一種豬干擾素α1與胸腺肽α1融合蛋白的制備技術的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及獸用生物制藥領域，公開了一種豬干擾素α1與胸腺肽α1融合蛋白的制備技術。本發(fā)明的豬干擾素α1與胸腺肽α1融合蛋白制備技術，基本制備過程包括：根據(jù)GenBank已公布的豬干擾素α1（序列號DQ249000）基因序列及胸腺肽α1（序列號770552A）序列，合成擴增引物，融合擴增豬干擾素α1和胸腺肽α1的全基因序列，克隆并誘導表達谷胱甘肽巰基轉移酶-干擾素α1-胸腺肽α1融合蛋白，檢測鑒定，分離純化融合蛋白。該融合蛋白較好地保持了豬干擾素α1和胸腺肽α1各自的生物功能，具有一定的保護細胞免受病毒攻擊的活性和促進細胞表面受體表達的活性，為豬干擾素α1和胸腺肽α1融合蛋白制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術支撐。
【專利說明】一種豬干擾素α1與胸腺肽α1融合蛋白的制備技術
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及獸用生物制藥領域，特別是涉及一種豬干擾素α I與胸腺肽α I融合蛋白的制備技術。
【背景技術】
[0002]干擾素(IFN)是細胞分泌的小膚，具有抗病毒，抗增生和免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生物學活性。與人干擾素(HuIFN)相似的豬干擾素(poIFN)也分為I型和II型。豬干擾素α I(poIFNa I)屬I型干擾素，具有廣譜、高效抗病毒的功能，且具有毒副作用小、速效多能的特點，并對免疫系統(tǒng)起關鍵調(diào)節(jié)作用。種屬特異性是干擾素的基本特性之一，但豬白細胞干擾素(PLeIFN，其主要成分為a干擾素)可在很多異種細胞上表現(xiàn)強的抗病毒活性。羅經(jīng)等發(fā)現(xiàn)，它在人胚肺細胞和在仔豬腎原代細胞上有相同的抗病毒活性[羅經(jīng)等，1980]。也曾有報道豬脾細胞干擾素(PSINF，主要成分為poIFN- a及poIFN_ β )在人胚肺細胞及人胚肌皮細胞株上的抗病毒活性比在仔豬腎原代細胞上高17倍。胸腺肽(THY)是由胸腺的組織上皮細胞分泌的一類多膚激素，其主要活性成份是由28個氨基酸組成的胸腺肽a I(THYa 1)，在不同種屬間高度保守[Franco F I, et al，1992]。主要作為免疫調(diào)節(jié)劑使用，還具有增強NK細胞功能，促進⑶3+、⑶4+、⑶8+細胞增生，抗⑶3+誘發(fā)的細胞凋亡，抑制腫瘤生長等一系列生物功能[Bela B, et al，2000]，研究顯示其在改善臨床癥狀和降低死亡率方面具有明顯的治療效果。細胞因子融合蛋白的應用有可能減少細胞因子單獨使用時的毒副作用[郁子揚，2004]。近幾年研究證實，干擾素和胸腺肽聯(lián)合應用具有協(xié)同促進T細胞生長、增殖、分化和激活NK細胞活性等功能，可增強機體的免疫能力[曲建慧等，2006 ；王淑彩等，2002]。
[0003]我國是世界養(yǎng)豬第一大國，同時也是豬病多而復雜的國家。豬的疾病，尤其是病毒性疾病嚴重地危害著我國畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，部分人畜共患病毒病還直接危害人類的健康。針對這一日趨嚴重的問題，迫切需要生產(chǎn)一種針對于豬的疾病，具有生物活性高，廣譜抗病毒的藥物，目前臨床上治療病毒性疾病主要應用高免血清，治療藥物比較單一。IFNa I和THYa I均具有廣譜抗病毒作用，二者融合蛋白生物制劑的研制一方面可以簡化生產(chǎn)工藝，顯著降低生產(chǎn)成本；另一方面IFNa I和THYa I融合蛋白的聯(lián)合應用能顯著提高IFN和THY抗病毒的功效。本研究通過DNA重組技術構建豬IFN a I與THY a I融合基因表達載體，建立原核表達系統(tǒng)，分離純化目的蛋白，為IFNa I和THYa I融合蛋白制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于制備和分離純化豬干擾素a I與胸腺肽a I融合蛋白。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種豬干擾素a I與胸腺肽a I融合蛋白的制備技術，基本過程如下:根據(jù)GenBank已公布的豬干擾素α I (序列號DQ249000)基因序列及胸腺肽α I (序列號770552Α)序列，合成擴增引物，融合擴增豬干擾素α I和胸腺肽α I的全基因序列，克隆并誘導表達谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)-干擾素α 1-胸腺肽α I融合蛋白，檢測鑒定，分離純化融合蛋白。
[0006]進一步的，所述的豬干擾素α I和胸腺肽α I的全基因序列是通過過橋PCR融合擴增的，所述的過橋PCR是通過4條引物實現(xiàn)的，所述引物的序列分別為引物1:5，-CATATGTGCGATCTGCCGCAGACCC-3，；引物 2:5，-CGAGCCGCCGCCGCCGCCGCGCGCCGAGCCGCCGCCGCCCAGATTACGGCTGCTGCTAAACGC-3，；引物 3:5，-GGCGGCGGCGGCTCGGCGCGCGGCGGCGGCGGCGGCTCGTCGGATGCGGCGGTGGAT-3，；引物 4:5，-CTCGAGTCATTAATTTTCCGCTTCTTCC-3，。
[0007]進一步的，所述的豬干擾素α I和胸腺肽α I的全基因序列與載體連接克隆表達，所述載體是PMD18-T和pGEX4T。
[0008]進一步的，所述的豬干擾素α I和胸腺肽α I的全基因序列在LB液體培養(yǎng)基中用IPTG誘導表達，所述IPTG的濃度為0.5^5 mmol/L，所述的LB液體培養(yǎng)基含Amp、
[0009]進一步的，所述的檢測鑒定中使用的二抗是HRP-羊抗鼠IgG。
[0010]再進一步的，所述的融合蛋白分離純化方法采用親和柱層析法。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
(O該融合蛋白制備技術的原料來源安全充足，生產(chǎn)成本低；制備過程簡單，可操作性強，可進行大規(guī)模進行生產(chǎn)。
[0012](2)制備的融合蛋白安全、穩(wěn)定、純度高，較好地保持了 IFNa I和和THY a I各自的生物功能，具有一定的保護細胞免受病毒攻擊的活性和促進細胞表面受體表達的活性，為IFNa I和THYa I融合蛋白制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術支撐。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0014]實施例1
本實施例中制備豬干擾素a I與胸腺肽a I融合蛋白過程中，誘導融合蛋白表達的IPTG 的濃度為 0.5 mmol/ L。
[0015]1.引物設計
查得GenBank已發(fā)表豬IFNa I (序列號DQ249000)成熟肽基因序列及THYa I (序列號770552A)蛋白序列，密碼子偏愛性優(yōu)化后，依據(jù)優(yōu)化后的基因序列，利用Primer Premier5.0軟件設計SOE-PCR引物，引物分別為:
引物 1:5，-CATATGTGCGATCTGCCGCAGACCC-3，；
引物 2:5， -CGAGCCGCCGCCGCCGCCGCGCGCCGAGCCGCCGCCGCCCAGATTACGGCTGCTGCTAAACGC-3，；
引物 3:5，-GGCGGCGGCGGCTCGGCGCGCGGCGGCGGCGGCGGCTCGTCGGATGCGGCGGTGGAT-3，；
引物 4:5’ -CTCGAGTCATTAATTTTCCGCTTCTTCC-3’。
[0016]同時在引物I和引物4中分別引入Nde I及Xho I酶切位點。
[0017]2.豬IFNa 1-THY a I融合基因克隆載體的構建利用含有優(yōu)化后poIFNa I基因的質(zhì)粒為模板，以引物I和引物2為引物進行PCR擴增，獲得135 bp的poIFNa 1-1inker基因。再利用含有優(yōu)化后THY a I基因的質(zhì)粒為模板，以引物3和引物4為引物進行PCR擴增，獲得519 bp的Linker-THY a I基因。將2次PCR的產(chǎn)物各取I μ L混合作為模板，引物I和引物4為引物進行PCR擴增，得到615 bp的片段，回收目的片段并連接至PMD18-T Simple載體。轉化感受態(tài)DH5A，涂布于Amp+平板，37°C培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，擴大培養(yǎng)。提取重組克隆質(zhì)粒，PCR及酶切鑒定，均得到615 bp的目的片段，送南京金思瑞公司進行測序，鑒定陽性的重組質(zhì)粒命名為pMDlS-T-1FNa 1-THYa I。
[0018]3.豬IFNa 1-THY a I融合基因表達載體的構建
將測序正確的PMD18-T-1FN a 1-THY a I經(jīng)Nde I及Xho I雙酶切后，，回收目的基因，連接至PGEX4T-1原核表達載體，轉化BL21 (DE3)感受態(tài)，提取重組質(zhì)粒，PCR鑒定得到615 bp的目的片段，雙酶切鑒定也得到615 bp的目的片段，將陽性克隆名為PGEX4T-1FNa 1-THY a I。
[0019]4.pGEX4T-1FN a 1-THY a I 在 E.coli 中的誘導表達及 Western blot 檢測
以陽性BL21 (DE3)菌株接種于含Amplr的LB液體培養(yǎng)基，37 °C振蕩培養(yǎng)至0D600為
0.6~1.0時，用濃度為0.5臟01/1 IPTG于37°C分別誘導培養(yǎng)4 h。離心I mL培養(yǎng)液收集菌體。將菌體重懸于10%的SDS溶液中加等量的蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，煮沸5 min后進行SDS-PAGE，然后用考馬斯亮藍R-250染色觀察目的條帶。將進行SDS-PAGE后的凝膠轉至PVDF膜上，37°C封閉2 h，洗膜后加入鼠抗GST單抗于37°C溫育2 h，洗膜后加HRP-羊抗鼠IgG于37°C溫育I h，洗去二抗后用DAB顯色，結果分子量約為22.0 kD的融合蛋白成功表達，且為菌體內(nèi)可溶性表達，蛋白存在于菌體裂解液上清中。
[0020]5.GST-1FNa 1-THYa I目的蛋白分離純化
收集誘導表達后的菌液，8000 r/min離心10 min收集菌體，按10 mL/g將菌體細胞重懸于pH 8.0的PBS緩沖液中，洗菌體I次，8000 r/min離心10 min收集菌體，按6 mL/g將菌體重懸于pH 8.0的PBS緩沖液中，冰浴中超聲破菌。超聲條件為:功率200 W，超聲時間30 S，間隔時間60 S，全程工作時間為30 min。超聲裂解液在4°C 12000 r/min離心30min，收集包涵體。每克包涵體加入約10 mL的洗滌緩沖液，而后4°C攪拌2 h，12000 r/min離心20 min后取上清和沉淀。沉淀重懸于2 mol/L 10 mL尿素中，于4°C 12000 r/min離心10 min,收集沉淀,保留上清,用2 mol/L尿素再重懸沉淀于4°C 12000 r/min離心10min,收沉淀,保留上清,8 mol/L尿素于4°C溶解包涵體,2.5 h后，于4°C 12000 r/min離心20 min，棄沉淀要上清。8 mol/L尿素溶解的包涵體離心上清按1:9 (體積比)加復性液放于4°C復性20 h。4°C 12000 r/min離心20 min收集上清加濃HCl調(diào)pH至5.3，4°C放置2h，再加 4 mol/L NaOH 調(diào) pH 至 7.5，用 2000 mL 10 mmol/L PBS (ρΗ7.5)于 4°C透析 24 h,中間更換2次透析液。采用Walterson GST-Resin KU，型號HG3022A GST的層析親和柱，純化得到了 GST-1FNa 1-THY a I融合蛋白。
[0021]6.1FNa 1-THY a I 目的蛋白純化 取上步蛋白純化液以5000 U/L終濃度的凝血酶4 °C酶切24 h，經(jīng)純化獲得IFNa 1-THYa I目的蛋白，以碧云天BCA蛋白檢測試劑盒測定目的蛋白含量，豬IFNa 1-THYa I融合蛋白濃度約為105 mg/ L。將收集的豬IFNa 1-THY a I融合蛋白洗脫液以PEG (Mr 6000)洗縮至所需體積，加入0.02% NaN3防腐劑，于4°C保存?zhèn)溆?。[0022]實施例2
本實施例中制備豬干擾素α I與胸腺肽α I融合蛋白過程中，誘導融合蛋白表達的IPTG的濃度為I mmol/ L。豬干擾素α I與胸腺肽α I融合蛋白制備技術與實施例1的相同。
[0023] 結果純化獲得IFNa 1-THYa I目的蛋白，以碧云天BCA蛋白檢測試劑盒測定目的蛋白含量，豬IFNa 1-THYa I融合蛋白濃度約為120 mg/ L。將收集的豬IFNa 1-THY a I融合蛋白洗脫液以PEG (Mr 6000)洗縮至所需體積，加入0.02% NaN3防腐劑，于4°C保存?zhèn)溆谩?br> 【權利要求】
1.一種豬干擾素α I與胸腺肽α I融合蛋白的制備技術，其特征在于制備的基本過程如下:根據(jù)GenBank已公布的豬干擾素ct I (序列號DQ249000)基因序列及胸腺妝α I (序列號770552Α)序列，合成擴增引物，融合擴增豬干擾素α I和胸腺肽α I的全基因序列，克隆并誘導表達谷胱甘肽巰基轉移酶-干擾素α 1-胸腺肽α I融合蛋白，檢測鑒定，分離純化融合蛋白。
2.按權利要求1所述的豬干擾素αI與胸腺肽α I融合蛋白的制備技術，其特征在于:所述的豬干擾素α I和胸腺肽α I的全基因序列是通過過橋PCR融合擴增的，所述的過橋PCR是通過4條引物實現(xiàn)的，所述引物的序列分別為引物1:5，-CATATGTGCGATCTGCCGCAGACCC-3，；引物 2:5，-CGAGCCGCCGCCGCCGCCGCGCGCCGAGCCGCCGCCGCCCAGATTACGGCTGCTGCTAAACGC-3，；引物 3:5，-GGCGGCGGCGGCTCGGCGCGCGGCGGCGGCGGCGGCTCGTCGGATGCGGCGGTGGAT-3，；引物 4:5，-CTCGAGTCATTAATTTTCCGCTTCTTCC-3，。
3.按權利要求1所述的豬干擾素αI與胸腺肽融α I合蛋白的制備技術，其特征在于:所述的豬干擾素α I和胸腺肽α I的全基因序列與載體連接克隆表達，所述載體是pMD18-T和 pGEX4T。
4.按權利要求 1或3所述的豬干擾素αI與胸腺肽α I融合蛋白的制備技術，其特征在于:所述的豬干擾素α I和胸腺肽α I的全基因序列在LB液體培養(yǎng)基中用IPTG誘導表達，所述IPTG的濃度為0.5~5mmol/L，所述的LB液體培養(yǎng)基含Amp、
5.按權利要求1所述的豬干擾素αI與胸腺肽融α I合蛋白的制備技術，其特征在于:所述的檢測鑒定中使用的二抗是HRP-羊抗鼠IgG。
6.按權利要求1所述的豬干擾素αI與胸腺肽α I融合蛋白的制備技術，其特征在于:所述的融合蛋白分離純化方法采用親和柱層析法。
【文檔編號】C12N15/70GK103937828SQ201410063007
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年2月25日 優(yōu)先權日:2014年2月25日
【發(fā)明者】王占偉, 孫玉賢, 武昱孜 申請人:南京洲邦生物科技有限公司