Ppp1r12a基因在結(jié)直腸癌化療療效判斷和檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種結(jié)直腸癌相關(guān)的標(biāo)志物的應(yīng)用，該標(biāo)志物為PPP1R12A。具體地講，該標(biāo)志物的DNA相對(duì)拷貝數(shù)與結(jié)直腸癌患者化療之后的生存期呈負(fù)相關(guān)。本發(fā)明還涉及結(jié)直腸癌組織樣本中檢測(cè)PPP1R12A的試劑盒、方法和應(yīng)用。該試劑盒中含有檢測(cè)PPP1R12A和內(nèi)參基因GAPDH引物對(duì)，本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)了PPP1R12A與結(jié)直腸癌以及結(jié)直腸癌化療療效之間的關(guān)系，設(shè)計(jì)出檢測(cè)PPP1R12A的引物對(duì)，用該引物對(duì)設(shè)計(jì)出的試劑盒能夠用于檢測(cè)結(jié)直腸癌腫瘤，使通過PPP1R12A檢測(cè)結(jié)直腸癌成為可能。
【專利說明】PPP1R12A基因在結(jié)直腸癌化療療效判斷和檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用
[【技術(shù)領(lǐng)域】][0001]本發(fā)明屬于腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種結(jié)直腸癌基因標(biāo)志物及其應(yīng)用，具體涉及結(jié)直腸癌中檢測(cè)PPP1R12A基因相對(duì)拷貝數(shù)的試劑盒、方法和應(yīng)用。
[【背景技術(shù)】]
[0002]結(jié)直腸癌是最為常見的惡性腫瘤之一，中國(guó)地區(qū)的發(fā)病率上升趨勢(shì)十分明顯，位居全部惡性腫瘤第三位，嚴(yán)重威脅人類健康。
[0003]臨床上第三代鉬類藥物奧沙利鉬奧沙利鉬，聯(lián)合5氟尿嘧啶和四氫葉酸的FOLFOX方案是目前進(jìn)展期結(jié)直腸癌的一線化療方案，但是仍有50%的人對(duì)化療不敏感，其主要的原因是對(duì)于奧沙利鉬化療藥物原始的或獲得性的耐藥性。這種耐藥性的產(chǎn)生與化療藥物的運(yùn)輸、DNA修復(fù)、DNA損傷耐受和凋亡等多種相關(guān)基因的參與有關(guān)。因此，發(fā)現(xiàn)化療療效相關(guān)的基因診斷標(biāo)志物對(duì)患者選擇合適的化療藥物并從中獲得臨床受益具有重要的臨床意義。
[0004]PPP1R12A，稱為磷酸酶I調(diào)節(jié)亞基12A，又稱為肌球蛋白磷酸酶結(jié)合亞基(MYPT-1),能夠與肌球蛋白磷酸酶δ催化亞基結(jié)合，調(diào)控磷酸酶的特異性和活性(GrassieME, Moffat LD, Walsh MP, Macdonald JA (2011) The myosin phosphatase targetingprotein (MYPT) family: a regulated mechanism for achieving substrate specificityof the catalytic subunit of protein phosphatase typeldelta.Archives ofBiochemistry and Biophysics510:147 - 159)。PPP1R12A 在多種類型細(xì)胞中表達(dá)，并且在平滑肌細(xì)胞中達(dá)到高表達(dá)(Matsumura F, Hartshorne DJ (2008) Myosin phosphatasetarget subunit:many roles in cell function.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications369:149 - 156)。PPP1R12A的一個(gè)生物學(xué)特點(diǎn)是與PPlc δ磷酸酶形成復(fù)合物，調(diào)控PPlc δ磷酸酶對(duì)其底物-磷酸化肌球蛋白的去磷酸化作用，從而調(diào)控肌肉的壓縮和細(xì)胞遷移。
[0005]除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)PPP1R12A還參與調(diào)控了腫瘤抑制基因Merlin的活性(Jin H, Sperka T, Herrlich P, Morrison H (2006) Tumorigenic transformation byCP1-17through inhibition of a merlin phosphatase.Nature442:576-579)。當(dāng)細(xì)胞密度過高時(shí)，Merlin發(fā)生去磷酸化，能夠與細(xì)胞表面的⑶44結(jié)合，抑制細(xì)胞增殖(Shaw RJ, PaezJG,Curto 等(2001) The Nf2tumor suppressor, merlin, functions in Rac-dependentsignaling.Dev Celll:63_72)。Merlin缺失雜合子小鼠在多種器官肺、肝臟和骨長(zhǎng)出惡性腫瘤(McClatchey Al, Saotome I, Mercer K等(1998)Mice heterozygous for a mutationat the Nf2tumor suppressor locus develop a range of highly metastatic tumors.Genes Devl2:1121-1133)。Merlin去磷酸化對(duì)它維持抑癌基因的功能非常重要，而Merlin去磷酸化是通過PPP1R12A和PPl δ調(diào)控。其中，PPP1R12A蛋白C端有一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，能夠與Merlin C端(第314-第595位氨基酸)結(jié)合，并且偏好結(jié)合磷酸化的Merlin,PPP1R12A同時(shí)也能與磷酸酶PPl δ結(jié)合，從而介導(dǎo)了磷酸酶PPl δ對(duì)Merlin的去磷酸化。一旦利用蛋白酶降解PPP1R12A之后，Merlin的去磷酸化水平降低。
[0006]磷酸酶與激酶是體內(nèi)兩類重要酶類，調(diào)控蛋白磷酸化水平，參與細(xì)胞內(nèi)諸多信號(hào)通路的調(diào)控，與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥有重要關(guān)系。其中磷酸酶被認(rèn)為是腫瘤抑制基因，負(fù)責(zé)蛋白去磷酸化，這類酶在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中經(jīng)常發(fā)生突變和缺失，導(dǎo)致底物蛋白過度磷酸化，促進(jìn)了細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥相關(guān)信號(hào)通路的持續(xù)激活，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和惡化。重要的磷酸酶如PTEN就在結(jié)直腸癌以及其他多種腫瘤中發(fā)生缺失和突變。另外，6大類磷酸酶在結(jié)直腸癌中發(fā)生高頻突變，這6類磷酸酶包括PTPRF，PTPRG, PTPRT, PTPN3, PTPN13, PTPN14(ffang Z,Shen D, Parsons DW等(2004)Mutational analysis of the tyrosinephosphatome in colorectal cancers.Science304:1164-1166.X
[0007]這些提示PPP1R12A這個(gè)磷酸酶調(diào)控亞基也有可能存在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中存在缺失的可能。目前檢測(cè)基因缺失的常用方法包括熒光原位雜交和熒光定量PCR，后者教前者簡(jiǎn)單方便和靈敏。
[
【發(fā)明內(nèi)容】
]
[0008]腫瘤發(fā)生的實(shí)質(zhì)是基因組的不穩(wěn)定性造成的染色體DNA缺失、擴(kuò)增和突變。這些異常染色體區(qū)域的基因大多與腫瘤的發(fā)生、耐藥和轉(zhuǎn)移相關(guān)。本發(fā)明的首要目的是確認(rèn)PPP1R12A在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中是否發(fā)生缺失或者擴(kuò)增。其次，確認(rèn)PPP1R12A相對(duì)拷貝數(shù)變化以及是否與結(jié)直腸癌F0LF0X化療療效相關(guān)。第三個(gè)目的是發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌發(fā)生和療效相關(guān)的生物標(biāo)志物。
[0009]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)PPP1R12A基因相對(duì)拷貝數(shù)在結(jié)直腸癌組織中比非腫瘤對(duì)照腸組織高，因此，腫瘤樣本中的PPP1R12A的相對(duì)拷貝數(shù)可以作為結(jié)直腸癌的一個(gè)標(biāo)志物。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)PPP1R12A的相對(duì)拷貝數(shù)降低程度與患者服用F0LF0X化療藥物之后的生存期相關(guān)。
`[0010]因?yàn)镕0LF0X化療方案中起主要抗腫瘤的活性物質(zhì)為5氟尿嘧啶(5FU)和奧沙利鉬，它們的作用方式為誘導(dǎo)DNA損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此，本發(fā)明涉及PPP1R12A作為評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌患者使用誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥物之后生存期的指標(biāo)。
[0011]因?yàn)镈NA拷貝數(shù)降低直接導(dǎo)致基因表達(dá)降低，因此，本發(fā)明也涉及利用PPP1R12A表達(dá)(包括mRNA和蛋白水平)作為評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌發(fā)生和結(jié)直腸癌患者服用化療藥物之后生存期的指標(biāo)。
[0012]另一方面，本發(fā)明涉及PPP1R12A的引物對(duì)SEQID N0.1 和 SEQID N0.2,SEQID N0.3和SEQID N0.4,SEQID N0.5和SEQID N0.6在制備PPP1R12A的檢測(cè)試劑盒中的用途。因?yàn)楸景l(fā)明選取了 PPP1R12A序列上不同位置的序列設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，且熒光定量PCR反應(yīng)顯示皆有效，所以，本發(fā)明涉及來源于PPPIRl2A基因上任一位置的引物序列應(yīng)用于檢測(cè)PPP1R12A的用途。
[0013]為了使通過PPP1R12A相對(duì)拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌成為可能，本發(fā)明的首要目的是發(fā)明一種檢測(cè)PPP1R12A的引物對(duì)和試劑盒，然后通過PPP1R12A做成檢測(cè)結(jié)直腸的試劑盒。
[0014]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，首先發(fā)明一種PPP1R12A基因在F0LF0X化療藥物療效判斷藥物中的應(yīng)用。
[0015]所述的化療藥物為誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥物。
[0016]所述的誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥物選自含鉬類和5氟尿嘧啶及其衍生物的化療藥物中的一種或多種。
[0017]PPP1R12A基因?yàn)榻Y(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物，利用其DNA相對(duì)拷貝數(shù)增高與結(jié)直腸癌發(fā)生呈正相關(guān)；所述的標(biāo)志物的DNA相對(duì)拷貝數(shù)降低與結(jié)直腸癌患者進(jìn)行FOLFOX化療之后的生存期呈負(fù)相關(guān)，所述負(fù)相關(guān)為PPP1R12A相對(duì)拷貝數(shù)越低，生存期越長(zhǎng)；相對(duì)拷貝數(shù)越高，生存期越短，利用所述的負(fù)相關(guān)制備所述判斷藥物或試劑盒。
[0018]所述的標(biāo)志物相對(duì)拷貝數(shù)降低還包括相對(duì)拷貝數(shù)降低引起的PPP1R12A的mRNA和蛋白水平的降低。
[0019]本發(fā)明的另一目的是發(fā)明一種檢測(cè)PPP1R12A的試劑盒，該試劑盒中含有檢測(cè)PPP1R12A和內(nèi)參基因GAPDH引物對(duì)。
[0020]所述檢測(cè)PPP1R12A的引物對(duì)選自下述引物對(duì)中的一對(duì):
[0021]第一引物對(duì)，[0022]上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:1所示；
[0023]下游引物，如堿基序列SEQ ID NO:2所示；
[0024]或第二引物對(duì)，
[0025]上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:3所示；
[0026]下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:4所示；
[0027]或第三引物對(duì)，
[0028]上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:5所示；
[0029]下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:6所示。
[0030]所述的內(nèi)參基因GAPDH的引物對(duì)優(yōu)選為:
[0031]上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:3所示；
[0032]下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:4所示。
[0033]本發(fā)明還包括一種檢測(cè)PPP1R12A的方法，包括DNA的提取步驟；用所述的試劑盒對(duì)所述的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；最后得到擴(kuò)增產(chǎn)物，并檢測(cè)判斷。
[0034]本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)的PPP1R12A與結(jié)直腸癌之間的關(guān)系(參見實(shí)施例)，設(shè)計(jì)出檢測(cè)PPP1R12A的引物對(duì)，用該引物對(duì)設(shè)計(jì)出的試劑盒能夠用于檢測(cè)結(jié)直腸癌腫瘤，使通過PPP1R12A檢測(cè)結(jié)直腸癌成為可能。
[【專利附圖】

【附圖說明】]
[0035]圖1為PPP1R12A作為結(jié)直腸癌標(biāo)志物的ROC曲線
[0036]圖2為PPP1R12A相對(duì)拷貝數(shù)與結(jié)直腸癌患者經(jīng)FOLFOX化療后生存期的關(guān)系
[0037]圖3PPP1R12A作為判斷結(jié)直腸癌FOLFOX化療療效判斷標(biāo)志物的ROC曲線；
[0038]圖中:1.基因拷貝數(shù)低于平均值2.基因相對(duì)拷貝數(shù)高于平均值。
[【具體實(shí)施方式】]
[0039]實(shí)施案例1:樣本及其隨訪信息的收集
[0040]發(fā)明人從2006年開始從瑞金醫(yī)院收集了大腸癌患者樣本，經(jīng)過資料整理和隨訪，從中選取了 97份(37份五年以下生存期，60份五年以上生存期和至統(tǒng)計(jì)之日仍然存活患者)III期結(jié)直腸癌腫瘤和8例非腫瘤腸組織石蠟包埋組織樣本。[0041 ] 實(shí)施案例2:石蠟樣本DNA抽提
[0042]從石蠟包埋組織中切下5毫克樣本，放入2毫升離心管中，加入I毫升二甲苯，渦旋震蕩10秒。在14000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下常溫離心2分鐘。棄上清。加入I毫升無(wú)水乙醇洗滌沉淀，渦旋震蕩，在14000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下常溫離心2分鐘，棄上清。將離心管置于超凈臺(tái)中去除多余乙醇。加入180微升RTL緩沖液(Qiagen)，20微升蛋白酶K，混勻，56°C孵育I小時(shí)，90°C孵育I小時(shí)。加200微升AL緩沖液，混勻，然后加入200微升無(wú)水乙醇，混勻。將混合液加入QIAamp柱子(Qiagen)，8000轉(zhuǎn)/分鐘常溫離心I分鐘。打開柱子蓋子，加入500微升AWl緩沖液(Qiagen)，8000轉(zhuǎn)/分鐘常溫離心I分鐘。加入500微升AW2緩沖液(Qiagen)，8000轉(zhuǎn)/分鐘常溫離心I分鐘。在14000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下常溫離心3分鐘干燥膜。加入50微升ATE緩沖液，在14000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下常溫離心I分鐘收集DNA。
[0043]實(shí)施案例3:熒光定量PCR及分析 [0044]設(shè)計(jì)三對(duì)PCR引物用來擴(kuò)增PPP1R12A，序列見表1。使用2XSYBR Green熒光染料配制PCR反應(yīng)混合液，根據(jù)需要上機(jī)的樣品數(shù)和重復(fù)數(shù)，計(jì)算并配制PCR反應(yīng)混合液，體系如下:
[0045]
成分體積
2*SYBR Green10 μ I
引物 Mix4μ M (2.5μ I)~
模板20ng (2.5μ I)
超純水5 μ I
總體積20ul
[0046]
[0047]分裝至AXYGEN PCR8連管，微型離心機(jī)瞬時(shí)離心混勻PCR體系。GAPDH作為內(nèi)參基因。
[0048]將上述樣品放入IQ5 (BioRad)熒光定量PCR儀，SYBR Green法熒光定量PCR以分析各基因的表達(dá)，PCR程序設(shè)置如下:
[0049]預(yù)變性Cyclel: (IX)
[0050]Stepl:95.0°Cfor02:00[0051 ] PCR 循環(huán) CycIe2: (40X)
[0052]Stepl:95.0°Cfor00:15
[0053]Step2:60.0°Cfor00:20
[0054]Step3:72.0°Cfor00:20
[0055]溶解曲線60°C -95.(TC每秒增加0.5度，采集熒光，收集數(shù)據(jù)。
[0056]對(duì)于每個(gè)樣本，按照Λ Ct (相對(duì)拷貝數(shù))=Ct (PPP1R12A平均值)一Ct (GAPDH平均值)計(jì)算PPP1R12A相對(duì)拷貝數(shù)(見表2)[0057]表1兩對(duì)qPCR檢測(cè)弓|物
[0058]
【權(quán)利要求】
1.PPP1R12A基因在FOLFOX化療藥物療效判斷藥物或試劑盒中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的化療藥物為誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥物。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥物選自含鉬類和5氟尿嘧啶及其衍生物的化療藥物中的一種或多種。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于PPP1R12A基因?yàn)榻Y(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物，利用其DNA相對(duì)拷貝數(shù)增高與結(jié)直腸癌發(fā)生呈正相關(guān)，即所述DNA標(biāo)志物相對(duì)拷貝數(shù)越高，結(jié)直腸癌發(fā)生的可能性越高；所述的標(biāo)志物的DNA相對(duì)拷貝數(shù)降低與結(jié)直腸癌患者進(jìn)行FOLFOX化療之后的生存期呈負(fù)相關(guān)，所述負(fù)相關(guān)為PPP1R12A相對(duì)拷貝數(shù)越低，生存期越長(zhǎng)；相對(duì)拷貝數(shù)越高，生存期越短，利用所述的負(fù)相關(guān)制備所述判斷藥物或試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標(biāo)志物相對(duì)拷貝數(shù)降低包括相對(duì)拷貝數(shù)降低引起的PPP1R12A的mRNA和蛋白水平的降低。
6.一種檢測(cè)PPP1R12A的試劑盒，其特征在于，含有檢測(cè)PPP1R12A和內(nèi)參基因GAPDH引物對(duì)。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)結(jié)直腸癌的試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)PPP1R12A的引物對(duì)選自下述引物對(duì)中的一對(duì): 第一引物對(duì)， 上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:1所示； 下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:2所示； 或第二引物對(duì)， 上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:3所示； 下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:4所示； 或第三引物對(duì)， 上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:5所示； 下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:6所示。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)結(jié)直腸癌的試劑盒，其特征在于所述的內(nèi)參基因GAPDH的引物對(duì)為: 上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:7所示； 下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:8所示。
9.一種檢測(cè)PPP1R12A的方法， 包括DNA的提取步驟； 其特征在于，還包括: 用權(quán)利要求6所述的試劑盒對(duì)所述的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 得到擴(kuò)增產(chǎn)物，并檢測(cè)判斷。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103695560SQ201410009149
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】林謀斌, 尹路, 張亞杰, 李阿建, 李華光 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院