專利名稱：地衣芽孢桿菌外膜蛋白提取工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物制品領域，具體的說是提供一種作為微生物添加劑的地衣芽孢桿
菌外膜蛋白的提取方法。
背景技術：
藥物飼料添加劑的廣泛運用，尤其是抗生素飼料添加劑的利用，在動物防病治病 等方面發(fā)揮重要作用的同時，也給畜牧生產和人類帶來了一定的副作用。首先是抗生素在 殺滅致病菌的同時，也殺滅了對動物機體的有益菌，破壞腸道內微生物的微生態(tài)平衡，導致 動物，特別是幼畜禽對病原微生物的易感性。另外，長期飼喂抗生素會使動物機體內產生具 有耐藥性的細菌，這些細菌對人畜均有害。為此，各國都在積極進行各種新型抗生素替代品 的研究開發(fā)，其中微生態(tài)制劑已目前研究的主要熱點之一。 微生態(tài)飼料添加劑是根據微生態(tài)學理論研制的含有對動物有益微生物的活菌制 劑，它們通過維持動物腸道內微生態(tài)平衡而發(fā)揮作用，具有促進動物生長發(fā)育，提高動物機 體免疫力等多種功能，且無污染、無殘留、無耐藥性和對環(huán)境無害等，是一類新型綠色環(huán)保 飼料添加劑。這些禽畜用的益生菌制劑含有芽孢桿菌，乳酸桿菌，糞鏈球菌，雙歧桿菌，酵母 等，光合細菌和梭狀芽胞桿菌屬的部分菌株及噬菌蛭弧菌等也偶然被用做益生菌添加到仔 豬和仔雞飼料中。 微生態(tài)制劑的作用機理一般認為微生態(tài)制劑對促進畜禽健康的作用機理包括以 下幾個方面l.幫助寄主腸道有益菌群盡快達到或者維持其生態(tài)平衡；2.飽和腸粘膜的吸 附位點，致使病原菌無法在腸粘膜上定植；3.發(fā)酵碳水化合物，產生短鏈脂肪酸等代謝產 物，降低腸道內pH值，從而抑制腸道內發(fā)酵蛋白質的菌群活性，控制其發(fā)酵速度；4.剌激寄 主免疫細胞的活性，提高免疫球蛋白的水平；5.剌激寄主產生多種消化酶，協同寄主增加 對維生素等營養(yǎng)物質的消化吸收。 活菌微生態(tài)制劑在動物養(yǎng)殖中的作用活菌制劑始于上世紀初，有人用酸牛奶來 調整幼畜腹瀉出現的腸道微生物菌群失調。后來，在研究中人們發(fā)現用活菌制劑可防止畜 禽的腹瀉和腸炎，繼之又發(fā)現活菌制劑還可改善動物對飼料的利用，并有利于促進畜禽的 生長發(fā)育和腸道健康，從而擴大了活菌制劑在畜牧生產中的作用和應用前景，概括起來，主 要有以下幾個方面的作用。 改善動物胃腸道微生態(tài)環(huán)境研究表明，動物自身及許多致病菌不會產生各種有 毒物質，如胺、氨、細菌毒素、氧自由基等代謝產物。有些有益菌可以阻止毒性胺和氨的合成 或把它們分解中和細菌毒素，從而避免這些有害物質對動物機體組織細胞的損害作用。一 些好氧菌則通過產生超氧化物歧化酶來消除氧自由基，減少或消除氧自由基對細胞及細胞 器膜質結構的損害。乳酸菌能夠產生有機酸和抗菌物質，降低腸道內pH值和氧化還原電 位，有利于宿主生長發(fā)育和維持腸道健康。 產生有益物質動物微生態(tài)活菌制劑能夠在動物體內產生各種消化酶，合成B族 維生素、維生素K等動物所必需的營養(yǎng)物質；同時能促使動物體增加對腸道內容物中鈣、鎂
3等營養(yǎng)物質的吸收。 建立和維持腸道微生態(tài)平衡研究表明，動物腸道內寄居的微生物，主要為厭氧 菌。通常情況下，腸道內有益菌和致病菌會保持一定比例，當條件發(fā)生改變時，致病菌大量 繁殖引起平衡失調，從而導致動物體患病。當需氧型益生菌進入消化道后，生長繁殖消耗腸 道內大量氧氣，通過"生物奪氧"使需氧型致病菌大幅度下降，因而起到防止動物患病的作 用。研究還發(fā)現，益生菌能夠有秩序地定植于粘膜、皮膚等表面或細胞之間形成生物屏障， 這些屏障可以阻止病原微生物的定植，起著占位、爭奪營養(yǎng)?；ダ采蜣卓棺饔?，形成保
護屏障，阻止病原菌的侵入，從而對致病菌的定植產生抑制作用。 增強動物免疫能力和促進動物生長微生態(tài)制劑可作為非特異性免疫調節(jié)因子， 增強吞噬細胞的吞噬能力和細胞產生抗體的能力，剌激動物產生干擾素，從而增強抗病能 力。據報道，用活菌微生態(tài)制劑——益生素飼喂哺乳仔豬，添加組腹瀉率明顯比對照組減少 (3.91%，P < 0.01)，成活率提高79%。在10 28日齡的仔豬飼料中添加益生素，試驗組 采食量平均比對照組增加70g/d，增重提高4. 2%。又有研究報道，在雛雞中分別飼喂和不 飼喂乳酸桿菌制劑兩個組的基礎上，進行雞的白痢沙門氏菌攻毒試驗。結果表明，飼喂乳酸 桿菌雛雞組與對照組相比，死亡率明顯降低了 20%。還有報道稱在魚蝦飼料中添加微生態(tài) 制劑，可使魚蝦增重提高10% 20%。 在畜牧生產中常用的微生態(tài)添加劑，乳酸菌和芽胞桿菌類益生菌為主要的微生態(tài) 添加劑。細菌細胞膜中的一種重要組成成分外膜蛋白(outer membrane Protein, 0MP)的 免疫作用越來越受到科技人員的關注，并進行了研究。實驗證明，0MP具有良好的免疫原性， 不僅可剌激體液免疫，而且也可剌激細胞免疫作用。0MP有多種提取方法，張曉華等認為不 同研究者得到的同一種細菌0MP的SDS-PAGE圖譜之所以有所不同，與細菌的培養(yǎng)條件、0MP 的制備方法以及菌株的不同有關。不同研究者制備的OMP其免疫效果也不同。本試驗采用超聲 波破壁、離心粗提、SDS沉淀、SDS和PBS再次沉淀、透析、超濾純化提取的地衣芽孢桿菌株0MP。
益生菌膜蛋白的提取方法有多種，在水提醇沉的基礎上，常采用反復凍融、酶解、 超聲波、膜處理等方法進行輔助提取或精制。但這些方法均有一些不足之處反復凍融的缺 點在于費時費力，且細胞破裂率低，有效利用低，不易純化；超聲波提取膜蛋白的優(yōu)勢是提 取時間短，勿須加熱，提取量多；酶解法提取缺點在于必須要有合適的pH、溫度，有效破比 率低，提取量有限不利于工業(yè)化生產；超濾膜技術應用的缺點是必須知道目的膜蛋白的相 對分子質量才能選取有效超濾膜，否則須預選確定選膜，單采用一種膜分離效果有限。超濾 與微濾、納濾、反滲透及電滲析等多種性能的膜技術進一步聯用，取代能耗大、費用高、周期 長且處理不徹底的傳統(tǒng)工藝操作，將是多糖提取工藝發(fā)展的新趨勢；離子交換技術缺點在 于根據膜蛋白特性選擇不同的柱型、洗脫劑種類、pH值和洗脫速率，同樣提取量有限不利于 工業(yè)化生產。 因此，為了在最大限度保持蛋白活性的基礎上提取乳酸桿菌外膜蛋白，使多糖的 生物學功能研究更為準確，同時為了適用于工業(yè)化生產的需求，需要一種簡單、實用、經濟、 高效的乳酸桿菌外膜蛋白的提取方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一個發(fā)明目的是提供一種地衣芽孢桿菌外膜蛋白的提取方法，包括
(1)利用超聲波進行地衣芽孢桿菌細胞的破壁；(2)粗提物進行6000rpm， 15min離心，取上清液2L ; (3)在上清中加15ml 2%十二烷酰肌氨酸鈉溶液充分混勻，室溫作用lh，于 4°C 100， OOOr/min超速離心lh ; (4)將沉淀用0. 6mL 0. lmoL/L PBS(pH7. 4)和等量2%十二烷酰肌氨酸鈉溶解，室 溫作用2h，于4t: 100， OOOr/min超速離心lh，將沉淀適量的溶于0. lmoL/L PBS(pH7. 4)中;
(5)經過透析、超濾處理后，分裝。 在一個具體實施方案中，所述的高壓細胞破碎機的工作參數，優(yōu)選功率450w、破碎 時間2s、間斷l(xiāng)s、反復破碎80次。 在另一個具體實施方案中，所述的超濾，優(yōu)選使用0. 45 ii m的微孔濾膜或截留分 子量為8600道爾頓的超濾膜(層析柱等)。
有益效果 1、超聲波提取時間短，勿須加熱，破壁效果好，破壁率高，因此能獲得較多的膜蛋 白粗提物； 2、超聲波提取過程是一個物理過程，破壁過程會產熱，因此要在盛放菌的容器外 放冰水降溫，超聲過程中無化學反應，破壁物在短時間內保持不變，生物活性不減，同時提 高了破碎速度，縮短了破碎時間，可極大地提高提取效率； 3、經過幾次離心后去除大量破壁后的細胞碎片及一些雜蛋白，再經過超濾后達到 了有粗提到精提的效果； 4、經過試驗發(fā)現，所得的地衣芽孢桿菌外膜蛋白產量為0. 4kg/L，活性為1. 5X 107 活性單位/mg，完全滿足生產需要。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的描述。
實施例1 :地衣芽孢桿菌外膜蛋白的提取 實施方案將地衣芽孢桿菌及培養(yǎng)大量后，先用超聲波破壁，將粗提物進行 6000rpm， 15min離心，取上清液，在上清中加2%十二烷酰肌氨酸鈉溶液充分混勻，室溫作 用lh，于4°C 100， OOOr/min超速離心lh，將沉淀用0. lmoL/L PBS(pH7. 4)和等量2%十二 烷酰肌氨酸鈉溶解，室溫作用2h，于4°C 100， OOOr/min超速離心lh，將沉淀適量的溶于 0. lmoL/L PBS(pH7. 4)中，經過透析、超濾處理后，分裝。
實施例2 :外膜蛋白的產量和活性鑒定 根據實施例1的方法，利用Bradford法測外膜蛋白含量，每2L菌液，最終能得到 0. 8kg外膜蛋白。 另外，根據MTT法活性測定的方法，鑒定外膜蛋白或含有外膜蛋白的微生物添加 劑的活性，操作步驟如下 1、接種細胞用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔103-104個細胞接種于96孔板中，每孔體積 200 ii 1。 2、培養(yǎng)細胞將培養(yǎng)板移入C02培養(yǎng)箱中，在37°C、5% C02及飽和濕度條件下，培
5養(yǎng)3-5天。培養(yǎng)時間取決于實驗目的和要求。 3、呈色培養(yǎng)第3-5天后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20 yl， 37°C ，繼續(xù)孵育4h， 終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)液上清。每孔加入150iilDMS0(二甲基亞砜)，振蕩10min，使 結晶物充分溶解。 4、比色選擇490nm波長，在酶標儀上測定個孔吸收值，記錄結果。
結果發(fā)現外膜蛋白原液的活性為1. 5X 107活性單位/mg ;含有外膜蛋白的微生
物添加劑溶液4X 105活性單位/mg，完全能滿足生產需要。
權利要求
一種用于地衣芽孢桿菌外膜蛋白的提取方法，步驟包括(1)利用超聲波進行地衣芽孢桿菌細胞的破壁；(2)粗提物進行6000rpm，15min離心，3次，取上清液2L；(3)在上清中加15ml 2％十二烷酰肌氨酸鈉溶液充分混勻，室溫作用1h，于4℃100,000r/min超速離心1h；(4)將沉淀用0.6mL 0.1moL/L PBS(pH7.4)和等量2％十二烷酰肌氨酸鈉溶解，室溫作用2h，于4℃100,000r/min超速離心1h，將沉淀適量的溶于0.1moL/L PBS(pH7.4)中；(5)經過透析、超濾處理后，分裝。
2. 權利要求1的方法，其中所述的超聲波的工作參數，優(yōu)選功率450w、破碎時間2s、間 斷l(xiāng)s、反復破碎80次。
3. 權利要求1或2的方法，其中所述的超濾，優(yōu)選使用0. 45 ii m的微孔濾膜或截留分子 量為8600道爾頓的超濾膜(層析柱等)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種作為微生物添加劑的地衣芽孢桿菌外膜蛋白的提取方法，包括超聲波破壁、離心粗提、SDS沉淀、SDS和PBS再次沉淀、透析、超濾純化。其中，所述的超聲波的工作參數，優(yōu)選功率450w、破碎時間2s、間斷1s、反復破碎80次，超濾優(yōu)選使用0.45μm的微孔濾膜或截留分子量為8600道爾頓的超濾膜(層析柱等)。本發(fā)明方法去除大量破壁后的細胞碎片及一些雜蛋白，再經過超濾后達到了有粗提到精提的效果，并且，浸提物在短時間內保持不變，生物活性不減，同時提高了破碎速度，縮短了破碎時間，可極大地提高提取效率，能滿足工業(yè)生產的需要。
文檔編號C07K1/34GK101759771SQ200810154338
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月23日 優(yōu)先權日2008年12月23日
發(fā)明者李旭東, 王小娥, 蘇建東 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司