一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種能夠高產(chǎn)桿菌肽的攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株DW2(pHY300-cysE)，該菌株保藏在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCCNO：M2013402，保藏日期為2013年9月10日。本發(fā)明的攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cysE的地衣芽孢桿菌在桿菌肽中的應(yīng)用，其應(yīng)用步驟包括：A菌種活化，B種子發(fā)酵，C生產(chǎn)發(fā)酵。本發(fā)明使菌體桿菌肽產(chǎn)量提高了7%。
【專利說明】一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌工程菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]桿菌肽為淡黃色或類白色粉末，無嗅，味苦，是由10種氨基酸、12個氨基酸殘基構(gòu)成的多肽類抗生素，可有效抑制革蘭氏陽性病原菌和部分革蘭氏陰性菌。桿菌肽擁有在腸道內(nèi)幾乎不吸收，排泄迅速，體內(nèi)不殘留等優(yōu)點，因此被廣泛添加于飼料中。
[0003]目前，桿菌肽大多通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，其主要生產(chǎn)菌株為地衣芽孢桿菌{Bacillus 7icA<9/7i/br?i5.)和枯草芽抱桿菌 ijiacillus subtilis)。桿菌妝發(fā)酵過程中，氨基酸底物的供應(yīng)對其產(chǎn)量具有重要的影響，合理及充分的氨基酸供應(yīng)可以提高桿菌肽的產(chǎn)量。
[0004]有研究表明某些氨基酸(例如半胱氨酸)的補(bǔ)料對于桿菌肽的產(chǎn)量有促進(jìn)作用。但是，目前，在桿菌肽微生物發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域，大多數(shù)研究者和廠家采用向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加半胱氨酸的方式(補(bǔ)料添加方式)來實現(xiàn)桿菌肽生產(chǎn)菌株生長過程中半胱氨酸的供應(yīng)，從而提高桿菌肽的產(chǎn)量。但是，此通過半胱氨酸補(bǔ)料添加方式提高桿菌肽產(chǎn)量的方式存在諸多缺點:(I)桿菌肽產(chǎn)量依然較低；(2)半胱氨酸添加的量較大時，在培養(yǎng)基中溶解需要一定時間，未完全溶解的半胱氨酸容易沉積，堵塞發(fā)酵罐的管道口 ；(3)人工往培養(yǎng)基中添加半胱氨酸，會打亂生產(chǎn)菌株的正常代謝，影響菌株的生長周期，也容易造成染菌；(4)半胱氨酸的需求添加量由發(fā)酵罐中菌的個數(shù)決定,而發(fā)酵罐中菌量增加迅速,因此,半胱氨酸的加入量難以確定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種能夠高產(chǎn)桿菌肽的攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
[0006]一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株，所述菌株為地衣芽孢桿菌Dff2 (ρΗΥ300-^5^)[英文名稱為licheniformis DW2 (pHY300-cj^i?)]，該菌株保藏在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO:M 2013402，保藏日期為2013年9月10日。
[0007]一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟:(I)從原始地衣芽孢桿菌DW2 [英文名稱為'B.licheniformis DW2]的總DNA中擴(kuò)增出基因(即乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)片段；(2)在基因片段上游連接啟動子、下游連接終止子，構(gòu)成完整的表達(dá)元件；(3)在表達(dá)元件的前、后分別加上及^7? 1、Hind JJJ酶切位點，構(gòu)成目的基因片段；(4)采用mmnd JJJ限制性內(nèi)切酶分別對目的基因片段和質(zhì)粒pHY300PLK進(jìn)行酶切，得到1284bp的cysE片段和4870 bp的線性質(zhì)粒片段；(5)將此1284bp的cysE片段和4870 bp的線性質(zhì)粒片段經(jīng)DNA連接酶連接，得到表達(dá)載體pHY300-cysE ; (6)將表達(dá)載體pHY300_cysE轉(zhuǎn)入漢licheniformis DW2,以四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性為篩選標(biāo)記，篩選得到攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌DW2[英文名稱為-,Bacillus licheniformis DW2 (pHY300-cj^i?)]。
[0008]其中，所述的原始地衣芽孢桿菌DW2[英文名稱為:Bacillus licheniformisDW2]，保藏在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2011344，保藏日期為2011年10月12日。
[0009]所述的啟動子優(yōu)選采用p43啟動子，p43啟動子為基因工程領(lǐng)域常用的啟動子，不僅表達(dá)可靠，并且，P43啟動子屬于組成型啟動子，此種類型的啟動子不受組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)的影響，適用性強(qiáng)。
[0010]所述的終止子優(yōu)選采用淀粉酶終止子，淀粉酶終止子的基因序列容易獲得。當(dāng)所述的啟動子采用p43啟動子，同時，所述的終止子采用淀粉酶終止子時，所得到的完整表達(dá)元件為1284bp的基因片段、目的基因片段為1302bp的基因片段。
[0011]在基因片段上游連接P43啟動子、下游連接淀粉酶終止子(amyl)均采用重疊延伸PCR進(jìn)行。當(dāng)然，采用酶切酶連的方式也可達(dá)到同樣的效果，但是卻容易引起基因移碼、表達(dá)效率下降等問題。
[0012]本發(fā)明的攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌在桿菌肽中的應(yīng)用，其應(yīng)用步驟包括:A菌種活化，B種子發(fā)酵，C生產(chǎn)發(fā)酵。
[0013]較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
(1)本發(fā)明首次通過在地衣芽孢桿菌的表達(dá)載體PHY300PLK中連接上絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cysE構(gòu)建工程菌株的方式，來達(dá)到提高桿菌肽產(chǎn)量的目的；
(2)由于半胱氨酸為胞內(nèi)生產(chǎn)，提高了半胱氨酸的利用率，同時，不會造成發(fā)酵罐的堵
塞；
(3)半胱氨酸可以源源不斷的生產(chǎn)，無需人工添加，不僅可避免人工添加造成的染菌，也避免打擾菌體的正常生長；
(4)本發(fā)明構(gòu)建的工程菌株出現(xiàn)了二次生長和三次生長，提高了菌株的生長代謝周
期；
(5)本發(fā)明采用的培養(yǎng)基降解后，產(chǎn)生的除半胱氨酸以外的桿菌肽合成必需氨基酸產(chǎn)量均較高，半胱氨酸的產(chǎn)量低，而本發(fā)明構(gòu)建的菌株具有增強(qiáng)半胱氨酸表達(dá)的作用，因此，本發(fā)明的菌株與現(xiàn)有技術(shù)(公布號為CN 103146629 A的專利文件)中的發(fā)酵培養(yǎng)基配方的組合，使菌體桿菌肽產(chǎn)量提高了 7%左右。
[0014]雖然，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，容易想到采用向受體菌中轉(zhuǎn)入攜帶具有增強(qiáng)半胱氨酸表達(dá)的基因片段的重組質(zhì)粒來達(dá)到提高半胱氨酸產(chǎn)量的目的，但是，由于半胱氨酸合成階段所涉及到的酶的種類繁多，如何選擇具有增強(qiáng)半胱氨酸表達(dá)的基因片段是一個大難題。并且，本發(fā)明人試驗的過程中發(fā)現(xiàn)有些與半胱氨酸合成有關(guān)的酶的基因的加入并不能起到提高半胱氨酸產(chǎn)量的作用。而本發(fā)明經(jīng)過無數(shù)次的試驗，才發(fā)現(xiàn)采用絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因構(gòu)建重組質(zhì)?？捎行岣甙腚装彼岬暮?。并且，也并不是所有的能夠產(chǎn)生桿菌肽的地衣芽孢桿菌均可以通過本發(fā)明的技術(shù)方案實現(xiàn)提高桿菌肽的產(chǎn)量，原因在于:半胱氨酸僅僅是桿菌肽合成所必需的氨基酸之一，因此，受體菌自身是否能夠足量表達(dá)除半胱氨酸以外的桿菌肽合成必需氨基酸或培養(yǎng)基是否能夠足量提供除半胱氨酸以外的桿菌肽合成必需氨基酸對本發(fā)明的技術(shù)效果有很大的影響。即本發(fā)明采用原始地衣芽孢桿菌DW2作為受體菌非常關(guān)鍵。本 申請人:通過以絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cysE作為目的基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒，增強(qiáng)了絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶在菌體內(nèi)的表達(dá)量，增強(qiáng)半胱氨酸在菌體內(nèi)的合成效率，并且，構(gòu)建的工程菌株出現(xiàn)了二次生長和三次生長，同時，通過采用地衣芽孢桿菌DW2作為受體菌，最終，使菌體桿菌肽產(chǎn)量提高了 7%左右。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為表達(dá)載體pHY300_cysE的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖 2 為 Bacillus licheniformis Dff2 (pHY300-cysE)瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖 3 為發(fā)酵培養(yǎng)基中l(wèi)icheniformis Dff2 (pHY300-cysE)的生長曲線。
【具體實施方式】
[0016]一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株，所述菌株為地衣芽孢桿菌Dff2 (PHY300-CYSE)[英文名稱為.,Bacillus licheniformis DW2 (pHY300-cysE)]，該菌株保藏在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO:M 2013402，保藏日期為2013年9月10日。
[0017]一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟:(I)從原始地衣芽孢桿菌菌株DW2[英文名稱為.Μ.licheniformis DW2]的總DNA中擴(kuò)增出基因(即絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)片段；(2)在基因片段上游連接p43啟動子、下游連接淀粉酶終止子(amyl),構(gòu)成1284bp的完整表達(dá)元件；(3)在表達(dá)元件的前、后分別加上及EcoR I、Hind III酶切位點，構(gòu)成1302bp的目的基因片段；(4)采用EcoR I和Hind III限制性內(nèi)切酶分別對目的基因片段和質(zhì)粒pHY300PLK進(jìn)行酶切，得到1284bp的片段和4870 bp的線性質(zhì)粒片段；(5)將此1284bp的片段和4870bp的線性質(zhì)粒片段經(jīng)DNA連接酶連接，得到表達(dá)載體pHY300-cysE (如圖1所示，其中，圖1中的or1-177和or1-pAMa I為兩個轉(zhuǎn)錄起始基因、p43為p43啟動子基因、cysE為絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、amyl為淀粉酶終止子基因、Tet為四環(huán)素基因、Amp為氨芐青霉素基因、I為EcoR /酶切位點、Hind III 為 Hind III酶切位點)；(6)將表達(dá)載體pHY300-cysE轉(zhuǎn)入B.licheniformis DW2,以四環(huán)素抗性或氨節(jié)青霉素抗性為篩選標(biāo)記,篩選得到攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株DW2 [英文名稱'B.licheniformisDW2(pHY300-cysE)]。
[0018]其中，所述的原始地衣芽孢桿菌菌株DW2，該菌株保藏在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2011344，保藏日期為2011年10月12日。
[0019]在基因片段上游連接p43啟動子、下游連接淀粉酶終止子(amyl)均采用重疊延伸PCR進(jìn)行。當(dāng)然，采用酶切酶連的方式也可達(dá)到同樣的效果，但是卻容易引起基因移碼、表達(dá)效率下降等問題。
[0020]當(dāng)然，本發(fā)明的啟動子不限于p43啟動子，但是p43啟動子為基因工程領(lǐng)域常用的啟動子，不僅表達(dá)可靠，并且，P43啟動子屬于組成型啟動子，此種類型的啟動子不受組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)的影響，適用性強(qiáng)；本發(fā)明的終止子也不限于淀粉酶終止子，但是，淀粉酶終止子為常見的終止子，基因序列容易獲得。[0021]攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建方法的【具體實施方式】，如下:
1、步驟(1)的具體操作步驟為:
利用設(shè)計的引物，以地衣芽孢桿菌菌株DW2總DNA為模版經(jīng)過普通PCR擴(kuò)增得到cysE基因片段。
[0022]其中，在此普通PCR的反應(yīng)體系中，采用的CjGS萬基因片段的引物序列為: cysE-Ι (即上游引物):GTGTTCTTTAAAATGCTGA、
cysE-2 (即下游引物):TCACAGCTCATCTTCCCTTTC ；
采用的普通PCR反應(yīng)體系組成為:模版(總DNA) lul、fastPfu酶0.5ul、上下游引物各IuUfastPfu酶buffer 5ul和ddH20 17.5ul，總體系:25ul ;采用的普通PCR反應(yīng)條件為:95°C IOmin ；95°C 45s ；58°C 45s ；72°C 30s ;循環(huán)數(shù) 30 ;72°C IOmin0
[0023]2、步驟(2)的具體操作步驟為:
步驟(2)由以下構(gòu)建步驟組成:①采用普通PCR擴(kuò)增獲得p43啟動子基因片段；②通過普通PCR擴(kuò)增獲得淀粉酶終止子(amyl)基因片段采用重疊延伸PCR (SOEPCR)在cysE基因片段上游連上P43啟動子片段、在基因下游連上淀粉酶終止子片段。
[0024]其中，在步驟(2)-①的普通PCR反應(yīng)體系中，p43啟動子的引物序列為: p43-l (即上游引物):GGGAATTCGCGGAATTTCCAATTTCATG、
p43-2 (即下游引物):GTGTACATTCCTCTCTTACC。
[0025]在步驟(2)-②的普通PCR反應(yīng)體系中，淀粉酶終止子的引物序列為: amyl-1 (即上游引物):CCAAGCTTGATCACCCGCGATACCGTCA、
amyl-2 (即下游引物):AAGATAGAAGAGCAGA。
[0026]步驟(2)-③的SOEPCR反應(yīng)體系中，引物序列為: amyl-1: CCAAGCTTGATCACCCGCGATACCGTCA、
p43-l:GGGAATTCGCGGAATTTCCAATTTCATG、
cysE-SOE-1: AGGTAAGAGAGGAATGTACACGTGTTCTTTAAAATGCTGAAA、
cysE-S0E-2:CCTCTCTGCTCTTCTATCTTTCACAGCTCATCTTCCCTTTC;
在步驟(3)-③中，首先，采用p43-l與cysE-SOE-1作為引物、步驟(2)-①獲得的p43啟動子基因片段為模板，通過普通PCR擴(kuò)增獲得p43啟動子進(jìn)行SOE的片段；同時，采用cysE-SOE-Ι與cysE-S0E_2作為引物、步驟(1)獲得的基因片段作為模板，通過普通PCR擴(kuò)增獲得進(jìn)行SOE的片段；采用cysE-SOE-2與amyl-1作為引物、步驟(2)-②獲得的淀粉酶終止子基因片段作為模板，通過普通PCR擴(kuò)增獲得淀粉酶終止子進(jìn)行SOE的片段。然后，按照SOEPCR的具體操作步驟:配好不加入引物的體系(此體系的組成為:各片段Iul、fastPfu 酶:0.5ul、fastPfu 酶 buffer:5ul、ddH20: 14.5ul,即 23ul 的體系)，進(jìn)行以下 PCR:95°C 10min、95°C 45s,58°C 45s,72°C 30s、循環(huán)數(shù)為 7，然后保持 72°C 10 min，此時，加入上下游引物(P43-1和amyl-1各Iul);再進(jìn)行以下PCR:95°C 45s,58°C 45s,72°C30s、循環(huán)數(shù)23-25，得到完整的表達(dá)元件，此表達(dá)元件為1284bp的基因片段。
[0027]步驟(3 )中所涉及到的所有普通PCR的其他組成、反應(yīng)條件均于步驟(1)中的普通PCR相同。
[0028]3、步驟(3)的具體操作步驟為:采用普通PCR方式在步驟(2)所得到的完整表達(dá)元件的前、后加上酶切位點，具體為通過設(shè)計引物序列時，在前后加入酶切位點序列的方式來實現(xiàn)，制得目的基因片段，此目的基因片段為1302bp的基因片段。此處完整表達(dá)元件的引物設(shè)計的方式為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，在此不做贅述。
[0029]4、步驟(4)的具體操作步驟為:
采用EcoR 1、Hind III限制性內(nèi)切酶對目的基因片段進(jìn)行雙酶切，得到1284bp的片段，并，產(chǎn)物回收1284bp的片段。其中，酶切體系:水26ul、目的基因片段15ul、10XK buffer EcoR I 2u\、Hind III 2ul ;酶切條件:溫度 37°C，時間 8 小時。EcoR UHind III為DNA限制性內(nèi)切酶，IOXK buffer為配套的限制性內(nèi)切酶緩沖液。及^7?UHind III以及IOXK buffer均購自寶生物工程(大連)有限公司。產(chǎn)物回收可采用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物純化及膠回收試劑盒(樹脂型)進(jìn)行回收。
[0030]同時，采用EcoR 1、Hind III限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒pHY300PLK進(jìn)行雙酶切，得到4870 bp線性質(zhì)粒片段，并，產(chǎn)物回收4870 bp的質(zhì)粒片段。其中，酶切體系為水26ul、PHY300PLK 15ul、10XK buffer buUEcoR I 2\xl,HincIlll 2ul，酶切條件為溫度 30°C、時間8小時。
質(zhì)粒pHY300PLK質(zhì)粒為購自寶生物工程(大連)有限公司的商業(yè)質(zhì)粒。產(chǎn)物回收可采用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物純化及膠回收試劑盒(樹脂型)進(jìn)行回收。
[0031]5、步驟(5)的具體操作步驟為:
將1284bp的cysE片段和4870 bp的線性質(zhì)粒片段經(jīng)DNA連接酶連接，得到表達(dá)載體pHY300-cysE DNA連接。其中，連接體系為
PHY300PLK雙酶切回收產(chǎn)物(即4870 bp的線性質(zhì)粒片段)I ul、1284 bp 片段 3 ul、10XT4 DNA ligase buffer I ul、T4 DNA ligase 0.5 ul、水
4.5 ul ;連接條件為溫度16°C、時間12小時。
[0032]T4 DNA ligase 為商用的 DNA 連接酶，10XT4 DNA ligase buffer 為配套的連接酶緩沖液。T4 DNA ligase以及10XT4 DNA ligase buffer均購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0033]6、步驟(6)的具體操作步驟為:
首先，制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟為:將大腸桿菌菌種從甘油管以體積比1%接種于5ml LB培養(yǎng)基，于37° C，250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；1%接種于50 mL LB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)2-4 h;將菌液置冰上10 min，使菌液冷卻，倒入50 mL離心管中，4° C 5000r/min 離心 3 min,棄上清；用 20 mL 預(yù)冷的 CaCl2 (0.1 mol/L)洗漆沉淀，4° C 5000 r/min離心3 min,棄上清；用1.5 mL預(yù)冷的CaCl2 (0.1 mol/L)重懸沉淀,分裝于無菌1.5 mL離心管中，置-70° C保存?zhèn)溆谩?br> [0034]其次，將表達(dá)載體pHY300-CysE轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，具體步驟為:取100-200 μ L大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞與連接產(chǎn)物(即表達(dá)載體pHY300-CysE)混合，冰上吸附15 min;將離心管放 到42° C循環(huán)水浴中熱激90 s ;快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻5 min ;每管加800 μ L LB培養(yǎng)基，37。C，150 r/min培養(yǎng)45 min ;取200 μ L涂平板，用無菌的涂布棒將菌液均勻涂滿整個平板表面；平板37° C培養(yǎng)，正置30 min后倒置培養(yǎng)12-16 h,可出現(xiàn)菌落。[0035]然后，對大腸桿菌中的pHY300-cj^進(jìn)行提取，具體步驟為:5 mL菌液，離心收集，用STE洗滌一次，加入100 mL Solution I溶液重懸菌體，置于冰上5 min ;加入200 mLSolution II，快速顛轉(zhuǎn)混勻，置于冰上5 min;加入150 mL Solution III混勻，置于冰上5min ； 12000 r/min離心5 min,取上清；加入500 mL苯酹/氯仿震蕩，12000 r/min離心5min,取上清；加入2倍無水乙醇-20° C沉淀2 h, 12000 r/min離心5 min,棄上清；沉淀用70%乙醇洗一遍,去上清,干燥后溶于20-40 mL RNase (20 μ g/mL)中。
[0036]進(jìn)一步，制備地衣芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞:原始地衣芽孢桿菌菌株licheniformis DW2于5mL的LB培養(yǎng)基中，37 °C，200r/min過夜培養(yǎng)；菌液用生長培養(yǎng)基稀釋20倍后，37°C，200rpm~250rpm，培養(yǎng)2~3h后OD6tltl達(dá)到0.5~L O ;將菌液放置于冰上，預(yù)冷lOmin，倒入50mL離心管中，置冰上放置15min后，4°C 5000g離心5min，收集菌體；用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(具體配方)重懸沉淀，洗滌菌體4次；用1/40體積的電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基懸浮菌體，分裝于1.5 mL無菌離心管(約60 μ L/管)，即為感受態(tài)細(xì)胞。
[0037]將pHY300-c_Ff質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入原始地衣芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，具體步驟為:60uL感受態(tài)細(xì)胞加Iul pHY300-cj^i?質(zhì)粒DNA(50 ng/uL)于預(yù)冷的2mm電轉(zhuǎn)杯中放置I~
1.5分鐘；電擊21 kV/cm,時間4.5~5ms ;立即加入ImL恢復(fù)培養(yǎng)基；37°C培養(yǎng)3h后，涂布含四環(huán)素的LB平板，過夜培養(yǎng)。
[0038]最后，采用加入四環(huán)素的培養(yǎng)基對地衣芽孢桿菌菌株進(jìn)行篩選，隨機(jī)挑取3株轉(zhuǎn)化子，分別命名為PEf PE3。并對此三株菌株進(jìn)行鑒定。當(dāng)然，也可采用在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素對菌株進(jìn)行篩選。
[0039]上述鑒定3株轉(zhuǎn)化子的步驟為:抽提菌株中的質(zhì)粒，利用引物 CjsB-R:5f GCGGAATTTCCAATTTCATG 3’、
cysE-L:5’ GATCACCCGCGATACCGTCA 3’
進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證；擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件:95°C 5 min ；95 °C 45sec，55°C60sec，72°C 90sec，30個循環(huán)；72°C延伸10 min。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(如圖2所示)。在圖2中，圖2中泳道1-3分別為轉(zhuǎn)化子PEf PE3的菌落PCR驗證條帶；泳道4為DNA ladder (即標(biāo)準(zhǔn)DNA混合物),泳道4從下至上條帶所對應(yīng)的相對分子量依次為:100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、5000bp ；泳道 5 為 phy300_cysE 質(zhì)粒為模板的陽性對照，泳道6為宿主菌菌落為模板的陰性對照。由圖2可看出，轉(zhuǎn)化子PEfPE3 (即泳道廣3)均能成功擴(kuò)增出CJW萬基因條帶，大小約為1.2 Kb (即大約為1200bp)，與以pHY300-c_F.^質(zhì)粒為模板(即陽性對照，泳道5)擴(kuò)增的產(chǎn)物條帶一致，說明轉(zhuǎn)化子ΡΕ-ΡΕ3成功轉(zhuǎn)化pHY300-c^質(zhì)粒。從成功轉(zhuǎn)化pHY300-c_Ff質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)選取(如選取PE2菌株)，命名為 Bacillus licheniformis DW2 (ρΗΥ300_--_7.^)。
[0040]本發(fā)明的一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株應(yīng)用在桿菌肽發(fā)酵中的應(yīng)用步驟包括:Α菌種活化，B種子發(fā)酵，C生產(chǎn)發(fā)酵。
[0041]所述步驟A菌種活化的菌種活化培養(yǎng)基配方為(g/L):酵母粉31、蛋白胨8~12、NaCl 9~13，pH 7.0-7.4。
[0042]所述步驟A菌種活化的培養(yǎng)條件為從低溫保存的甘油管以體積百分比1%接種于裝有5ml LB培養(yǎng)基的PA瓶中，180~300rpm，37°C培養(yǎng)10~14h。
[0043]所述步驟B種子發(fā)酵的種子發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L):黃豆餅粉8~15、玉米淀粉2.5 ~7.5、CaCO3 0.5 ~2.5、(NH4)2SO4 0.1 ~1.0、花生餅粉 0.5 ~2.5，pH 6.5 ~7.5。
[0044]所述步驟B種子發(fā)酵的培養(yǎng)條件為將經(jīng)步驟A菌種活化后的菌液以體積百分比按1%接種量接種后于180~300 r/min，37°C培養(yǎng)10~12 h。
[0045]所述步驟C生產(chǎn)發(fā)酵的生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L):黃豆餅粉45~50、玉米淀粉18~21、CaC03 5~8、(NH4)2SO4 0.9~1、花生餅粉4~6、玉米漿10~12，pH 6.5~
7.2。
[0046]所述步驟C發(fā)酵的培養(yǎng)條件為500 mL三角瓶裝生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基25~150 mL,將經(jīng)步驟B種子發(fā)酵后的菌液以體積百分比2%接種量接種后，于180~300 r/min, 37°C發(fā)酵培養(yǎng)48 ho
[0047]所述玉米漿可從浚縣永康玉米加工有限公司、魯洲生物科技(山東)有限公司或山東壽光聚能金玉米開發(fā)有限公司等企業(yè)購得，其中，此處的玉米漿采用的是干物質(zhì)含量≥40%的玉米漿產(chǎn)品。
[0048]為了對抗菌肽的產(chǎn)量進(jìn)行測定，本 申請人:對上述步驟(3)生產(chǎn)發(fā)酵后的菌液在50L發(fā)酵罐中進(jìn)行了擴(kuò)大培養(yǎng),即升罐發(fā)酵,并對升罐發(fā)酵過程中各時間點的生物量以及最終的發(fā)酵液效價進(jìn)行了測定。
[0049]升罐發(fā)酵的具體操作為:采用生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，將經(jīng)步驟C生產(chǎn)發(fā)酵后的菌液按體積比1%接種量接種后于180 r/min，37°C培養(yǎng)10~12 h ;采用50 L發(fā)酵罐，裝液量20L，2%的接種量，370C，400 r/min, 2 vvm,從開始發(fā)酵后4小時開始，每隔4小時取樣一次，直到發(fā)酵至培養(yǎng)基PH8.0,時間共為48小時。
[0050]采用稀釋涂平板法測定發(fā)酵過程中各時間點的生物量(參見圖3)，其中，圖3縱坐標(biāo)的cfu指的是菌落形成單位，從圖3可看出，本發(fā)明采用的菌株具有明顯的二次生長甚至有時存在三次生長的特點，具體為:菌株在經(jīng)過了正常的指數(shù)生長進(jìn)入第一次衰亡期之后，又會發(fā)生菌數(shù)快速上升的情況，這種情況被稱為二次生長，而在二次生長后期還存在一個三次生長的趨勢。
[0051]采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液桿菌肽效價。高效液相色譜測定中的樣品制備步驟為:取發(fā)酵液2.0 mL于10 mL的離心管中，加入等體積無水乙醇，充分混合，10000 r/min離心10min，取上清液用0.22 μ m的微孔濾膜過濾后用于測定桿菌肽的色譜效價。高效液相色譜測定中的標(biāo)準(zhǔn)品制備的步驟為:取4 g EDTA用蒸餾水定容到100 mL，用NaOH調(diào)至pH
7.0;取0.1 g桿菌肽鋅標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 mL EDTA溶液，用EDTA溶液做稀釋，制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。高效液相色譜測定中的流動相配置為:溶液A:稱取3.48 g K2HPO4，溶于100mL蒸餾水；稱取13.6 g KH2PO4，溶于500 mL蒸餾水；將2加入I中，調(diào)節(jié)至pH 6.0 ;取100mL3溶液，加入300 mL蒸餾水；溶液B:650 mL甲醇(色譜純)+ 50 mL乙腈(色譜純)；將溶液A和B按350:650的體積混合制備成流動相，并真空抽濾除菌；色譜條件為色譜柱:大連伊利特 BDS (:18柱(4.6 mm X 250 mm, 5 μ m)、柱溫:35°C、流速:1.0 mL/min、檢測波長:254 nm、進(jìn)樣量:20 μ L。
[0052]發(fā)酵液桿菌肽效價的具體計算方式為:首先，測定單位體積效價數(shù)，即單位體積效價(U/ml)=桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品的效價(U /mg) *稱取的桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(mg) /桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液的體積(ml);然后，根據(jù)公式:發(fā)酵液的效價=發(fā)酵液液相測量的峰面積*單位體積效價*稀釋倍數(shù)/桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品峰面積，計算出發(fā)酵液的效價。[0053]為了體現(xiàn)原始菌株的選擇和攜帶基因的選擇對本申請的抗菌肽產(chǎn)量的影響，本 申請人:還列出了 3組進(jìn)行了對比實施例(對比廣3)。另外，本發(fā)明人還以未含攜帶基因的原始地衣芽孢桿菌DW2所對應(yīng)的發(fā)酵液桿菌肽效價為對照組?，F(xiàn)將本發(fā)明的實施例以及對比1-3的工藝參數(shù)以及試驗結(jié)果列舉如下表1。
[0054]表1本發(fā)明的實施例以及對比f 3的工藝參數(shù)以及試驗結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株，所述菌株為地衣芽孢桿菌DW2 (pHY300-cj^i?)[英文名稱為.,Bacillus licheniformis DW2 (pHY300-cj^i?)]，該菌株保藏在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO:M 2013402，保藏日期為2013年9月10日。
2.—種權(quán)利要求1所述的一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟:(1)從原始地衣芽孢桿菌DW2的總DNA中擴(kuò)增出絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因基因片段；(2)在基因片段上游連接啟動子、下游連接終止子，構(gòu)成完整的表達(dá)元件；(3)在表達(dá)元件的前、后分別加上及^7? 1、Hind III酶切位點，構(gòu)成目的基因片段；(4)采用EcoR I取Hind III限制性內(nèi)切酶分別對目的基因片段和質(zhì)粒pHY300PLK進(jìn)行酶切，得到1284bp的cysE片段和4870 bp的線性質(zhì)粒片段；(5)將此1284bp的cysE片段和4870 bp的線性質(zhì)粒片段經(jīng)DNA連接酶連接，得到表達(dá)載體pHY300-CysE ；(6)將表達(dá)載體pHY300-cysE轉(zhuǎn)入漢licheniformis DW2,以四環(huán)素抗性或氨節(jié)青霉素抗性為篩選標(biāo)記，篩選得到攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(2)中所述的啟動子采用p43啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(2)中所述的終止子采用淀粉酶終止子。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(2)中在基因片段上游連接啟動子、下游連接終止子均采用重疊延伸PCR進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌菌株，其特征在于:其在桿菌肽生產(chǎn)中`的應(yīng)用，其應(yīng)用步驟包括:A菌種活化，B種子發(fā)酵，C生產(chǎn)發(fā)酵。
【文檔編號】C12N1/21GK103865862SQ201410063546
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】陳守文, 祁高富, 羅文 , 李俊輝, 樓麗君 申請人:綠康生化股份有限公司