專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用喜樹(shù)aoc基因轉(zhuǎn)化提高煙草抗凍性能的方法
—種利用喜樹(shù)AOC基因轉(zhuǎn)化提高煙草抗凍性能的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)以及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用基因工程技術(shù)提高煙草抗凍性能的方法。
背景技術(shù)：
茉莉酸類(lèi)物質(zhì)是植物界中普遍存在的一種激素，參與植物發(fā)育和逆境脅迫下應(yīng)激反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。內(nèi)源和外源的茉莉酸類(lèi)化合物能顯著提高植物對(duì)機(jī)械損傷、動(dòng)物撕咬、病蟲(chóng)害侵染、低溫、高鹽等不利外界環(huán)境的耐受能力。在植物中，茉莉酸類(lèi)物質(zhì)的合成途徑是從細(xì)胞膜上釋放的亞麻酸開(kāi)始，在脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物環(huán)化酶、OPDA (12-0X0-(10, 15Z)-phytodienoic acid)還原酶、β _氧化酶、茉莉酸甲基化酶等一系列酶的催化生成茉莉酸和甲基茉莉酸。其中由于丙二烯氧化物會(huì)自發(fā)水解，由此丙二烯氧化物環(huán)化酶的作用在茉莉酸類(lèi)物質(zhì)的合成途徑中尤為重要。
作為一種重要的模式植物，且易于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，煙草是植物的信號(hào)途徑研究中的熱門(mén)對(duì)象；作為一種廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物，煙草的抗逆性能在物種品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值上具有非常重要的意義。煙草的抗凍研究目前涉及葡萄糖醛酸苷酶(GUS)蛋白，超氧物岐化酶(SOD)蛋白等。
相比較而言，利用來(lái)源于喜樹(shù)的茉莉酸類(lèi)物質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶丙二烯氧化物環(huán)化酶的基因工程來(lái)系統(tǒng)性地提高煙草的抗凍性能具有很大的優(yōu)勢(shì)(I)在茉莉酸類(lèi)物質(zhì)的合成和信號(hào)傳導(dǎo)研究領(lǐng)域，全世界的研究人員已經(jīng)進(jìn)行了幾十年的深入研究，其生理作用和生化機(jī)制比較清楚，為在基因工程中利用茉莉酸類(lèi)物質(zhì)生物合成途徑的基因打下了良好的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。(2)提供一種全新的思路，采用轉(zhuǎn)aoc基因提高煙草抗凍性能的方法。 喜樹(shù)是一種和煙草親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)的植物，來(lái)源于喜樹(shù)的丙二烯氧化物環(huán)化酶在煙草中能順利表達(dá)并達(dá)到高活性效果，提高了尼古丁含量。這為開(kāi)展植物基因工程研究提供了一個(gè)新的方向。
目前，尚未有任何與本專(zhuān)利申請(qǐng)中所提及的應(yīng)用基因工程技術(shù)把喜樹(shù)的茉莉酸物質(zhì)生物合成途徑的酶基因尤其是丙二烯氧化物環(huán)化酶轉(zhuǎn)到煙草中，提高煙草抗凍性能的相關(guān)報(bào)道，包括專(zhuān)利和文獻(xiàn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的就是提供一種利用基因工程技術(shù)提高煙草抗凍性能的方法，該方法將來(lái)源于喜樹(shù)的丙二烯氧化物環(huán)化酶基因轉(zhuǎn)到煙草中。
本發(fā)明的第二目的是提供一種高效表達(dá)載體，它包含上述喜樹(shù)的丙二烯氧化物環(huán)化酶基因片斷。
本發(fā)明的第三目的是提供一種用上述高效表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是煙草。
本方法的技術(shù)方案如下本發(fā)明分離出的DNA分子，具有編碼丙二烯氧化物環(huán)化酶的核苷酸序列的核心片斷， 該核心片斷來(lái)源于由申請(qǐng)人在GenBank中登錄的喜樹(shù)iCamptotheca丙二烯氧化物環(huán)化酶基因(登錄號(hào)AY863428)的核苷酸序列,用引物Pl (5’-gg actaRt Atg get get tea tea act tc_3’，酶切位點(diǎn)用下劃線表示)和 P2 (5’-ga ggttacc Tea gtc agt gaa gtt agg aa_3’，feiEII酶切位點(diǎn)用下劃線表示),采用PCR法可以從喜樹(shù)cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出該核心片斷，喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的cDNA序列見(jiàn)SEQ ID N0:1，其全長(zhǎng) 1129bp，開(kāi)放閱讀框位置為第72位堿基到第812位堿基。
本發(fā)明提出的利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高煙草抗凍能力的方法，是利用具有編碼喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶(AOC)的核苷酸序列(Genbank No. :AY863428)的植物表達(dá)載體,采用轉(zhuǎn)基因方法在煙草細(xì)胞、組織、器官、植株中過(guò)量表達(dá)喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的DNA分子。
其具體步驟如下(1)采用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)獲得喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的核心片斷；(2)把喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成表達(dá)載體；(3)采用任何轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷到煙草細(xì)胞、組織、器官、植株中；(4)在特定的條件下篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子；(5)在適合的條件下培養(yǎng)抗凍性能提高的煙草轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
本發(fā)明涉及的載體包含具有編碼喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶的核苷酸序列的核心片斷的DNA。
用上述方法獲得的生命體，它是抗凍性能提高了的煙草的細(xì)胞、組織、器官、植株。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒等。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“生命體”指煙草的細(xì)胞、組織、器官，或植株。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“任何可能的手段”為獲得喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的方法，具體包括同源性克隆(如RT-PCR、RACE等)、文庫(kù)篩選而后人工合成喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因及其變異體。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“任何轉(zhuǎn)基因方法”包括根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、植物病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、電擊法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、顯微注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、基因槍介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“在特定的條件下篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子”是指在離體培養(yǎng)的條件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)選擇出有抗生素抗性的轉(zhuǎn)化子；可以使用PCR、 Southern雜交、Northern雜交和Western印跡等方法來(lái)鑒定轉(zhuǎn)化子。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“在適合的條件下培養(yǎng)抗凍性能提 高的煙草轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代”是指對(duì)經(jīng)過(guò)鑒定的轉(zhuǎn)化子離體培養(yǎng)，并檢測(cè)抗凍性能，篩選抗凍性能提高的優(yōu)良轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
本發(fā)明從喜樹(shù)中克隆丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷，并構(gòu)建了植物高效表達(dá)載體，導(dǎo)入農(nóng)桿菌并遺傳轉(zhuǎn)化煙草，以提高煙草的抗凍性能，提高了煙草的種質(zhì)，增強(qiáng)了栽培適宜性。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷的合成，及表達(dá)載體和工程菌的構(gòu)建。
1、喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷的獲得根據(jù)喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的全長(zhǎng)序列，在該基因的內(nèi)部第72堿基至第812堿基之間設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增741bp序列作為基因片斷，并根據(jù)植物表達(dá)載體PCAMBIA1304的多克隆酶切位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)兩條含有5^1和^siEII限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)以及保護(hù)堿基的PCR擴(kuò)增引物，其引物序列為Pl 5' -ggactagtAtggctgcttcatcaacttc-3' (SEQ ID NO:2) ,酶切位點(diǎn)用下劃線表示P2 5' -gaggttaccTcagtcagtgaagttaggaa-3' (SEQ ID NO 3) , ifeiEII 酶切位點(diǎn)用下劃線表示從喜樹(shù)的葉片抽提總RNA (上海華舜生物工程有限公司植物RNA提取試劑盒)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(TaKaRa RNA PCR Kit)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μ L，包含去離子水， 10XPCR 緩沖液 5yL，dNTP I μ LjMgCl2 3 μ L，引物各 I μ L，cDNA 模板 I μ L，Taq 酶 O. 5 μ L。 PCR條件為94° C 3分鐘，隨之以94° C 50秒、60° C 50秒、和72° C 50秒進(jìn)行28個(gè)循環(huán)，最后在72° C延伸8分鐘。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為 758bp0
電泳分離后，回收(上海華舜生物工程有限公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒)目的片斷， 取適量回收產(chǎn)物與pMD 18-T載體(TaKaRa PMD 18-T Vector試劑盒)連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5a，在LB+氨芐青霉素(lOOmgL—1)固體培養(yǎng)基上抗性篩選陽(yáng)性克隆，PCR鑒定后測(cè)序(上海博亞生物工程公司完成)。
2、CaMV35S組成型啟動(dòng)子表達(dá)載體pCAMBIA-CaAOC的構(gòu)建將經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證正確后的DH5 α (已經(jīng)轉(zhuǎn)入帶有喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷的pMD 18-T載體)搖菌，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用5^1和fciEII雙酶切，1%瓊脂糖電泳后回收小片斷。
將pCAMBIA1304用5^1和fciEII雙酶切，1%瓊脂糖電泳后回收大片斷。
將回收的pCAMBIA1304大片斷和喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷用T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，LB+卡那霉素(100 mgL—1)固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性抗性克隆，PCR和雙酶切鑒定。獲得轉(zhuǎn)喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷的重組質(zhì)粒并命名為 pCAMBIA1304-CaA0C。
3、pCAMBIA1304-CaA0C 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 EHA105將pCAMBIA1304-CaA0C轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株EHA105，劃板挑取陽(yáng)性單菌落搖菌，取少量菌液抽提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切鑒定。陽(yáng)性克隆定義為EHA105-CaA0C。
實(shí)施例2獲得抗凍能力提聞的轉(zhuǎn)基因煙草。
1、農(nóng)桿菌EHA105-CaA0C。使用前自冰箱取出，接種于50 ml YEB液體(Rif+，Str+， Kan+), 28度，200rpm振蕩培養(yǎng)兩次。
2、第二次活化OD600達(dá)O. 3時(shí)加100 μ mo I Γ1乙酰丁香酮，繼續(xù)28度，200rmp振蕩培養(yǎng)，OD600達(dá)O. 6時(shí)室溫下4000rpm離心10分鐘。
3、棄上清，菌體用MS (加100 μ mo I Γ1乙酰丁香酮)液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的0D_=0. 3左右，稱(chēng)轉(zhuǎn)化液。
4、取煙草無(wú)菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成O. 8 cmX0.8 cm左右的葉盤(pán)，放在MS (加I mg Γ1 6-芐氨基嘌呤，I mg L—1萘乙酸)培養(yǎng)基上，防止葉盤(pán)脫水；將葉盤(pán)放入農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，190 rpm, 28°C搖床上浸染10 min ;用藥勺撈出葉盤(pán)，放在滅菌的吸水紙上，吸干葉盤(pán)上的多余菌液；將吸干的葉盤(pán)平放在加蓋一層濾紙的MS (加I mg Γ1 6-芐氨基嘌呤，I mg L—1萘乙酸)培養(yǎng)基上，25°C左右，于暗處共培養(yǎng)約2天。
5、共培養(yǎng)后，按以下步驟將葉盤(pán)表面的農(nóng)桿菌洗掉，其間不時(shí)搖動(dòng)，使葉盤(pán)充分接觸溶液a)無(wú)菌水15分鐘 b)無(wú)菌水+羧節(jié)青霉素(500mg L—1)15分鐘c)MS+羧芐青霉素(500 mg I/1)20分鐘接著用藥勺撈出葉盤(pán)，放在吸水紙上，吸干多余水分；將葉盤(pán)放在MS (含30 mg Γ1潮霉素和250 mg Γ1羧芐青霉素)培養(yǎng)基上，葉盤(pán)邊緣輕壓入培養(yǎng)基中；25°C左右，16 h/24 h光照培養(yǎng)；約20天后可見(jiàn)分化芽長(zhǎng)出，待芽長(zhǎng)大后，切下，置于MS(含O. 5 mg Γ1萘乙酸、 30 mg/T1潮霉素和250 mg/T1羧芐青霉素)培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；約14天之后將幼苗移栽到裝有1:1:1的泥炭土、蛭石和珍珠巖混合物小型的塑料花盆中在25 °C、14 h光/24 h 的條件下生長(zhǎng)。
6、用PCR分別檢測(cè)潮霉素抗性基因和喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因在轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中的整合，確認(rèn)轉(zhuǎn)基因事件。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)照的抗凍能力檢測(cè)1、比較轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草抗凍能力，用煙草葉片低溫處理后的離子泄漏率來(lái)表征其對(duì)低溫的耐受性能。(參考文獻(xiàn)Wallis，J. G., Wang, H. Y., and Guerra, D. J. (1997) Expression of a synthetic antifreeze protein in potato reduces electrolyte release at freezing temperatures. Plant Mo1. Biol. 35, 323-330 ； Nunes, M. E. S. and Smith, G. R. (2003). Electrolyte leakage assay capable of quantifying freezing resistance in rose clover. Crop ScL 43, 1349-1357)；2、分別稱(chēng)取對(duì)照和轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)期和生長(zhǎng)狀態(tài)較一致的葉片每份0.5克，用去離子的蒸餾水沖洗三次，放入一 20° C處理30分鐘；3、在室溫解凍I小時(shí)，每份樣品中加入30ml超純水，再于25°C、100 rpm振蕩2小時(shí)，用數(shù)字式電導(dǎo)率儀測(cè)定溶液的電導(dǎo)率Re ；4、接著將樣品在原溶液中煮沸30min，再測(cè)定溶液的電導(dǎo)率Re’ ；5、定義相對(duì)電導(dǎo)率=Rc/Rc’X 100% ；6、六個(gè)被檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因系都顯示出對(duì)低溫處理較高的耐受性。經(jīng)過(guò)-20°C處理后， 六個(gè)轉(zhuǎn)基因系植株的葉片離子的泄漏率分別為15. 04% (1. 81%)，15. 51% (1. 94%)，12. 82% (1. 18%), 17. 28 % (3. 64%), 11. 07% (O. 86%), 23. 45% (4. 96%);野生型煙草-20。C 處理后的離子泄漏率為75. 65% (2. 62%);轉(zhuǎn)空載體對(duì)照煙草-20° C處理后的離子泄漏率為74. 36% (3.52%)。其中括號(hào)中為標(biāo)準(zhǔn)偏差。轉(zhuǎn)基因煙草的離子泄漏率水平為空白對(duì)照和空載體對(duì)照的四分之一左右。
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，具有編碼丙二烯氧化物環(huán)化酶的核苷酸序列的核心片斷， 該核心片斷來(lái)源于丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的核苷酸序列，用引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO: 3，采用PCR法從喜樹(shù)cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增獲得，喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的cDNA序列見(jiàn)SEQ ID NO :1，其全長(zhǎng)1129bp，開(kāi)放閱讀框位置為第72位堿基到第812位堿基。
2.—種高效表達(dá)載體,其特征在于它包含如權(quán)利要求1所述的DNA分子。
3.一種用如權(quán)利要求2所述高效表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
4.一種利用基因工程方法增強(qiáng)煙草抗凍性能的方法，其特征在于利用具有編碼喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶的核苷酸序列的植物表達(dá)載體，采用轉(zhuǎn)基因方法在煙草細(xì)胞、組織、器官或植株中過(guò)量表達(dá)喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的DNA分子；其具體步驟如下(1)采用基因克隆或人工合成基因方法獲得喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的片斷；(2)把喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因片斷連于表達(dá)調(diào)控序列，形成植物高效表達(dá)載體；(3)采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因片斷到煙草的細(xì)胞、組織、器官或植株中；(4)篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子；(5)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代；(6)測(cè)定轉(zhuǎn)基因后代的抗凍性能。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)以及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種利用喜樹(shù)AOC基因轉(zhuǎn)化提高煙草抗凍性能的方法。本發(fā)明包含利用喜樹(shù)丙二烯氧化物環(huán)化酶(AOC)基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用基因工程技術(shù)在煙草中過(guò)量表達(dá)喜樹(shù)AOC基因，增強(qiáng)煙草抗凍性能。其過(guò)程是從喜樹(shù)中克隆AOC基因，構(gòu)建了植物高效表達(dá)載體，導(dǎo)入農(nóng)桿菌并遺傳轉(zhuǎn)化煙草，測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草葉片低溫處理后的電導(dǎo)率。本方法可以在煙草中過(guò)量表達(dá)喜樹(shù)AOC基因，提高煙草的抗凍性能。
文檔編號(hào)C12N15/61GK102994533SQ20121057805
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者皮妍, 崔勇, 蔣科技, 孫小芬 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)