用于檢測人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞株LoVo的核酸適配體及檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領域，尤其涉及一種用于檢測人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞株 LoVo的核酸適配體及其篩選方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥致死最重要的原因，而在結(jié)腸癌病例中有大于50%的患者發(fā)生了 腫瘤轉(zhuǎn)移，這些發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移的患者預后極差，五年生存率只有6%左右。因此，發(fā)展特異 性的方法檢測和治療結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移腫瘤對提高這些患者的生存率至關(guān)重要。然而，由于缺乏 相應的技術(shù)獲得針對結(jié)腸癌腫瘤轉(zhuǎn)移的高特異性和高靈敏度的分子探針，目前對高轉(zhuǎn)移結(jié) 腸癌的診斷和治療仍面臨巨大挑戰(zhàn)。近年來，隨著影像學和手術(shù)技術(shù)的進步，雖然使高轉(zhuǎn)移 結(jié)腸癌的診斷和治療取得一定進展，但與高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌發(fā)生有關(guān)的分子機制尚不清楚，因 此篩選出它的核酸適配體對于臨床檢測、腫瘤標志物的鑒定、腫瘤發(fā)病機理的發(fā)現(xiàn)都有很 重要的意義。
[0003] 核酸適配體（aptamer)是通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX)篩選得到 的，能特異結(jié)合祀標的單鏈寡聚核苷酸（ssDNA或ssRNA)。核酸適配體與抗體功能類似， 但是與抗體相比具有更多的優(yōu)勢，例如具有更好的親和力與特異性；免疫原性小；易化學 合成且成本低；可進行基團標記；穩(wěn)定性好，易于保存等優(yōu)點。此外，核酸適配體的靶標具 有普適性，不僅包括離子、氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等，而且也可以是完整的病毒顆粒及細胞等 復合物靶標。因此，核酸適配體具有廣泛的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有比蛋白抗體更好 的親和力與特異性、免疫原性小、能夠化學合成、分子量小、穩(wěn)定、易于保存和標記的可用于 檢測人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞株LoVo的核酸適配體及其衍生物，還相應提供前述核酸適配體 的篩選方法和在制備用于檢測人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞株LoVo的檢測試劑盒中的應用，提高 核酸適配體的篩選效率。本發(fā)明還提供了一種包括前述核酸適配體的檢測試劑盒，檢測方 便、迅速。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，提供了一種用于檢測人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞株LoVo的核酸 適配體，所述核酸適配體為核酸適配體Jl、核酸適配體J3、核酸適配體J4、核酸適配體J7 中的一種；所述核酸適配體Jl的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示的DNA片段；所述核酸適 配體J3的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示的DNA片段；所述核酸適配體J4的核苷酸序列 為SEQ ID NO. 3所示的DNA片段；所述核酸適配體J7的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示的 DNA片段。
[0006] 上述的核酸適配體，優(yōu)選的，所述核酸適配體還包括在核酸適配體Jl、核酸適配體 J3、核酸適配體J4、核酸適配體J7的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、 巰基化或同位素化的核酸適配體。
[0007] 上述的核酸適配體，優(yōu)選的，所述氨基化具體為在所述核酸適配體J1、核酸適配體 J3、核酸適配體J4、核酸適配體J7核苷酸序列的5'端標記氨基基團-NH2。
[0008] 上述的核酸適配體，優(yōu)選的，所述巰基化具體為在所述核酸適配體J1、核酸適配體 J3、核酸適配體J4、核酸適配體J7核苷酸序列的5'端標記巰基基團-SH。
[0009] 上述的核酸適配體，優(yōu)選的，所述核酸適配體Jl、核酸適配體J3、核酸適配體J4和 核酸適配體J7的核苷酸序列上結(jié)合有生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米發(fā)光材料或酶標記。
[0010] 上述的核酸適配體，優(yōu)選的，所述熒光物質(zhì)為FAM熒光基團或Cy5熒光基團；所述 納米發(fā)光材料為量子點或上轉(zhuǎn)換納米顆粒；所述酶標記為辣根過氧化物酶或蔗糖酶。
[0011] 上述的核酸適配體，優(yōu)選的，所述核酸適配體的核苷酸序列包括以下三種序列中 的任意一種： (1) 與所述核酸適配體的核苷酸序列的同源性在60%以上； (2) 與所述核酸適配體的核苷酸序列進行雜交的序列； (3) 所述核酸適配體的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。
[0012] 上述的核酸適配體，優(yōu)選的，還包括所述核酸適配體的衍生物，所述核酸適配體衍 生物為由所述核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。
[0013] 上述的核酸適配體，優(yōu)選的，還包括所述核酸適配體的衍生物，所述核酸適配體衍 生物為由所述核酸適配體改造而成的相應肽核酸。
[0014] 作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了上述核酸適配體在制備用于檢測人高轉(zhuǎn) 移結(jié)腸癌細胞株LoVo的檢測試劑盒中的應用。
[0015] 作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種用于檢測人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞株 LoVo的檢測試劑盒，包括上述的核酸適配體。
[0016] 上述的核酸適配體，優(yōu)選的，還包括結(jié)合緩沖液和洗滌緩沖液。優(yōu)選的，所述結(jié)合 緩沖液為binding buffer。所述洗滌緩沖液為PBS。
[0017] 作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了上述檢測試劑盒在檢測人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌 細胞株LoVo中的應用。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于： (1)本發(fā)明提供了一種用于檢測人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞株LoVo的核酸適配體，通過 Cell-SELEX篩選得到的核酸適配體與蛋白抗體相比具有更好的親和力與特異性；免疫原 性??；能夠體外化學合成，分子量小，可以對不同部位進行修飾和取代，且化學性質(zhì)穩(wěn)定，易 于保存；便于標記等特點。
[0019] (2)本發(fā)明提供了一種用于檢測人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞株LoVo的核酸適配體的檢 測試劑盒，由于核酸適配體的合成成本較抗體制備成本低，且周期短，重現(xiàn)性好，采用本發(fā) 明的核酸適配體進行人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌LoVo細胞的檢測時，操作更為簡單、迅速。本發(fā)明的 可識別人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞株LoVo的核酸適配體均可高親和力的識別人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細 胞株LoVo,且結(jié)合能力強，解離常數(shù)均在納摩爾范圍以內(nèi)。利用本發(fā)明的核酸適配體對其結(jié) 合的靶分子進行釣取，可能得到其腫瘤標志物，這對于結(jié)腸癌的臨床研究具有重要意義。
【附圖說明】
[0020] 為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例 中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述。
[0021] 圖1為本發(fā)明實施例1中利用Mfold軟件模擬的核酸適配體FAM-Jl的二級結(jié)構(gòu) 示意圖。
[0022] 圖2為本發(fā)明實施例1中利用Mfold軟件模擬的核酸適配體FAM-J3的二級結(jié)構(gòu) 示意圖。
[0023] 圖3為本發(fā)明實施例1中利用Mfold軟件模擬的核酸適配體FAM-J4的二級結(jié)構(gòu) 示意圖。
[0024] 圖4為本發(fā)明實施例1中利用Mf〇Id軟件模擬的核酸適配體FAM-J7的二級結(jié)構(gòu) 示意圖。
[0025] 圖5為本發(fā)明實施例1中流式細胞儀檢測四條核酸適配體對人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞 株LoVo的結(jié)合能力的檢測結(jié)果。
[0026] 圖6為本發(fā)明實施例1中流式細胞儀檢測四條核酸適配體對人非轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞 株SW480的結(jié)合能力的檢測結(jié)果。
[0027] 圖7為本發(fā)明實施例1中激光共聚焦掃描顯微鏡檢測四條核酸適配體對人高轉(zhuǎn)移 結(jié)腸癌細胞株LoVo的結(jié)合能力及特異性的檢測結(jié)果。
[0028] 圖8為本發(fā)明實施例1中流式細胞儀測定核酸適配體FAM-Jl結(jié)合LoVo細胞的解 離常數(shù)繪制曲線。
[0029] 圖9為本發(fā)明實施例1中流式細胞儀測定核酸適配體FAM-J3結(jié)合LoVo細胞的解 離常數(shù)繪制曲線。
[0030] 圖10為本發(fā)明實施例1中流式細胞儀測定核酸適配體FAM-J4結(jié)合LoVo細胞的 解離常數(shù)繪制曲線。
[0031 ] 圖11為本發(fā)明實施例1中流式細胞儀測定核酸適配體FAM-J7結(jié)合LoVo細胞的 解離常數(shù)繪制曲線。
[0032] 圖12為激光共聚焦掃描顯微鏡檢測核酸適配體FAM-J3對靶細胞株LoVo、人高 入侵性結(jié)腸癌細胞株SW620、人高入侵性卵巢癌細胞株HeLa、人高入侵性前列腺癌細胞株 PC-3M-1E8、人非高入侵性肝癌細胞株H印G2和人非高入侵性正常肝細胞株L02的結(jié)合能力 及特異性的檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0033] 以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而 限制本發(fā)明的保護范圍。 實施例
[0034] 以下實施例中所采用的材料和儀器均為市售。
[0035] 實施例1 一種可用于檢測人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細胞株LoVo的核酸適配體，采用以下方法篩選得到： 1、合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物： 隨機文庫 RL40 :5' -CCTGAACCTGATGCCAACCT (MO)AGTAGCGAG CGTGTAGTGTG-3' ； 5' 引物：5' -FAM-CCTG