專利名稱：突變α-淀粉酶的制作方法
本申請為分案申請，其母案申請?zhí)枮?0118140.8，申請日為2000年6月9日，發(fā)明名稱為“突變α-淀粉酶”。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有極佳耐熱性、尤其可用作洗滌劑的酶之突變液化堿性α-淀粉酶，及其基因。
背景領(lǐng)域描述當(dāng)用α-淀粉酶[EC.3.2.1.1]作為洗滌劑的酶時，迄今為止認(rèn)為，能隨機分解淀粉并對堿及螯合成分和氧化漂白成分穩(wěn)定的液化堿性α淀粉酶是優(yōu)選的。然而，在液化淀粉酶中，鈣離子通常對保持酶結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，在螯合劑的存在下其穩(wěn)定性降低。此外，大多數(shù)這類酶具有中性到弱酸性的最適pH。
在前述情況中，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，自土壤中分離的嗜堿性芽孢桿菌屬的種KSM-K38(FERM BP-6946)和芽孢桿菌屬的種KSM-K36(FERMBP-6945)株產(chǎn)生的酶，在認(rèn)為常規(guī)液化α-淀粉酶失活的高濃度螯合劑存在下根本不顯示活性的降低，并且對表面活性劑和氧化劑具有抗性，與常規(guī)液化α-淀粉酶相比，在堿性側(cè)具有更高的活性，并可用作洗滌劑的酶(日本專利申請?zhí)?62487/1998)。
然而，在50℃或更高的溫度下該酶顯示失活，鑒于服裝和餐具的清洗一般都在大約10-60℃下進(jìn)行的事實，其耐熱性略顯不足。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的在于提供一種α-淀粉酶，它是一種在堿性方面具有高活性、對螯合成分和氧化漂白成分穩(wěn)定、并具有極佳耐熱性的液化堿性α-淀粉酶。
本發(fā)明者已經(jīng)獲得了對于液化堿性α-淀粉酶多種突變酶，并對其進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向來源于KSM-K38的淀粉酶的氨基酸序列(SEQID NO1)指定氨基酸殘基中引入突變時，該酶的耐熱性提高而不喪失其特性，如對螯合劑的抗性和對氧化劑的抗性，以及堿性區(qū)域的高比活，通過組合這些突變能進(jìn)一步提高耐熱性。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種突變α-淀粉酶，其獲得方法是對具有SEQID NO1所示氨基酸序列的α-淀粉酶或與該氨基酸序列至少有70％同源性的α-淀粉酶中氨基酸殘基的至少一個殘基進(jìn)行置換或缺失，這些殘基分別對應(yīng)于SEQ ID NO1所示氨基酸序列的11位Tyr、16位Glu、49位Asn、84位Glu、144位Ser、167位Gln、169位Tyr、178位Ala、188位Glu、190位Asn、205位His和209位Gln。
根據(jù)本發(fā)明，也提供了一種突變α-淀粉酶，其獲得方法是將具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的α-淀粉酶或與該氨基酸序列至少有70％同源性的α-淀粉酶中對應(yīng)于SEQ ID NO1所示氨基酸序列氨基端起11-100氨基酸殘基的序列置換為另一種液化α-淀粉酶中對應(yīng)于該氨基酸殘基序列的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供了分別編碼這些突變α-淀粉酶的基因、含有每種這些基因的載體、由這類載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和這些突變α-淀粉酶的產(chǎn)生方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，又進(jìn)一步提供一種包含這些突變α-淀粉酶中任一種的洗滌劑組合物。
附圖簡述通過下列描述和附加的權(quán)利要求書，結(jié)合下列附圖，本發(fā)明的上述及其它目的、特征和優(yōu)點將顯而易見，其中

圖1說明了一種制備重組質(zhì)粒的方法，用于來源于KSM-K38和KSM-AP1378株的α-淀粉酶的產(chǎn)生。
圖2說明了一種向來源于KSM-38株的α-淀粉酶基因中引入突變的方法，圖3說明了一種方法，用于將來源于KSM-38株的α-淀粉酶基因的N端序列置換為來源于KSM-AP1378株的α-淀粉酶基因的N端區(qū)。
優(yōu)選實施方案詳述根據(jù)本發(fā)明的突變α-淀粉酶的獲得方法是，突變編碼具有SEQ IDNO1所示氨基酸序列或與該氨基酸序列至少有70％同源性的氨基酸序列的液化堿性α-淀粉酶的基因。然而，對常規(guī)液化α-淀粉酶也進(jìn)行了通過氨基酸缺失和/或置換提高耐熱性的實驗。例如，曾經(jīng)報道了通過刪除來源于解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)的酶中殘基177位Arg-178位Gly而獲得的酶(生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，264，18933，1989)，和通過將來源于地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的酶中的133位His置換為Tyr而獲得的酶(生物化學(xué)雜志，265，15481，1990)。然而，本發(fā)明所用的液化堿性α-淀粉酶與常規(guī)液化堿性α-淀粉酶有低度的氨基酸同源性。在這些α-淀粉酶中，對應(yīng)于177位Arg-178位Gly殘基的位點已經(jīng)缺失，對應(yīng)于133位His的氨基酸已是Tyr。因此，常規(guī)酶的例子不總是適用的。更特別地，本發(fā)明中提高耐熱性的氨基酸序列突變完全不同于迄今為止的實例。
液化堿性α-淀粉酶的實例包括這樣一種酶(日本專利申請?zhí)?62487/1998)，它來源于本發(fā)明者從土壤中分離的芽孢桿菌種KSM-K38(FERM BP-6946)株，具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，和這樣一種來源于芽孢桿菌種KSM-K36(FERM BP-6945)的酶(SEQ ID NO4)(日本專利申請?zhí)?62487/1998)，它與SEQ ID NO1的氨基酸序列有大約95％的同源性。順便提一句，按照Lipman-Pearson法(科學(xué)(Science)，227，1435，1985)計算了氨基酸序列的同源性。
為了獲得根據(jù)本發(fā)明的突變α-淀粉酶，首先從產(chǎn)生液化α-淀粉酶的微生物中克隆了編碼液化α-淀粉酶的基因。作為其方法，可以使用普通的基因重組法。例如，可以使用日本專利申請
發(fā)明者遠(yuǎn)藤圭二, 五十嵐一曉, 林康弘, 萩原浩, 尾崎克也, 一曉, 也 申請人:花王株式會社