體內(nèi)外循環(huán)篩選法構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株模型的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種體內(nèi)外循環(huán)篩選法構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株模型的方法，包括如下步驟：(1)細(xì)胞培養(yǎng)；(2)皮下移植；(3)胰腺癌模型組的構(gòu)建；(4)化學(xué)治療模型的構(gòu)建；(5)取材；(6)采用酶消化法進(jìn)行瘤體源性原代細(xì)胞培養(yǎng)；(7)循環(huán)篩選，從而獲得耐藥細(xì)胞株。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)、體內(nèi)誘導(dǎo)，重復(fù)循環(huán)篩選的方法，獲得的耐藥細(xì)胞具有與原代細(xì)胞相同的遺傳特征，是理想的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
【專利說(shuō)明】體內(nèi)外循環(huán)篩選法構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株模型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物開發(fā)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種體內(nèi)外循環(huán)篩選法構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株模型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]構(gòu)建相應(yīng)動(dòng)物及細(xì)胞模型是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展重要的部分，建立具有明確特征的腫瘤模型是研究和揭示腫瘤分子機(jī)制的關(guān)鍵平臺(tái)。胰腺癌惡性程度高，術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高，化療藥物作用效果差異大，胰腺癌的治療效果欠佳。腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥是降低胰腺癌治療效果的重要原因之一。構(gòu)建模擬腫瘤生物學(xué)特征的動(dòng)物模型是腫瘤學(xué)研究的重要步驟。國(guó)內(nèi)外的學(xué)者構(gòu)建了多種胰腺癌模型:通過(guò)瘤塊移植構(gòu)建胰腺癌模型，原位移植法構(gòu)建淋巴轉(zhuǎn)移模型，腹腔注射構(gòu)建胰腺癌腹膜轉(zhuǎn)移模型等η°。本研究中應(yīng)用人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1構(gòu)建了較為真實(shí)地模擬了與人腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相似的微環(huán)境。在移植瘤移植5周后，移植成功率達(dá)到73.3% -80%，轉(zhuǎn)移率達(dá)到11.1% -37%，具有制模時(shí)間短、成瘤率高、轉(zhuǎn)移率高的特點(diǎn)。與其他胰腺癌動(dòng)物模型相比，其生物學(xué)行為與人類胰腺癌極為接近，模擬同原發(fā)腫瘤發(fā)病部位相似的腫瘤微環(huán)境(胰腺體尾部腫瘤)，能在相應(yīng)部位形成轉(zhuǎn)移灶，避免因移植位點(diǎn)特異性引起的假陽(yáng)性，對(duì)胰腺癌的自然病程進(jìn)行模擬，可以認(rèn)為是一較理想的“擬人”胰腺癌轉(zhuǎn)移模型η_15。該模型的主要缺點(diǎn)在于手術(shù)技術(shù)要求較高，且裸鼠耐受能力較差，操作過(guò)程有一定的死亡率，本研究中達(dá)8.3% -18.3%,故在制模時(shí)要求較高的實(shí)驗(yàn)條件及操作技術(shù)。
[0003]對(duì)于耐藥細(xì)胞系的建立，目前所采用的幾乎都是體外培養(yǎng)，藥物階梯濃度誘導(dǎo)馴化的方法。具體到培養(yǎng)手段，可以是培養(yǎng)液中加入藥物，也可以是培養(yǎng)基中加入藥物。該方法原理簡(jiǎn)單，但不容易掌握，失敗率高。最重要的是不能充分模擬臨床上化療藥物多藥耐藥產(chǎn)生的實(shí)際過(guò)程。以其為研究平臺(tái)獲得的結(jié)果有時(shí)候無(wú)法反映人體復(fù)雜的多因素作用過(guò)程。因此，如何通過(guò)體外培養(yǎng)-體內(nèi)誘導(dǎo)循環(huán)篩`選法構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞及動(dòng)物模型，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種體內(nèi)外循環(huán)篩選法構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株模型的方法，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案。
[0005]本發(fā)明涉及一種體內(nèi)外循環(huán)篩選法構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株模型的方法，其特征在于包括如下步驟:
[0006](I)細(xì)胞培養(yǎng):培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，制成單細(xì)胞懸液；
[0007](2)皮下移植:將1-1OXlO6細(xì)胞懸液接種到裸鼠的右側(cè)頸背部皮下，待長(zhǎng)成0.5-1.5cm3大小后處死裸鼠，將實(shí)體瘤取出，去除包膜和壞死組織，剪成0.5-1.5mm3大小的瘤塊，備用；[0008](3)胰腺癌模型組的構(gòu)建麻醉裸鼠，剪開胰腺被膜，將步驟(2)的瘤塊植入胰尾近脾門處，縫合胰腺被膜，分層縫合肌層及皮膚；
[0009](4)化學(xué)治療模型的構(gòu)建:胰腺癌裸鼠胰腺原位移植后7天開始，注射抗腫瘤藥物，每周I次腹腔注射，共4次，第35天處死；
[0010](5)取材:處死后收集腫瘤病灶，通過(guò)病理切片篩選腫瘤組織；
[0011](6)將組織剪碎，采用酶消化法進(jìn)行瘤體源性原代細(xì)胞培養(yǎng)；
[0012](7)循環(huán)篩選:將步驟(6)的原代培養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)步驟(2)-(6) I次-4次，從而獲得耐藥細(xì)胞株。
[0013]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的抗腫瘤藥物是吉西他濱，所得到的耐藥細(xì)胞株耐吉西他濱細(xì)胞株。
[0014]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，吉西他濱的單次注射量是200_300mg/kg裸鼠。
[0015]經(jīng)過(guò)兩輪的篩選，獲得胰腺癌吉西他濱的耐藥細(xì)胞，命名為PANC-1/R2。按此方法，若經(jīng)后增加循環(huán)次數(shù)(m)，其命名方法即為PANC-1/Rm。該方法易于標(biāo)記，也能明確篩選和循環(huán)次數(shù)。評(píng)價(jià)篩選的耐藥細(xì)胞株，體內(nèi)及體外的耐藥實(shí)驗(yàn)是必不可少的。本研究測(cè)定了三種不同吉西他濱濃度作用下，親代細(xì)胞PANC-1和耐藥細(xì)胞系PANC-1/R2的抑制率，分別是 21.8%,37.1%A6.1%和 12.6%,25.3%,36.8%，耐藥細(xì)胞系 PANC-1/R2 的抑制率均明顯小于親代，可見(jiàn)其抗吉西他濱作用明顯強(qiáng)于親代細(xì)胞，表現(xiàn)出明顯的耐藥性。而用PANC-1和PANC-1/R2分別構(gòu)建胰腺癌動(dòng)物模型，吉西他濱腹腔注射治療后，獲取瘤體，PANC-1/R2瘤體重量為2.19±0.Hg,明顯高于PANC-1的1.87±0.69g。這種通過(guò)體內(nèi)外的耐藥實(shí)驗(yàn)可以直觀的明確細(xì)胞的耐藥性，較通過(guò)測(cè)定耐藥相關(guān)基因表達(dá)ABCG2、ABCB1和PLKl等更簡(jiǎn)便而確切。當(dāng)然，既然已經(jīng)篩選 出了細(xì)胞和動(dòng)物模型，進(jìn)一步篩選耐藥相關(guān)的蛋白、基因以及相應(yīng)的機(jī)制就水到渠成了。
[0016]通過(guò)這種循環(huán)篩選的方法，篩選的次數(shù)越多，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)變異及遺傳變異的機(jī)會(huì)會(huì)增多。特別在免疫缺陷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行人類腫瘤移植實(shí)驗(yàn)可能誘發(fā)宿主自發(fā)瘤，為此，必須證明篩選的亞群細(xì)胞與親代細(xì)胞是否具有一致的遺傳背景，即遺傳同源性。本實(shí)驗(yàn)從親代與傳代細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胰腺組織中擴(kuò)增人類特異的D14S68、D18S69、D20S199三個(gè)微衛(wèi)星序列21，結(jié)果顯示，親代與耐藥亞群細(xì)胞3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物片段完全相同，而裸小鼠正常胰腺?zèng)]有擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物片段，這既證實(shí)耐藥瘤體完全來(lái)源于原腫瘤模型，也說(shuō)明該移植模型經(jīng)過(guò)體內(nèi)連續(xù)傳代，仍保留其遺傳穩(wěn)定性。本次實(shí)驗(yàn)成功篩選和分離吉西他濱耐耐藥特征的胰腺癌細(xì)胞，為胰腺癌耐藥實(shí)驗(yàn)研究提供了一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)工具。通過(guò)比較這種亞群細(xì)胞和親代細(xì)胞的基因表達(dá)差異網(wǎng)，可以獲得胰腺癌的化療藥物耐藥相關(guān)分子表達(dá)譜，有利于推動(dòng)胰腺癌耐藥的分子機(jī)制研究，并為胰腺癌化療增敏提高預(yù)后和干預(yù)提供可能的靶分子。
[0017]該方法能很好得模擬人體復(fù)雜環(huán)境下產(chǎn)生腫瘤耐藥的生物學(xué)過(guò)程，是一種理想的細(xì)胞篩選和建模方法。但也存在一些不足，主要表現(xiàn)在篩選時(shí)間長(zhǎng)，操作過(guò)程復(fù)雜，對(duì)環(huán)境要求較高。其中一輪篩選所需時(shí)間長(zhǎng)大2個(gè)多月，兩輪篩選需要5-6月，而且在過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)胞分離、培養(yǎng)等過(guò)程的疏漏可致前功盡棄。其技巧是改善實(shí)驗(yàn)操作，增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分批篩選，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中避免污染，一旦細(xì)胞篩選完成，盡早進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。這些措施可減少實(shí)驗(yàn)的失敗率。本研究中篩選兩輪即停止第三輪篩選就由于耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)。但從模型的穩(wěn)定性上考慮，再篩選1-2輪可增加其耐藥的穩(wěn)定性，其耐藥特征將更加明顯。相較于第一輪，第二輪的細(xì)胞胞體較大，細(xì)胞器增多，推測(cè)可能與其活力有關(guān)，更能適應(yīng)復(fù)雜的外部環(huán)境，從而出現(xiàn)對(duì)吉西他濱的耐藥。隨著篩選的推進(jìn)，其細(xì)胞特征可能會(huì)更加明顯。
[0018]總之，一個(gè)良好的細(xì)胞及動(dòng)物模型是研究腫瘤機(jī)制的重要平臺(tái)，體外培養(yǎng)、體內(nèi)誘導(dǎo)，循環(huán)篩選的方法，充分模擬胰腺癌產(chǎn)生對(duì)吉西他濱耐藥的病理過(guò)程，以此平臺(tái)進(jìn)行研究，有助于揭示胰腺癌吉西他濱耐藥產(chǎn)生的機(jī)制，為胰腺癌化學(xué)治療提供增敏的干預(yù)靶點(diǎn)，從而提高胰腺癌的治療效果。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1左圖為PANC-1細(xì)胞圖片，右圖為PANC-1/R2細(xì)胞圖片?？梢?jiàn)耐藥細(xì)胞株細(xì)胞較大，胞漿豐富，細(xì)胞器發(fā)達(dá)，是具有較強(qiáng)適應(yīng)能力的表現(xiàn)。
[0020]圖2 6&，6比6(:分別為014568、018569、0205199序列PCR產(chǎn)物聚丙稀酞胺電泳銀染結(jié)果。最左邊泳道DNAmarker，1、2、3道分別代表從裸小鼠胰腺、親代細(xì)胞PANC-1、吉西他濱耐藥細(xì)胞PANC-1/R2中擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢?jiàn)第2、3泳道擴(kuò)增產(chǎn)物完全一致，第I泳道沒(méi)有擴(kuò)增相應(yīng)的條帶。
【具體實(shí)施方式】:
[0021]實(shí)施例1:
[0022]一材料
[0023]1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性BALB/c裸小鼠由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供和飼養(yǎng)，鼠齡4周，體質(zhì)量18~20g，飼養(yǎng)于恒溫(25~27°C )，恒濕(45%~50% )，符合SPF條件的裸鼠室內(nèi)，飲用水及標(biāo)準(zhǔn)食療均經(jīng)滅菌后供動(dòng)物自由食用。
[0024]2.細(xì)胞株:人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1商購(gòu)得到
[0025]3.儀器、軟件和試劑:
[0026]超凈工作臺(tái):上海上凈凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；
[0027]臺(tái)式水平高速離心機(jī):eppendorf產(chǎn)品；
[0028]電熱恒溫水浴箱:上海醫(yī)療器械五廠；
[0029]高壓蒸汽滅菌鍋:上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠；
[0030]電熱干燥箱:德國(guó)Heraeus公司；
[0031]電熱恒溫水浴箱(DK-8D):上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠；
[0032]常溫穩(wěn)壓電泳儀:北京六一儀器廠；
[0033]微量加樣器:Eppendorf公司(德國(guó))；
[0034]雪花狀制冰機(jī):美國(guó)Ross TEMP ；
[0035]TH2-C恒溫振蕩器:江蘇太倉(cāng)試驗(yàn)設(shè)備廠；
[0036]78HW-1型恒溫磁力攪拌器:杭州儀表廠；
[0037]Du-640紫外分光光度儀:上海常新儀器廠；
[0038]組織勻漿器:溫州市醫(yī)療電器廠；
[0039]微量移液器及相應(yīng)Tip: 10、20、100、1000ul，GILSON 產(chǎn)品；[0040]DMED高糖培養(yǎng)液:吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品；
[0041]胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；
[0042]戊巴比妥鈉:中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；
[0043]低溫離心機(jī):BeckmanCoul ter Avanti J-20 (Heraeus Inc.德國(guó))；
[0044]精密電子天平:AT2611/1000 (Mettler Inc.美國(guó))；
[0045]PBS~11表面加強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(SELD1-T0F-MS)、CMlO型蛋白質(zhì)芯片；
[0046]96孔蛋白質(zhì)芯片工作支架即Bio-proeessor ；
[0047]分析軟件ProteinchipSoftware3.0(美國(guó) Ciphergen 公司):支持向量機(jī)(support veetor machines, SVM)、判別分析(discriminant analysis)和時(shí)間序列分析(time-sequence analysis)軟件運(yùn)用 Matlab6.5 數(shù)據(jù)處理軟件(MathworkS 公司);
[0048]分析純尿素、乙酸鈉、乙睛、DTT和cHAPS緩沖鹽(sigma公司)；
[0049]SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包(SPSS公司);
[0050]注射用鹽酸吉西他濱(健擇)(LILLY公司，批號(hào)A283463)；
[0051]微衛(wèi)星位點(diǎn)分別為D14S68、D18S69、D20S199，引物序列檢索
[0052]自NCBI的UniSTS數(shù)據(jù)庫(kù)，由上海生工生物工程公司合成。
[0053]二構(gòu)建方法`
[0054]I細(xì)胞培養(yǎng):人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1接種于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37°C、5% C02孵箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌培養(yǎng)細(xì)胞，輕搖振蕩后傾棄培養(yǎng)液，PBS工作液漂洗2遍。加入適量的2.5g/L胰蛋白酶與200 μ mo I/L EDTA混合，室溫下倒置顯微鏡觀察消化過(guò)程，待單層的細(xì)胞成片收縮，細(xì)胞逐漸變圓，細(xì)胞之間出現(xiàn)空隙時(shí)，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，制成單細(xì)胞懸液。取樣鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1.5 ~2X106/mL。
[0055]2.皮下移植:將9X IO6細(xì)胞懸液接種到裸鼠的右側(cè)頸背部皮下，待長(zhǎng)成Icm3大小后將實(shí)體瘤取出，去除包膜和壞死組織，剪成Imm3大小的瘤塊,備用。
[0056]3.胰腺癌模型組的構(gòu)建:20g/L戊巴比妥鈉溶液45mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，上腹部2cm切口，剪開胰腺被膜，將Imm3大小的瘤塊植入胰尾近脾門處，縫合胰腺被膜，分層縫合肌層及皮膚。
[0057]4.化學(xué)治療模型的構(gòu)建:胰腺癌裸鼠胰腺原位移植后7天開始，注射240mg健擇/kg裸鼠，每周I次腹腔注射，共4次，第35天處死。
[0058]5.取材:所有裸鼠每天檢查每周稱重，于制模后第35天稱重后處死。摘取眼球由眶后靜脈竇取血并收集腫瘤病灶及淋巴結(jié)和內(nèi)臟等標(biāo)本組織。全血取出后立刻放入試管中，靜止I~1.5小時(shí)，后在4度低溫離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，取上清液，再次離心10分鐘，取上清血清分裝于印pendorf管中，以石蠟封口，標(biāo)記后放入-80度冷凍。胰腺腫瘤組織在拭干表面水分后立即在電子稱上稱重并記錄，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積并記錄。所有腫瘤組織石蠟包埋切片HE染色。所有腫瘤組織均得到病理切片證實(shí)。
[0059]6.酶消化法進(jìn)行瘤體源性原代細(xì)胞培養(yǎng):在剪碎組織，切成l_2mm3小塊中，加入
0.25%胰蛋白酶或2000U/ml膠原酶，在37°C水浴中消化30min或更長(zhǎng)一些，去除消化液，用洗液洗3次，培養(yǎng)基洗I次后，用完全培養(yǎng)基懸浮，并用吸管吹打分散制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。以(5-10) XlO8個(gè)/L細(xì)胞濃度，在含有10%小牛血清的RPM1、EagleMEM或DMEM中，在37°C、5% CO2下分瓶(或皿)中培養(yǎng)。
[0060]7.循環(huán)篩選:將腹腔化療后瘤體最大的5個(gè)模型的瘤體組織，按步驟6獲得的腫瘤細(xì)胞，再進(jìn)行皮下成瘤，腹腔原位移植，腹腔化療，獲得瘤體組織，細(xì)胞分離培養(yǎng)等。具體方法同前，但循環(huán)操作I次，從而獲得耐藥細(xì)胞株及耐藥動(dòng)物模型。
[0061]8.耐藥細(xì)胞亞群的遺傳背景鑒定:抽提模型動(dòng)物胰腺組織(液氮凍存)、PANC-1/R2和親代細(xì)胞PANC-1的DNA，以其為模板，PCR法擴(kuò)增三個(gè)微衛(wèi)星序列，PCR產(chǎn)物聚丙稀酞胺凝膠電泳和銀染顯示。具體如下為，PCR擴(kuò)增:10μ I反應(yīng)體系中含有樣本DNA約0.1 μ g，弓丨物各5pmol，TaqDNA聚合酶0.3μ I等。反應(yīng)條件:預(yù)變性94°C 2min ;循環(huán)94°C X30s,56°C X 30s,72°C X 30s，共36個(gè)循環(huán)；延伸56°C 5min ;顯示:PCR產(chǎn)物大小分別為148~172bp、192~210bp、108~126bp，8%聚丙稀酰氨凝膠電泳和銀染顯色顯示。
[0062]三統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0063]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中計(jì)量資料以i ±s表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行，多組
資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用方差分析，各組均數(shù)間的相互比較采用Student-Newman-keuls法，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P < 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
[0064]結(jié)果
[0065]一建立胰腺癌動(dòng)物模型，體內(nèi)外循環(huán)篩選胰腺癌吉西他濱耐藥模型
[0066]構(gòu)建了胰腺癌吉西他濱耐藥的細(xì)胞及動(dòng)物模型，第一循環(huán)原位移植成功率為73.3% (11/15)，吉西他濱腹腔灌注后死亡率為18.2% (2/11)，瘤體最大的5個(gè)均值為1.76±0.87g，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率11.1% (1/9);第二循環(huán)原位移植成功率80% (12/15)，吉西他濱腹腔灌注后死亡率為8.3% (1/12)，瘤體最大的5個(gè)均值為2.16±1.12g，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率36.3% (4/11);兩循環(huán)比較，瘤體大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P <0.05)，見(jiàn)表1。
[0067]表1兩輪循環(huán)的一般資料比較
【權(quán)利要求】
1.一種體內(nèi)外循環(huán)篩選法構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株模型的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)細(xì)胞培養(yǎng):培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，制成單細(xì)胞懸液； (2)皮下移植:將1-1OXlO6細(xì)胞懸液接種到裸鼠的右側(cè)頸背部皮下，待長(zhǎng)成0.5-1.5cm3大小后處死裸鼠，將實(shí)體瘤取出，去除包膜和壞死組織，剪成0.5-1.5mm3大小的瘤塊，備用； (3)胰腺癌模型組的構(gòu)建:麻醉裸鼠，剪開胰腺被膜，將步驟(2)的瘤塊植入胰尾近脾門處，縫合胰腺被膜，分層縫合肌層及皮膚； (4)化學(xué)治療模型的構(gòu)建:胰腺癌裸鼠胰腺原位移植后7天開始，注射抗腫瘤藥物，每周I次腹腔注射，共4次，第35天處死； (5)取材:處死后收集腫瘤病灶，通過(guò)病理切片篩選腫瘤組織； (6)將組織剪碎，采用酶消化法進(jìn)行瘤體源性原代細(xì)胞培養(yǎng)； (7)循環(huán)篩選:將步驟(6)的原代培養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)步驟(2)46)1次-4次，從而獲得耐藥細(xì)胞株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的抗腫瘤藥物是吉西他濱，所得到的耐藥細(xì)胞株耐吉西他濱細(xì)胞株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，吉西他濱的單次注射量是200-300mg/kg裸鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過(guò)病理切片篩選腫瘤組織使指選擇腫瘤大、轉(zhuǎn)移率高的裸鼠。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK103820391SQ201410081002
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】朱錦輝, 勞昕元 申請(qǐng)人:朱錦輝