]1、平板培養(yǎng):在Yro平板上劃線或涂布后倒置于30°C培養(yǎng)箱內(nèi)，2-3天即可觀察到大而飽滿的乳白色菌落形成。
[0032]2、搖床培養(yǎng):平板上接種單菌落至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接過(guò)來(lái)，30°C搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速保持在220轉(zhuǎn)/分鐘。
[0033]3、發(fā)酵罐培養(yǎng):可以比較實(shí)時(shí)精確控制發(fā)酵條件，如補(bǔ)料控制、pH控制、溶氧控制和通氣攪拌強(qiáng)度控制等等。第一階段，發(fā)酵液PH控制在5~6.8，同時(shí)流加葡萄糖溶液，為菌體生長(zhǎng)階段；第二階段，發(fā)酵液PH控制在7.0~7.8，同時(shí)流加底物(烷烴、脂肪酸或脂肪酸衍生物，如甲 酯或乙酯等)，以發(fā)酵產(chǎn)酸為主，也生長(zhǎng)部分菌體；第三階段，只產(chǎn)酸，不產(chǎn)菌體，根據(jù)發(fā)酵情況繼續(xù)流加底物(烷烴、脂肪酸或脂肪酸衍生物，如甲酯或乙酯等)。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程用IOM NaOH溶液自動(dòng)流加控制pH，同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)速的調(diào)整使溶解氧保持在20~40%。
[0034]4、發(fā)酵液處理:發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液加熱至70~80°C，并維持60分鐘；再加入IOM NaOH將pH調(diào)至9~9.5，用管式離心機(jī)或壓濾除去菌體沉淀，保留上清；加入適量活性炭脫色，溫度保持在70~90°C，保溫時(shí)間為60分鐘；除去活性炭后，得到濾清液，用濃鹽酸或濃硫酸連續(xù)酸化至pH2.5, 70~90°C保溫2小時(shí),冷卻至30°C,離心或壓濾，清水洗一遍，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到白色二元酸。
[0035]實(shí)施例1:菌株代謝工程改造
[0036]I)基因組測(cè)序
[0037]利用寶生物工程有限公司的基因組提取試劑盒(Yeast DNAiso Kit)制備長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株假絲酵母基因組DNA，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行?；蚪MDNA再經(jīng)過(guò)文庫(kù)構(gòu)建、新一代測(cè)序技術(shù)測(cè)序分析和數(shù)據(jù)組裝等步驟。通過(guò)基因組注釋和數(shù)據(jù)分析，獲得了生產(chǎn)菌株在二元酸生產(chǎn)相關(guān)的基因信息，挖掘了該菌在ω-氧化和β-氧化代謝途徑相關(guān)基因的編碼序列。對(duì)于酵母，氧化主要發(fā)在在過(guò)氧化物酶體內(nèi)，特別是長(zhǎng)鏈脂肪酸的β-氧化，只發(fā)生于過(guò)氧化物酶體這種細(xì)胞器里。在ω-氧化代謝途徑中，烷烴經(jīng)過(guò)CYP單加氧酶、脂肪醇氧化酶及脂肪醛脫氫酶三步酶催化反應(yīng)，烷烴的一個(gè)末端被氧化成羧基，生成脂肪酸。脂肪酸再經(jīng)過(guò)一輪ω-氧化過(guò)程(同樣的三步酶催化反應(yīng))，烷烴的兩個(gè)末端都被氧化成羧基，生成二兀酸。研究表明(Appl.Environ.Microbiol.69:5992-5999，2003),ω-氧化的第一步反應(yīng)為限速步驟，由CYP單加氧酶和CYP還原酶催化。序列分析發(fā)現(xiàn)，二元酸生產(chǎn)菌株基因組含有超過(guò)十個(gè)基因編碼CYP單加氧酶。CandidaA06129為其中一個(gè)編碼基因，編碼區(qū)長(zhǎng)度為1569bp。
[0038]2)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
[0039]利用德國(guó)凱杰公司的RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit)制備長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株假絲酵母的總RNA，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。得到的總RNA再經(jīng)過(guò)文庫(kù)構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及表達(dá)量分析。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)CandidaA06129的轉(zhuǎn)錄水平為20503.5RPKM，為全部基因里轉(zhuǎn)錄水平最高的一個(gè)。一方面說(shuō)明，該長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株具有很強(qiáng)的ω-氧化活性，另一方面說(shuō)明，CandidaA06129在ω-氧化過(guò)程中是十分重要的CYP單加氧酶基因。這里，RPKM是基因表達(dá)量的一個(gè)計(jì)算方法，表示Reads Per Kb PerMillion Reads。其計(jì)算公式為
[0040]RPKM =106C/NL/103
[0041]設(shè)RPKM(A)為基因A的表達(dá)量，則C為唯一比對(duì)到基因A的reads數(shù)，N為唯一比對(duì)到參考基因的總reads數(shù)，L為基因A編碼區(qū)的堿基數(shù)。RPKM法能消除基因長(zhǎng)度和測(cè)序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響，計(jì)算得到的基因表達(dá)量可以直接用于比較基因表達(dá)差異。
[0042]由于ω-氧化是長(zhǎng)鏈二元酸合成相關(guān)的代謝途徑，菌種改造的目的是增強(qiáng)ω-氧化活性，以提高菌株合成二元酸的能力。本發(fā)明通過(guò)增加一個(gè)拷貝的CYP單加氧酶基因來(lái)增強(qiáng)ω -氧化活性。所選的CYP單加氧酶基因由CandidaA06129編碼，其表達(dá)水平是整個(gè)基因組里在二元酸發(fā)酵條件下表達(dá)水平最高的一個(gè)基因。通過(guò)增強(qiáng)CYP單加氧酶活性，來(lái)解除ω-氧化過(guò)程中限速步驟的限制，從而達(dá)到更加有效合成二元酸的目的。
[0043]3)基因整合實(shí)驗(yàn)流程如圖3所示。使用CandidaCYP-F和CYP-R為引物，二元酸生產(chǎn)菌株基因組DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到CYP單加氧酶基因(CandidaA06129)片段，包括啟動(dòng)子和終止子部分。使用GEMura-F和Ura-R為引物，質(zhì)粒pGEM_ura3為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到Ura3基因片段，包括啟動(dòng)子和終止子部分。再以上述擴(kuò)增到的CYP單加氧酶基因片段和Ura3基因片段為模版，以CandidaCYP-F和GEMura-F為引物，經(jīng)過(guò)一輪重疊PCR將兩個(gè)片段連接起來(lái)，再將此重疊PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物整合到尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株基因組里。其中引物CandidaCYP-F和GEMura-F的5’端為同源臂序列，對(duì)應(yīng)于基因組整合位點(diǎn)的上游和下游序列。這樣，經(jīng)過(guò)重疊PCR擴(kuò)增后得到的DNA片段，兩頭分別帶上下游同源臂，中間CYP單加氧酶基因和Ura3篩選標(biāo)記。
[0044]擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)純化后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入菌體細(xì)胞內(nèi)，DNA片段的上下游同源臂與菌體染色體上的靶位點(diǎn)發(fā)生雙交換，達(dá)到整合的目的。由于這種雙交換是小概率事件，需要建立方法來(lái)進(jìn)行篩選。這里所使用到的篩選標(biāo)記為Ura3，編碼乳清苷5-磷酸脫羧酶，在尿嘧啶核苷酸的合成過(guò)程中，該酶催化其中一個(gè)關(guān)鍵的反應(yīng)。尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母菌株的乳清苷5-磷酸脫羧酶失活，除非在培養(yǎng)基中加入尿苷或尿嘧啶，否則無(wú)法生長(zhǎng)。如果你向營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株中轉(zhuǎn)化進(jìn)Ura3基因，這些營(yíng)養(yǎng)缺陷株便能正常生長(zhǎng)(陽(yáng)性選擇)。相反，如果你向培養(yǎng)基中加入5-F0A (5-氟乳清酸)，那么正常原養(yǎng)型酵母細(xì)胞的乳清苷5-磷酸脫羧酶能將5-F0A轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡(陰性選擇)。
[0045]驗(yàn)證時(shí)，使用到一對(duì)檢測(cè)引物Int-U和Int-D，分別與靶位點(diǎn)的上游和下游區(qū)域配對(duì)。如果沒(méi)有同源重組發(fā)生，通過(guò)這基因組DNA為模版擴(kuò)增出來(lái)的片段在長(zhǎng)度上是一樣的，在瓊脂糖電泳中只能觀察到一條帶。如果重疊PCR擴(kuò)增的片段通過(guò)同源重組整合到靶位點(diǎn)，那么經(jīng)過(guò)擴(kuò)增得到的片段長(zhǎng)度就發(fā)生變化，在瓊脂糖電泳中可以觀察到兩條帶。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的菌株，再通過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證代謝工程改造獲得新菌株在二元酸生產(chǎn)方面是否有性能上的優(yōu)勢(shì)。
[0046]4) PCR 擴(kuò)增
[0047]
IOx緩沖液5 μL
模版(質(zhì)粒用2ng&l，基因組DNA用50ng/^) I μL 引物 1(10 μΜ)I μL
引物2(10 μΜ)I μL
dNTP (10 ITiM)I μL
DNA聚合酶(51Ι/μ1)0.25 μL
超純水_40.75 ul


共 50 μL
[0048]其中，質(zhì)粒為質(zhì)粒pGEM-ura3，參考文獻(xiàn)為 J.Bacteriol.181,1868-1874(1999),GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)為:AF173954，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0049]使用CandidaCYP-F和CYP-R為引物I和引物2，二元酸生產(chǎn)菌株基因組DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到CYP單加氧酶基因片段。使用GEMura-F和Ura-R為引物I和引物2，質(zhì)粒pGEM-ura3為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到Ura3基因片段。再以上述擴(kuò)增到的CYP單加氧酶基因片段和Ura3基因片段為模版，以CandidaCYP-F和GEMura-F為引物，經(jīng)過(guò)一輪重疊PCR將兩個(gè)片段連接起來(lái)。DNA聚合酶是寶生物工程有限公司的PyiObest DNA聚合酶，或者是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，活性單位均為5U/ μ I。
[0050] PCR循環(huán)條件為:
[0051 ] 94度2分鐘(預(yù)變性階段)
[0052]94度20秒，58度20秒，72度I~6分鐘(30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增階段，Ikb/分鐘)
[0053]72度10分鐘(最后延伸階段)
[0054]5) DNA 純化
[0055]重疊PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ I上述PCR樣品進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，證明擴(kuò)增所得的DNA片段大小與預(yù)計(jì)的一樣，而且沒(méi)有雜帶，進(jìn)行兩步純化和濃縮，為后面的轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備DNA樣品。
[0056]第一步是利用PCR純化試劑盒(購(gòu)自O(shè)mega公司)，按照說(shuō)明書進(jìn)行。一般是50μ I體系，做4管，總體積共200 μ 1，PCR純化的最后一步用50或100 μ I TE緩沖液洗脫柱子。純化后的DNA，用NanoDrop儀器測(cè)濃度，計(jì)算得到的DNA總量約為20 μ g。
[0057]第二步是將純化的DNA再用乙醇/醋酸鈉/糖原處理進(jìn)行沉淀。具體做法是:往上述溶在TE緩沖液的DNA溶液加入I μ I糖原(20mg/ml)U00 μ I醋酸鈉(3Μ, ρΗ5.2)和Iml預(yù)冷的無(wú)水乙醇；放置-80攝氏度冰箱冷卻30分鐘；4度離心機(jī)，14000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心10分鐘，留沉淀；沉淀再用75%預(yù)冷的乙醇洗兩遍；超凈臺(tái)里風(fēng)干；4攝氏度冰箱儲(chǔ)存，電轉(zhuǎn)之前重懸在10 μ I超純水備用。
[0058]6)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)
[0059]出發(fā)菌株為假絲酵母Candia sp.(參見(jiàn)《微生物學(xué)報(bào)》20⑴:88_93，1980，正烷烴發(fā)酵生產(chǎn)長(zhǎng)鏈混合二羧酸，可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所購(gòu)買)。先通過(guò)基因敲除方式敲除Ura3基因的一個(gè)拷貝，再將Ura3基因單拷貝敲除的菌株涂布到含5-F0A的固體培養(yǎng)基平板，篩選獲得尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。從新鮮活化的平板上挑出尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的單菌落于3ml液體YPD培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘；2%轉(zhuǎn)接于20mlYPD, 30°C搖床培養(yǎng)，220轉(zhuǎn)/分鐘，至0D600達(dá)到1.8 ;將菌液置于冰上靜置15分鐘，使其停止生長(zhǎng)，4000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心3分鐘，留菌體沉淀；用4ml預(yù)冷無(wú)菌水洗一次；4000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心3分鐘，留菌體沉淀；加入4ml TE/0.1M LiOAc, 150轉(zhuǎn)/分鐘，30°C的搖床內(nèi)振蕩90分鐘;加入0.1mllM DTT，繼續(xù)150轉(zhuǎn)/分鐘、30°C的搖床箱內(nèi)振蕩30分鐘;4000轉(zhuǎn)/分鐘,4°C離心3分鐘，留菌體沉淀；加入4ml預(yù)冷無(wú)菌水，洗3次；加入2mllM山梨醇，洗I次，4000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心3分鐘；棄上清，加入120 μ I山梨醇將細(xì)胞懸起；取出40 μ I的細(xì)胞懸液于1.5ml離心管，加入5 μ I上述純化后重懸在無(wú)菌水的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約10 μ g)，混勻，置于冰上5分鐘；轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，擦干電轉(zhuǎn)杯，進(jìn)行電轉(zhuǎn)(電轉(zhuǎn)條件為:2mm狹縫的電轉(zhuǎn)杯，電壓為1800伏，電擊時(shí)間為5毫秒)；電轉(zhuǎn)后立刻加入1ml山梨醇,混勻后吸出放到1.5ml的離心管中；4000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，棄上清，加入1mlYPD培養(yǎng)基，37°C的搖床內(nèi)培養(yǎng)2小時(shí)；4000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，棄上清，加100 μ I YPD重懸菌體，涂布平板(SD-ura)，放到30°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。
[0060]7)篩選尿嘧啶自養(yǎng)型菌落
[0061]將上述平板(SD-ura)上長(zhǎng)出的單菌落分別劃線到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化獲得單菌落，再將每個(gè)單菌落同時(shí)劃到Y(jié)PD平板和SD-ura平板上，放置于30°C培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。YH)平板為對(duì)照，所有菌落在上面均能生長(zhǎng)。在SD-ura平板上能夠生長(zhǎng)，說(shuō)明外源Ura3基因已經(jīng)整合到基因組里，使得尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株變成尿嘧啶自養(yǎng)型的。這部分菌落用于下一步驗(yàn)證，看看CYP單加氧酶基因是否也整合到靶位點(diǎn)了。
[0062]8)鑒定
[0063]上面出現(xiàn)生長(zhǎng)的尿嘧啶自養(yǎng)型菌落，接種YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，吸取500 μ I菌液，利用寶生物工程有限公司的基因組提取試劑盒制備基因組DNA，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以獲得的基因組DNA為模版，Int-U和Int-D為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照本實(shí)施例1的第4)條。如果外源片段沒(méi)有整合到靶位點(diǎn)上，從兩條等位染色體上擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段大小一樣，在瓊脂糖電泳上表現(xiàn)為一條帶。如果外源片段整合到靶位點(diǎn)上，從兩條等位染色體上擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段大小不一樣，在瓊脂糖電泳上表現(xiàn)為兩條帶(見(jiàn)圖3)，鑒定為CYP單加氧酶基因CandidaA06129整合到基因組里，得到本發(fā)明的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株TDTCO16。
[0064]實(shí)施例2:長(zhǎng)鏈二元酸的發(fā)酵生產(chǎn)
[0065]菌種通過(guò)常規(guī)的斜面培養(yǎng)后，接入50ml —級(jí)種子培養(yǎng)16小時(shí)，然后將一級(jí)種子培養(yǎng)轉(zhuǎn)接入500ml 二級(jí)種子培養(yǎng)16小時(shí)。
[0066]種子培養(yǎng)基的配方:酵母膏I~8g/L,玉米衆(zhòng)I~8g/L,鹿糖5~25g/L, KH2P044~12g/L,尿素0.5~4g/L,重臘40~70g/L, 121°C滅菌30分鐘。其中，鹿糖和尿素分開(kāi)單獨(dú)110°C滅菌20分鐘，滅菌后再合并混勻。 [0067]二級(jí)種子發(fā)酵完成后，轉(zhuǎn)接入5L發(fā)酵罐。發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:酵母膏I~Sg/L,玉米衆(zhòng) I ~8g/L,鹿糖 5 ~30g/L, KH2P044 ~15g/L,尿素 0.5 ~4g/L, KN035 ~15g/L,NaCl0.5~2.5g/L，121°C滅菌30分鐘。其中，蔗糖和尿素分開(kāi)單獨(dú)滅菌，110°C滅菌20分鐘，滅菌后再合并混勻。另外配制75%葡萄糖溶液，105°C滅菌20分鐘，發(fā)酵初期進(jìn)行流加?；A(chǔ)培養(yǎng)基為4L。在30°C以1:0.5的通氣體積，控制pH5.5~6.5，在第16小時(shí)后開(kāi)始以50ml/h的速度流加十二碳直鏈烷烴，發(fā)酵時(shí)間為144-156小時(shí)。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程用IOMNaOH溶液自動(dòng)流加控制PH，同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)速的調(diào)整使溶解氧保持在30%。
[0068]如圖5和圖6所示，HPLC分析表明出發(fā)菌株DC12和改造菌株TDTC016發(fā)酵得到的長(zhǎng)鏈二元酸產(chǎn)物一致，純度約為99% (分別為98.6%和99.1% )。
[0069]從下表可以看出，改造后的菌株，轉(zhuǎn)化率提高5%以上。
【權(quán)利要求】
1.一種長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株，其分類命名為假絲酵母菌(Candida sp.)TDTC016，其保藏編號(hào)為:CGMCC N0.8928。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株，其特征在于所述假絲酵母菌基因組里增加了一個(gè)拷貝的CYP單加氧酶基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株，其特征在于所述CYP單加氧酶基因堿基序列如序列表的序列7所示。
4.如權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于包括如下步驟:
(1)準(zhǔn)備引物CandidaCYP-F、CYP-R、GEMura-F 和 Ura-R ； (2)準(zhǔn)備長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，并制備感受態(tài)細(xì)胞； (3)使用步驟(1)中的引物進(jìn)行擴(kuò)增分別得到CYP單加氧酶基因片段CandidaCYP-F、CYP-R和Ura3基因片段GEMura_F、Ura-R,再經(jīng)過(guò)一輪重疊PCR將兩個(gè)片段連接起來(lái)，再將此重疊PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物整合到尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株基因組里； (4)通過(guò)PCR擴(kuò)增、純化、電轉(zhuǎn)、篩選、鑒定，得到尿嘧啶自養(yǎng)型長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于所述篩選步驟中使用的篩選標(biāo)記為Ura3。
6.據(jù)權(quán)利要求4所述的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株 為假絲酵母(Candida sp.)DC12的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。
7.如權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸中的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液加熱至70~80°C ;再將pH調(diào)至9~9.5，除去菌體沉淀，保留上清；脫色，溫度保持在70~90°C，得到濾清液，用酸酸化至pH2.5，70~90°C保溫，冷卻，離心或壓濾，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到長(zhǎng)鏈二元酸。
【文檔編號(hào)】C12P7/44GK103992959SQ201410175556
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】賴小勤, 晏禮明, 楊勇, 葛書華, 陳遠(yuǎn)童, 陶勇, 傅深展 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所