專利名稱：鑒別純化后的胸腺肽α1是否含有缺失肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胸腺肽a I的質(zhì)量檢測方法，尤其涉及一種鑒別純化后的胸腺肽a I是否含有缺失肽的方法，屬于胸腺肽a I的固相合成和檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胸腺肽a I是從胸腺素組分5 (TF-5)中分離出的一種活性多肽，由28個氨基酸殘基組成，分子量為3108.37。在TF-5中，胸腺肽a I的含量為0.6%，是人體胸腺激素的重要活性組分。例如胸腺肽a I可調(diào)節(jié)T淋巴細胞發(fā)育、分化和成熟。此外，胸腺肽a I能修復(fù)受損的T淋巴細胞。雖然從TF-5中分離的胸腺肽a I無明顯毒副反應(yīng)，但由人工固相合成的市售胸腺肽a I可因不純而造成不良反應(yīng)。目前，人工固相合成胸腺肽aI的操作規(guī)程于篇律，幾乎沒有優(yōu)化空間。市售的保護氨基酸和相關(guān)試劑的純度也足以支持人工固相合成高純度胸腺肽a I。在操作規(guī)程不出差錯的前提下，人工固相合成的胸腺肽a I是否純，取決于它含的缺失肽的狀況。與小分子藥物不同，多肽的生物活性非常強。在人工固相合成的胸腺肽a I中，SP使存在微量的缺失肽也可造成嚴重的毒副作用?？刂迫斯す滔嗪铣傻男叵匐腶 I的質(zhì)量的關(guān)鍵是控制缺失肽。目前國內(nèi)外即沒有披露人工固相合成的胸腺肽a I中的缺失肽狀況，也沒有公開測定人工固相合成的胸腺肽a I中的缺失肽的方法。這種狀態(tài)不適應(yīng)胸腺肽a I的臨床地位。為了改善這種狀況，保障胸腺肽a I的臨床用藥安全性，形成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供種能夠準確、靈敏的檢測鑒別純化后的胸腺肽a I是否含有缺失肽的方法；本發(fā)明的另一個目的是提供純化后的胸腺肽a I的缺失肽譜并將該缺失肽譜作為胸腺肽a I固相合成中的質(zhì)量控制物。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種鑒別胸腺肽a I純品是否含有缺失肽的方法，包括以下步驟:(1)將固相合成的胸腺肽a I進行純化；(2)將純化后的胸腺肽a I純品采用LC/MS聯(lián)用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在20.78min時出現(xiàn)峰面積為0.36%的峰或在
27.19min時出現(xiàn)峰面積分別為0.47%的峰，則說明純化后的胸腺肽a I中含有缺失肽。其中，所述缺失肽的氨基酸序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。本發(fā)明中所述的胸腺肽a I純品可以是采用本領(lǐng)域的常規(guī)純化方法進行純化后所得到的純品；作為參考，本發(fā)明中所述的胸腺肽a I純品可以采用以下所述的方法進行兩次純化，其中，第一次純化胸腺肽a I的方法優(yōu)選為:采用配備Waters 2487檢測器、Waters 600泵和迪馬C 18制備柱的制備型HPLC進行純化；紫外檢測波長為215nm，用A和 B 梯度洗脫，流速為 10ml/min,梯度為 0_5min，10 % A/90 % B ；5-10min, 15 % A/85 % B ；10-20min 18% A/82% B ；20-70min 25% A/75% B ;其中 A 為含 0.09% TFA 的乙腈，B 為含0.1% TFA 的水。所述的第二次純化胸腺肽α I的方法優(yōu)選為:采用配備Waters 2487檢測器、Waters 600泵和迪馬C18制備柱的制備型HPLC進行純化；紫外檢測波長為215nm，用乙腈/醋酸/水梯度洗脫，流速為10ml/min，梯度為0_5min，10 %乙腈/I %醋酸/90 %水；5-10min,由10 %乙腈/I %醋酸/90 %水變至15 %乙腈/I %醋酸/85 %水；10_20min，由15%乙腈/I %醋酸/85%水變至18%乙腈/I %醋酸/82%水；20_70min，由18%乙腈/I %醋酸/82%水變至25%乙腈/1%醋酸/75%水。其中，所述純化方法中的迪馬C 18制備柱的規(guī)格優(yōu)選為10μπι、250Χ21.2mm。步驟(2)中所述的梯度洗脫條件優(yōu)選為:用0.1 %甲酸/乙腈進行梯度洗脫，流速為0.4ml/min ;梯度為:0_30min,由0.1 %甲酸/乙腈=90/10變至0.1 %甲酸/乙腈=80/20 ；30-35min,由 0.1 % 甲酸 / 乙腈=80/20 變至 0.1 % 甲酸 / 乙腈=75/25。本發(fā)明方法中LC/MS聯(lián)用儀中的LC采用Agilent 1200自動進樣,Waters XterraRP 18分析柱的規(guī)格為5μπι，3.0X 150mm ;LC/MS聯(lián)用儀中的MS采用Bruker SolatixFT-1CR-MS，離子流檢測器。本發(fā)明進一步提供了胸腺肽α I純品的缺失肽譜，其氨基酸序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示；可將所述的缺失肽作為胸腺肽α I固相合成中的質(zhì)量控制物。本發(fā)明方法可以準確、靈敏的鑒別出胸腺肽α I純品是否含有缺失肽，可以有效地保障和控制胸腺肽α I的質(zhì)量，在制備高純度固相合成胸腺肽α I中有重要應(yīng)用價值。


圖1胸腺肽α I純品的離子流.
圖2胸腺肽α I純品的質(zhì)譜.
圖3胸腺肽α I純品中的缺失肽

Ac-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1 Ie-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(SEQ ID N0.1)的質(zhì)譜。 圖4胸腺肽α I純品中的缺失肽Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(SEQ ID N0.2)的質(zhì)譜。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1固相合成胸腺肽α I1.制備 Fmoc-Asn (Trt)-Wang Resin稱取IOg (3.lmmol) Wang Resin置于固相反應(yīng)合成柱中。加入60ml DCM溶脹樹脂lOmin，抽走DCM。用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽走溶劑。于磨口三角瓶中稱取 5.5g(9.3mmoI)Fmoc-Asn(Trt)和 1.38g(10.23mmol)HOBt，加入 50ml DMF 溶解。在冰水浴中冷卻下加2.15ml (13.95mmol)DIC活化5min。將活化后的氨基酸加入用DMF洗好的樹脂中，然后加入0.23g(l.86mmol)DMP，用氮氣吹氣進行攪拌，室溫反應(yīng)2_4h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽干溶劑。取少量樹脂，用甲醇收縮三次，真空干燥至恒重，測替代值，如替代值達到預(yù)期，將樹脂用乙酸酐封閉未反應(yīng)的羥基，封閉反應(yīng)2-4h后，用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽走溶劑。用甲醇收縮樹脂三次，每次50ml，吹氣5min，抽走溶劑，真空干燥至恒重，測替代值。如替代值達到預(yù)期。2.Fmoc-Asn (Trt) -Wang Resin 的溶脹和脫 Fmoc上面得到的Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin并置于固相反應(yīng)合成柱中，加60ml DCM溶脹lOmin，然后抽走DCM。用DMF洗滌樹脂，每次用50mlDMF，每次洗2min，共洗三次。用濃度為20 %的piperidine的DMF溶液脫Fmoc，共脫兩次，每次50ml，一次脫3min，另一次脫8min。然后用DMF洗滌樹脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗搽Asn (Trt)-Wang Resin，每次洗2min，共洗兩次。抽走溶劑。樹脂對茚三酮顯黃色。3.制備 Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin稱取2.12g(4.98mmol) Fmoc-Glu (OtBu)和 0.74g(5.5mmol)H0Bt 于干燥磨口三角瓶中，用50ml DMF溶解，溶液置冰浴冷卻。加1.15ml (7.47mmol)DIC活化5min。然后將活化后的氨基酸加到上面得到的Asn(Trt)-Wang Resin中反應(yīng)2h。抽走反應(yīng)液。用DMF洗滌樹脂，每次用50ml DMF，每次洗2min，共洗三次。樹脂對茚三酮不顯色。用濃度為20%的piperidine的DMF溶液脫Fmoc，共脫兩次，每次50ml，第一次脫3min，第二次脫8min。然后用DMF洗滌樹脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗滌樹脂，每次洗2min，共洗兩次。抽走溶劑。樹脂對茚三酮顯黃色。4.制備Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser (tBu)-GIu-(OtBu)-1le-Thr(tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys(Boc)-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin按照制備Glu (OtBu) -Asn (Trt) -Wang Resin 的方法依次將 1.55g (4.98mmol)Fmoc-Ala，2.12g(4.98mmol)Fmoc-GIu (OtBu)，2.12g (4.98mmol)Fmoc-GIu (OtBu)，
2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,3.17g (7.47mmoI)Fmoc-Glu (OtBu)，3.50g (7.47mmoI)Fmoc-Lys (Boc)，4.67g (9.96mmol)Fmoc-Lys (Boc)，4.23g (9.96mmol) Fmoc-Glu (OtBu)，4.67g (9.96mmol) Fmoc-Lys (Boc)，3.52g (9.96mmol)Fmoc-Leu，4.09g(9.96mmoI) Fmoc-Asp(OtBu)，4.67g (9.96mmol)Fmoc-Lys (Boc)，
3.96g (9.96mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.96g (9.96mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.52g (9.96mmol)Fmoc-1le，3.17g(7.47mmol)Fmoc-GIu(OtBu)，2.86g(7.47mmol)Fmoc-Ser (tBu)，
2.86g (7.47mmol) Fmoc-Ser (tBu)，2.97g (7.47mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.07g (7.47mmol)Fmoc-Asp (OtBu),2.53g (7.47mmol)Fmoc_Val，2.32g (7.47mmoI)Fmoc-Ala，
3.1Og(9.96mmol) Fmoc-Ala，4.09g(9.96mmol)Fmoc-Asp (OtBu)和 3.8Ig(9.96mmol)Fmoc-Ser (tBu)偶聯(lián)到 Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin 上并脫 Fmoc。5.制備Ac-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Glu-(OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin0°C下將1.18ml (12.45mmol)乙酸酐于干燥磨口三角瓶中與50mlDMF混合，然后加
0.44ml (2.49mmol) DIPEA 活化 5min。將活化后的乙酸酐與 Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser (tBu)-Glu (OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr(tBu)-Lys-(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Va
1-Val-Glu- (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asn (Trt) -Wang Resin 反應(yīng) 2h。抽走反應(yīng)液。樹脂用DMF洗滌4次，每次50ml DMF,每次洗2min。樹脂用DCM洗滌2次，每次用50mlDCM，每次洗3min。抽走溶劑。樹脂對茚三酮不顯色。樹脂用MeOH收縮3次，每次用50mlMeOH，每次收縮5min，抽干。得18.5g干燥肽樹脂。低溫保存。6.從Ac-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Glu-(OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin切害胸腺肽α I0°C下將18.5g干燥的肽樹脂與180ml裂解液(TFA/TIS/H20)反應(yīng)0.5h，室溫反應(yīng)2.5h。反應(yīng)結(jié)束后，用砂芯漏斗過濾分離樹脂。樹脂用少量TFA洗滌三次。合并的濾液用0°C的1800ml的乙醚沉淀出胸腺肽α I粗品。離心分離出胸腺肽α I粗品。胸腺肽α I粗品用0°C的乙醚洗滌粗肽三次，用N2吹走殘余乙醚，置于真空干燥器干燥至恒重，得6.27g胸腺肽α I粗品，收率為81%，含量為68 %。實施例2固相合成胸腺肽α I的純化1.固相合成胸腺肽α I的一次純化Waters 2487 檢測器，Waters 600 泵，迪馬 C 18 制備柱(10 μ m，250X21.2mm)，紫外檢測器，波長215nm，TFA/乙腈/水梯度洗脫，洗脫梯度列入表I。表I胸腺肽α I粗品一次純化的洗脫梯度
權(quán)利要求
1.一種鑒別純化后的胸腺肽α I是否含有缺失肽的方法，包括以下步驟:(1)將固相合成的胸腺肽α I進行純化；(2)將純化后的胸腺肽α I純品采用LC/MS聯(lián)用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在20.78min時出現(xiàn)峰面積為0.36%的峰或在27.19min時出現(xiàn)峰面積分別為0.47%的峰，則說明純化后的胸腺肽α I中含有缺失肽。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述缺失肽的氨基酸序列為SEQID N0.1或 SEQ ID N0.2 所示。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:(I)將固相合成的胸腺肽αI進行第一次純化和第二次純化。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一次純化胸腺肽αI的方法包括:采用配備Waters 2487檢測器、Waters 600泵和迪馬C18制備柱的制備型HPLC進行純化；紫外檢測波長為215nm，用A和B梯度洗脫，流速為10ml/min，梯度為0_5min，10%A/90% B ；5-10min, 15% A/85% B ；10-20min 18% A/82% B ；20-70min 25% A/75% B ;其中A為含0.09% TFA的乙腈，B為含0.1% TFA的水。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的第二次純化胸腺肽αI的方法包括:采用配備Waters 2487檢測器、Waters 600泵和迪馬C18制備柱的制備型HPLC進行純化；紫外檢測波長為215nm,用乙腈/醋酸/水梯度洗脫，流速為10ml/min,梯度為0_5min,10%乙腈/I %醋酸/90%水；5-10min，由10%乙腈/I %醋酸/90%水變至15%乙腈/I %醋酸/85%水；10-20min，由15%乙腈/I %醋酸/85%水變至18%乙腈/I %醋酸/82%水；20-70min,由18%乙腈/I %醋酸/82%水變至25%乙腈/I %醋酸/75%水。
6.按照權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述迪馬C18制備柱的規(guī)格為10μ m、250 X 21.2mm。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度洗脫條件為用0.1%甲酸/乙腈進行梯度洗脫，流速為0.4ml/min ;梯度為:0-30min,由0.1 %甲酸/乙腈=90/10變至0.1 %甲酸/乙腈=80/20 ；30-35min,由0.1 %甲酸/乙腈=80/20變至0.1 %甲酸/乙腈=75/25。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，LC/MS聯(lián)用儀中的LC采用Agilent1200自動進樣，Waters Xterra RP18分析柱的規(guī)格為5 μ m，3.0 X 150mm ;LC/MS聯(lián)用儀中的MS采用Bruker Solatix FT-1CR-MS,離子流檢測器。
9.SEQ ID N0.1所示的寡肽作為胸腺肽α I固相合成中的質(zhì)量控制物中的應(yīng)用。
10.SEQ ID N0.2所示的寡肽作為胸腺肽α I固相合成中的質(zhì)量控制物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別純化后的胸腺肽α1是否含有缺失肽的方法，包括以下步驟(1)將固相合成的胸腺肽α1進行第一次純化和第二次純化；(2)將兩次純化后的胸腺肽α1純品采用LC/MS聯(lián)用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在20.78min時出現(xiàn)峰面積為0.36％的峰或在27.19min時出現(xiàn)峰面積分別為0.47％的峰，則說明純化后的胸腺肽α1中含有缺失肽。本發(fā)明方法可以準確、靈敏的鑒別出胸腺肽α1純品是否含有缺失肽，可以有效地保障和控制胸腺肽α1的質(zhì)量，在制備高純度固相合成胸腺肽α1中有重要應(yīng)用價值。
文檔編號G01N30/02GK103163236SQ20121023953
公開日2013年6月19日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者朱正兵, 彭濤, 王玲, 張金花 申請人:海南合瑞制藥股份有限公司