一種來源于惡臭假單胞菌的epsp合酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種對草甘膦具有高抗性的來源于惡臭假單胞菌的EPSP合酶基因及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的將該基因轉(zhuǎn)化植物的方法和其在轉(zhuǎn)基因植株中表現(xiàn)的高抗草甘膦活性，將在抗草甘膦植物的研究和開發(fā)中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】—種來源于惡臭假單胞菌的EPSP合酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域和植物遺傳工程學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種來源于惡臭假單胞菌的EPSP合酶基因及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine,glyphosate)是一種有機磷除草劑。20 世紀70年代初由孟山都公司開發(fā)，通常使用時一般將其制成異丙胺鹽或鈉鹽。其異丙胺鹽是著名除草劑商標“Roundup”的活性成分。
[0003]草甘膦是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型優(yōu)秀除草劑，是全世界使用量最大的除草劑之一。草甘膦的除草性能優(yōu)異，極易被植物葉片吸收并傳導(dǎo)至植物全身，對一年生及多年生雜草都有很高的活性。但是該除草劑是一種非選擇性除草劑，對農(nóng)作物同樣具備殺傷力。為使在農(nóng)作物生產(chǎn)中更廣泛的使用草甘膦，必須培育出具有抗草甘膦抗性或降解性的農(nóng)作物。
[0004]草甘膦的毒性作用機理是競爭性抑制莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5_enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS,簡稱 EPSP 合成酶)的活性。EPSP合成酶是植物和微生物體內(nèi)芳香族氨基酸，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等生物合成過程中的一個關(guān)鍵酶。草甘膦可以通過植物的韌皮部進行運輸，并與EPSP合成酶結(jié)合，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合成，引起細胞死亡。
[0005]草甘膦也能抑制大部分細菌中芳香族氨基酸的生物合成中EPSP合成酶活性，但是部分細菌的EPSPS已發(fā)現(xiàn)對草甘膦具有抗性，并且被克隆獲得。植物可以通過轉(zhuǎn)基因表達細菌的抗性EPSPS而獲得抗草甘膦的能力。例如農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefacienssp CP4)和typhimurium CT7的EPSPS在植物中表達而獲得的抗性已在生產(chǎn)中應(yīng)用(美國專利453590，47 69061，5094945)。但是為了提高轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的抗性水平和增加抗性基因的多樣性，生產(chǎn)應(yīng)用中仍然需要新的抗草甘膦基因和以此為基礎(chǔ)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物。
[0006]我國在轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物方面的研究已取得一定進展，但目前尚無抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物進入商品化階段的報道。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的抗草甘膦的EPSPS，從而獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物。
[0007]本發(fā)明從污泥中篩選到一株具有草甘膦抗性的細菌，利用其基因組序列的信息克隆了其EPSPS基因，并且進一步在擬南芥、玉米、水稻、棉花、大豆等植物中證明了這個EPSPS基因的抗草甘膦能力及其在發(fā)展轉(zhuǎn)基因抗草甘膦農(nóng)作物中的用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供新的使植物具有草甘膦抗性的基因及其編碼蛋白。另外，本發(fā)明還提供了這個基因的基因工程中間體(如，表達盒、載體和細胞等)，獲得具有草甘膦抗性的植物的方法和應(yīng)用，并提供了判斷植物是否具有草甘膦抗性的鑒定方法。
[0009]具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了一種對草甘膦具有高抗性的新基因，本發(fā)明所提供的草甘膦抗性基因，是發(fā)明人篩選并克隆到的一種新的EPSP合酶基因(以下稱為P-EPSP合酶基因)。P-EPSP合成酶基因是用PCR方法從發(fā)明人篩選的高草甘膦抗性菌株惡臭假單胞菌putida ) KT-CGL_7_6 中克隆得到的。putidaKT-CGL-7-6為本發(fā)明人從噴灑草甘膦的試驗田土壤中經(jīng)初篩和復(fù)篩等大量的實驗得到的對草甘膦具有高耐受活性的菌株。菌株KT-CGL-7-6于2013年I月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7190，保藏單位的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。P-EPSP合酶基因是下述核苷酸序列之一:
1)序列表中SEQID NO:I所不的核昔酸序列；
2)與SEQID NO:1序列具有90%以上相似性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
3)與SEQID NO:1相比，具有SEQ ID NO:1序列的部分、區(qū)段和/或片段(包括臨近片段和與全長分子相比內(nèi)部和/或末端缺失)、其變體、突變體、嵌合體和融合物且可編碼賦予高草甘膦抗性活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；
4)根據(jù)SEQID NO:1，利用同一個氨基酸的不同密碼子而獲得的不同的核苷酸序列，這些序列編碼高草甘膦抗性活性的蛋白質(zhì)多肽；
5)通過導(dǎo)入SEQI D NO:1所示的核苷酸序列的其他變異但是仍然編碼具有抗草甘膦能力的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0010]本發(fā)明第一方面的草甘膦抗性基因的核苷酸序列可以有多種不同的變異，包括但不限于:1)利用同一個氨基酸的不同密碼子而獲得的不同的核苷酸序列，這些序列編碼相同活性的蛋白質(zhì)多肽；2)通過導(dǎo)入核苷酸序列的其他變異但是仍然編碼具有抗草甘膦能力的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。這種變異可以是隨機的變異，也可以是針對性的點變異，還可以是插入或者缺失的變異。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員就能夠通過分子生物學(xué)的方法產(chǎn)生上述變
B1升。
[0011]在第二方面，本發(fā)明提供對草甘膦具有高抗性的一種新的EPSP合成酶基因的編碼蛋白，由本發(fā)明第一方面的基因編碼，該蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì):
(1)由SEQID No:2代表的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，
(2)與SEQID No:2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一個或幾個氨基酸的氨基酸序列組成且賦予高草甘膦抗性活性的蛋白質(zhì)；
(3)與SEQID No:2代表的蛋白序列相比，有具有SEQ ID No:2序列的部分、區(qū)段和/或片段(包括臨近片段和與全長分子相比內(nèi)部和/或末端缺失)、其變體、突變體、嵌合體和融合物且賦予高草甘膦抗性活性的蛋白。
[0012]在知曉具體序列的前提下，通過常規(guī)技術(shù)，如PCR方法、重組法或人工合成的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易獲得本發(fā)明的編碼如SEQ ID No:2所示的蛋白的核酸分子或其片段。另外，可通過如定點誘變技術(shù)等合成與突變體具有相同功能的本發(fā)明的突變體基因。
[0013]當然，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的啟示，通過缺失、取代和/或添加SEQ ID No:2所示的蛋白中一個或幾個氨基酸的方式，或者通過雜交來搜尋能在嚴緊條件下能與編碼SEQ ID No:2所示的蛋白的核酸雜交的核酸，選擇出與本發(fā)明的基因功能等同的突變體蛋白及其基因，這也納入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0014]本發(fā)明的基因可以與其他基因和蛋白質(zhì)融合以產(chǎn)生嵌合或融合蛋白。本發(fā)明的有用基因和蛋白質(zhì)不僅包括具體的示例的全長序列，還包括這些序列的部分、區(qū)段和/或片段(包括臨近片段和與全長分子相比內(nèi)部和/或末端缺失)、其變體、突變體、嵌合體和融合物。
[0015]只要保留所需的功能活性，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以具有替換的氨基酸。保留了如示例蛋白質(zhì)相應(yīng)片段的相同或相似功能或活性的片段和其他等價物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0016]通過改變蛋白質(zhì)三維特征和其他未提及的多種特性(例如保守型氨基酸替換)而不對蛋白質(zhì)的活性/功能性產(chǎn)生不利影響，這些也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0017]通過各種方法，例如通過多種蛋白酶進行切割，而切除蛋白質(zhì)的部分序列，并在切除后仍保留并表現(xiàn)活性和功能，由這種方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0018]用于植物表達的序列優(yōu)化也在本發(fā)明范圍內(nèi)。為了在植物中更好的高表達外源基因，可能優(yōu)選重新設(shè)計所述基因以使其在植物細胞中更有效的表達。例如可以利用植物密碼子偏好性重新改造外源基因以得到最優(yōu)表達。
[0019]本發(fā)明的P-EPSP合成酶基因及其編碼蛋白賦予微生物對草甘膦的高耐受活性，其最大耐受濃度達到6500 mg/L,而同時作為對照的的農(nóng)桿菌
AgLO對草甘膦的最大耐受濃度只有3000 mg/L。
[0020]在第三方面，本發(fā)明`提供了包含本發(fā)明第一方面所述的P-EPSP合酶基因的載體。本文中的術(shù)語“載體”是指本領(lǐng)域中常用的細菌質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、動物病毒及其它各種病毒載體。根據(jù)所應(yīng)用的目的不同，“載體”在本文中可以分為“克隆載體”、“表達載體”和“轉(zhuǎn)化載體”，指的是所使用的目的分別針對克隆并驗證基因、表達相應(yīng)基因和將相應(yīng)基因轉(zhuǎn)化。本發(fā)明中適用的載體包括但不限于:在細菌中表達用的載體(原核表達載體)、在酵母中表達用的載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒載體、在哺乳動物細胞中表達用的載體(痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達用的植物表達載體以及在哺乳動物乳腺中表達用的各種載體。除了在克隆過程中必要的克隆載體之外，還優(yōu)選本發(fā)明第四方面中的載體是轉(zhuǎn)化載體，尤其是植物轉(zhuǎn)化載體，特別是適合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的載體。上述重組載體還包含外源基因或外源DNA片段。
[0021]在第四方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明第一方面所述的P-EPSP合酶基因的細胞。細胞可以是原核細胞，也可以是真核細胞，如，細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。優(yōu)選的細胞可以是農(nóng)桿菌細胞，利用它可以將目的基因轉(zhuǎn)化入植物。另外優(yōu)選的是微生物細胞，如細菌細胞，它們可以作為克隆載體或轉(zhuǎn)化載體的宿主細胞。
[0022]在第五方面，本發(fā)明提供了植物，其包含本發(fā)明第一方面的P-EPSP合酶基因，和/或其表達本發(fā)明第二方面的蛋白質(zhì)。由于引入了本發(fā)明第一方面的P-EPSP合酶基因和本發(fā)明第二方面的蛋白質(zhì)，本發(fā)明第五方面的植物具有草甘膦抗性。在本文中，植物指的是借助光合作用，以水、二氧化碳和無機鹽等無機物就能合成碳水化合物、蛋白質(zhì)來維系生存的單個植株、植株群或其繁殖材料，包括植物、植物品種、植株、植物事件、植物后代、植物種子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物后代本身就是植物，包括通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生的植物后代、與其他植物品種雜交產(chǎn)生的植物后代、以及回交或自交產(chǎn)生的植物后代，也包括后代的轉(zhuǎn)基因植物細胞、組織、器官、種子。[0023]本發(fā)明第五方面的植物可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物。優(yōu)選的植物和植物細胞為擬南芥、煙草、棉花、水稻、玉米、大豆、小麥、油菜、草坪草及牧草等。還可以根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生其他類型的轉(zhuǎn)基因植物，如水果、蔬菜和樹木。可以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)編碼基因引入多種微生物或植物宿主中。本發(fā)明包括轉(zhuǎn)基因植物細胞和轉(zhuǎn)基因植物。
[0024]在第六方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面所述的基因在獲得具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因植物過程中的應(yīng)用。在已知基因的條件下，培育轉(zhuǎn)基因植物的方法是有先例的，例如可以通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方式或者微粒轟擊或電穿孔的方式將基因?qū)胫参锘蚱浣M織中，然后培養(yǎng)該植物或其組織并在存在草甘膦的環(huán)境中篩選。優(yōu)選在本文中，所述植物是擬南芥、煙草、棉花、水稻、玉米、大豆、小麥、油菜、草坪草及牧草等。
[0025]在本文中，獲得包括制備、培育、生產(chǎn)或以其他方式產(chǎn)生得到，包括通過轉(zhuǎn)基因育種方式獲得，如將本發(fā)明第一方面的基因轉(zhuǎn)入植物后使之表達本發(fā)明第二方面的蛋白質(zhì)；也包括通過非轉(zhuǎn)基因育種方式獲得，如通過雜交、回交、自交或無性繁殖本發(fā)明第五方面的植物并分選出仍舊包含本發(fā)明第一方面的基因并表達本發(fā)明第二方面的蛋白質(zhì)的植物。因此，本發(fā)明的第六方面提供的應(yīng)用包括，在獲得具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因植物過程中的應(yīng)用和在獲得具有草甘膦抗性的非轉(zhuǎn)基因植物過程中的應(yīng)用。
[0026]在第七方面，本發(fā)明提供了獲得具有草甘膦抗性的植物的方法，其包括如下步驟:
(1)使植物包含本發(fā)明第一方面的基因；和/或，
(2)使植物表達本發(fā)明第二方面的蛋白質(zhì)。
[0027]可以采用前述或者本領(lǐng)域技術(shù)人員能獲知的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因方法，使植物包含本發(fā)明第一方面的基因，或者使植物表達本發(fā)明第二方面的蛋白質(zhì)。實施本發(fā)明第七方面的方法，能夠獲得本發(fā)明第五方面的植物。優(yōu)選在本發(fā)明的第七方面中，可以采用的步驟包括轉(zhuǎn)基因、雜交、回交、自交或無性繁殖步驟。這些步驟本身對于轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因育種領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，都是可以獲知并實施的。
[0028]在第八方面，本發(fā)明提供了鑒定本發(fā)明第五方面的植物或者本發(fā)明第七方面的方法獲得的植物的方法，其包括如下步驟:
(1)測定所述植物是否包含本發(fā)明第一方面的基因；和/或，
(2)測定所述植物是否表達本發(fā)明第二方面的蛋白質(zhì)。
[0029]測定的步驟可以通過常規(guī)的核酸檢測和/或蛋白質(zhì)檢測方法來進行，只需要能夠檢測出基因或其編碼蛋白的方法都可以。示例性的方法包括蛋白質(zhì)測序、核酸測序、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測、探針雜交檢測等。
[0030]如從所述轉(zhuǎn)基因植物或其后代、種子中進行本發(fā)明第一方面所述的P-EPSP合酶基因或其同源序列的擴增，對擴增出的序列進行序列分析并與本發(fā)明第一方面所述的P-EPSP合酶基因序列相比較。其中擴增的方法是公知的，如PCR擴增。由于本發(fā)明第一方面所述的P-EPSP合酶基因是從細菌中分離得到的，天然的植物或其種子中并不含有該基因，如果能夠從植物或其種子中擴增出序列而且該序列與本發(fā)明第一方面所述的P-EPSP合酶基因相同，那么該植物或其種子就是導(dǎo)入了本發(fā)明第一方面所述的P-EPSP合酶基因的草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因植物或其后代、種子。
[0031]本發(fā)明涉及來自轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細胞、組織、器官、種子或植物體部分。本發(fā)明也包括轉(zhuǎn)基因植物后代及后代的轉(zhuǎn)基因植物細胞、組織、器官、種子和植物部分。
[0032]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]序列表1為從PsmdoiBoims putida KT-CGL_7_6擴增獲得的草甘膦抗性基因P-EPSP合酶基因的核苷酸序列。
[0034]序列表2為從PsmdoiBoims pu tida KT-CGL_7_6擴增獲得的草甘膦抗性基因P-EPSP合酶基因的氨基酸序列。
[0035]圖1為載體PTGl的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0036]圖2為植物表達載體PTG2-PEPSP的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0037]圖3為Tl代轉(zhuǎn)基因擬南芥苗噴灑草甘膦實驗。左圖為噴灑草甘膦前轉(zhuǎn)基因擬南芥苗生長情況；右圖為噴灑2.5mM草甘膦兩周后存活情況，野生型及未轉(zhuǎn)基因苗枯死，陽性對照及轉(zhuǎn)P-EPSP合酶基因苗存活。
[0038]圖4為PCR檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥Tl代電泳圖，M為marker，l — 7為轉(zhuǎn)基因擬南芥，一為陰性對照，+為陽性對照。
[0039]圖5為T1代轉(zhuǎn)基因玉米苗生長30`天后，噴灑20mM的草甘膦，經(jīng)過一周后存活情況，非轉(zhuǎn)基因玉米已經(jīng)干枯(B)，轉(zhuǎn)基因玉米未受影響(A)。
[0040]圖6為T1代轉(zhuǎn)基因大豆苗生長30天后，噴灑20mM的草甘膦，經(jīng)過一周后存活情況，非轉(zhuǎn)基因大豆無法正常生長(B)，轉(zhuǎn)基因大豆生長良好(A)。
【具體實施方式】
[0041]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，培養(yǎng)基中的溶劑均為水，具體步驟可參見:((Molecular Cloning: A Laboratory Manual))(Sambrook, J.,Russell, David ff.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition,200I,NY,Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
[0042]1780 改培養(yǎng)基(1L) =K2HPO4 0.61g, KH2PO4 0.39g, KCl 0.25g, MgSO4.7H20 0.13g,微量元素液1.0ml。滅菌冷卻后添加草甘膦至所需終濃度。
[0043]其中每1000rnl 微量元素液包括 CaCl2.2H20 0.0004g, FeSO4.7H20 0.04g,MnSO4.4H20 0.04g, ZnSO4.7H20 0.02g, CuSO4.5H20 0.005g, CoCl2.6H20 0.004g, NaCl1.0g, Na2MoO4.2H20 0.005g。
[0044]1/10LB液體培養(yǎng)基(IL):酵母粉0.5g，蛋白胨lg，NaCl IOg ;滅菌冷卻后添加草甘膦至所需終濃度。[0045]LB液體培養(yǎng)基(IL):蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOgo
[0046]2XYT培養(yǎng)基(IL):酵母提取物 16g，蛋白胨 16g，NaCl 5 g，瓊脂粉12g。
[0047]如需要，在以上培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的抗生素?？敲顾亟K濃度5(^g/ml，利福平終濃度40μ〖/ηι1。
[0048]實施例1
草甘膦抗性菌株put?da KT-CGL_7_6的分離、純化和鑒定 1、土壤樣品來源
從噴灑草甘膦的實驗田土層下5cm處采集土壤樣品。
[0049]2、草甘膦抗性菌株的分離、純化
菌株的富集:分別稱取20克土壤樣品，其中一份土壤樣品加入到含100mg/L草甘膦的1/10LB液體培養(yǎng)基中(裝液量為50ml/300ml三角瓶)，另一份土壤樣品加入到含100mg/L草甘膦的1780改液體培養(yǎng)基中(裝液量為50ml/300ml三角瓶)，置30°C搖床中200rpm進行富集培養(yǎng)。
[0050]菌株的馴化與純化:每次富集培養(yǎng)7天,將培養(yǎng)物3000rpm離心IOmin,棄上清,沉淀中重新加入培養(yǎng)基，繼續(xù)馴化。馴化四個周期后，開始逐步提高培養(yǎng)基中草甘膦濃度(草甘勝濃度梯度為:200mg/L, 300mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L, 800 mg/L, 900 mg/L, lOOOmg/L和1200mg/L)，7天為一個馴化周期，并同時在每個馴化周期結(jié)束時取培養(yǎng)液在1780改固體平板上涂布，30°C恒溫培養(yǎng)，挑取單菌落，反復(fù)劃線分離純化，得到單一菌落。其中，在草甘膦馴化濃度為750mg/L時篩選到本`發(fā)明的菌株KT-CGL-7-6。
[0051]3、草甘膦耐受實驗:
在草甘膦抗性菌株篩選過程中共分離到52株抗性菌株，分別對它們進行了草甘膦耐受實驗，并以農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens ) AgLO為陰性對照。草甘膦耐受濃度梯度分別為(mg/L):100、200、500、1000、1200、3000、5000、5500、6000、6500 和 7000，耐受培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基，置30°C搖床中200rpm培養(yǎng)三天，測定培養(yǎng)液的OD6tltl。結(jié)果:可以耐受5000mg/L草甘膦濃度的抗性菌有6株,其中的兩株可以最高耐受6500mg/L的草甘膦,其中本發(fā)明的KT-CGL-7-6可以耐受草甘膦的濃度最高為6500mg/L，而農(nóng)桿菌AgLO對草甘膦的最大耐受濃度只有3000 mg/L。
[0052]4、草甘膦抗性菌株KT-CGL-7-6總DNA的提取及菌種鑒定
將分離獲得的KT-CGL-7-6在3ml液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，用細菌基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取菌體總DNA。
[0053]以提取的總DNA為模板，利用細菌16SrRNA通用弓丨物27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)擴增抗性菌株16SrRNA基因。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠回收后連接PEASYBlunt載體，轉(zhuǎn)化DH5ci，挑取陽性克隆送至英駿公司測序。測序結(jié)果在NCBI中進行序列比對,結(jié)果顯示KT-CGL-7-6為惡臭假單胞菌i^Pseudomorms putida),所以命名為 Pseudoinonas putida KT-CGL-7-6?
[0054]實施例2
高耐受草甘膦的DNA片段克隆
1、PCR方法獲得部分高耐受草甘膦的DNA片段根據(jù)NCBI中公布的Pseudomorms putida的EPSP合酶基因序列設(shè)計引物。
[0055]引物1-F:5' - CGG GATCCGTGGTAAATGCAGCAAAAACCAAACC-3'
引物 1-RA' - CCCA AGCTTGGACACGACTTGCCCTCTTCTGCCACG -3'
用高保真Taq酶KOD-FX從A putida KT-CGL_7_6基因組中擴增EPSP合酶基因的部分序列，PCR 程序:98°C 10 sec,60°C 30 sec,68°C 2min，共 30 個循環(huán)。
[0056]結(jié)果獲得PCR產(chǎn)物共2241bp，命名為P-EPSP合酶基因。P-EPSP合酶基因有2241個核苷酸組成，如SEQ ID No:1所示；P_EPSP合酶基因編碼的蛋白質(zhì)由746個氨基酸組成，如SEQ ID No:2所示。引物1-F的序列如SEQ ID No:3所示；引物1-R的序列如SEQ IDNo:4所示.實施例3植物表達載體PTG2-PEPSP的構(gòu)建 1、PTGl載體的構(gòu)建過程
取載體pCAMBIA2300，通過SacII和BstXI酶切連接，將LB-LB-MAR結(jié)構(gòu)插入PCAMBIA2300,構(gòu)建成 pCAMBIA2300_DLB_MAR，再通過 BamHI 和 PmeI 酶切連接，將另一個 MAR構(gòu)建入PCAMBIA2300-DLB-MAR，得到pTG_ori。通過SpeI和HinIII酶切連接過程，將FMVEnhancer增強子構(gòu)建入pTG-or1-FMV,再經(jīng)過SalI和HinIII酶切，鏈接AtEfl-a pro結(jié)構(gòu)，得到 pTG-or1-FMV-Ef la，最后將 pTG-or1-FMV-Ef Ia 經(jīng)過 XmaI 和 EcoRI 酶切，連接 T-E9片段得到載體PTGl (載體PTGl結(jié)構(gòu)示意圖如附圖1所示)。
[0057]2、根據(jù)P-EPSP合酶基因序列設(shè)計引物2_F和2-R 引物 2-F: TCATGAGTGGTAAATGCAGCAAAAACC
引物 2-R: ACCGGTTCA CGACTTGCCCTCTTCTG
用引物2-F (SEQ ID No:5所示)和引物2-R (SEQ ID No:6所示)對P-EPSP合酶基因序列進行PCR擴增，然后用BspH I和Age I酶切，得到插入片段；取PTGl載體(PTG1載體的結(jié)構(gòu)示意圖為圖1所示)用BspH I和Age I酶切，然后用連接酶連接上述插入片段和載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，經(jīng)含有50mg/L卡那霉素的2 X YT培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選后挑選陽性克隆，抽取質(zhì)粒后經(jīng)測序選擇序列正確的克隆，得具有目標基因的質(zhì)粒，命名為PTG2-PEPSP，結(jié)構(gòu)示意圖見附圖2。
[0058]實施例4:植物轉(zhuǎn)化、苗期篩選
植物轉(zhuǎn)化:將構(gòu)建好的植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AgLtl,用于轉(zhuǎn)化植(作)物:擬南芥、煙草、水稻、玉米、棉花、大豆、小麥、油菜、草坪草以及牧草等。通過農(nóng)桿菌液浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥和玉米；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的縱切幼苗莖尖法轉(zhuǎn)化棉花；通過農(nóng)桿菌侵染愈傷后分化再生獲得轉(zhuǎn)基因水稻；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)組織再生轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因大豆。
[0059]轉(zhuǎn)化擬南芥結(jié)果如下:
Tl代擬南芥苗篩選:含有重組載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲TO代種子并播種，在其長出4片葉時噴灑2.5mM的草甘膦。兩周后，未轉(zhuǎn)基因的擬南芥苗枯死，轉(zhuǎn)基因陽性苗生長狀態(tài)良好，結(jié)果見附圖3。
[0060]根據(jù)P-EPSP合酶基因序列設(shè)計基因檢測引物3-F和3-R，用來檢測P-EPSP序列中的1500bp基因片段。
[0061]引物3-F: GAAGGGGACGGGCACCAGCTGCTGG弓丨物 3-R:TGGTGTGTGCGCAATGAAACTGATGCAT
用引物3-F和3-R PCR進一步在分子水平驗證轉(zhuǎn)基因株系的陽性。每株取兩片嫩葉，用CTAB法提取植物基因組DNA。分別利用引物3-F (SEQ ID No:7所示)和3-R (SEQ ID No:8所示)，以抗性植株基因組DNA模板，擴增P-EPSP合酶基因片段。對PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以檢測到1500bp的目的片段(結(jié)果見附圖4)。我們對7個株系進行了 PCR實驗，結(jié)果全部呈陽性。這進一步證明了我們獲得的擬南芥植株為具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因陽性株系。
[0062]轉(zhuǎn)化煙草的結(jié)果如下:
TO代煙草苗的篩選階段:含有重組載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，收獲TO代種子并播種，在其長出4-5片幼葉時噴灑2.5mM的草甘膦。7天后，未轉(zhuǎn)基因的煙草苗枯死，轉(zhuǎn)基因陽性苗生長狀態(tài)良好。
[0063]轉(zhuǎn)基因煙草植株Ttl代的分子檢測:
取經(jīng)過初步篩選得到的轉(zhuǎn)基因煙草植株Ttl代葉片，提取基因組DNA，以引物3-F和引物3-R進行PCR檢測，擴得大小為1500bp的P- EPSP合酶基因，結(jié)果86%以上為陽性，最終篩選出的陽性煙草Ttl代植株15株。
[0064]i代煙草植株抗性篩選:
對獲得的T1代煙草15個株系進行草甘膦抗性實驗，首先將煙草種子約每100粒種植在實驗箱的一塊區(qū) 段上，待長出幼葉4 - 5葉約30天時，對幼苗噴灑一定濃度的草甘膦。
[0065]用濃度為2.5mM、5mM、10mM和20mM的草甘膦噴灑幼苗，加野生型作為陰性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.5mM的條件下處理5d后野生型全部枯死，轉(zhuǎn)基因樣品均未見明顯損傷；而20mM的條件下，野生型處理2d后就已全部枯死，仍有有大量轉(zhuǎn)基因煙草植株生長良好，表現(xiàn)出很好的草甘膦抗性。由此可見，轉(zhuǎn)P-EPSP合成酶基因的煙草部分株系表現(xiàn)出了很好的草甘膦耐受性，該基因在煙草中實現(xiàn)了很好的表達。
[0066]轉(zhuǎn)化棉花結(jié)果如下:
TO代轉(zhuǎn)基因棉花苗的篩選:重組載體轉(zhuǎn)化植物棉花，用潮霉素抗性篩選Ttl代轉(zhuǎn)基因棉花，從轉(zhuǎn)基因苗中提取基因組DNA用引物3-F和3-R進行PCR分子檢測，從陽性Ttl代轉(zhuǎn)基因棉花植株中收獲T1代種子。
[0067]?代棉花株系的抗性篩選:
T1代棉花株系的篩選:播種Tl代種子，待株系長到4-5葉期時，噴灑草甘膦篩選抗性苗。噴灑的草甘膦實驗濃度有2.5mM、5mM、10mM和20mM。結(jié)果發(fā)現(xiàn):2.5mM時野生型棉花枯萎，轉(zhuǎn)基因棉花生長良好。當草甘膦濃度達到20mM時，轉(zhuǎn)基因棉花仍表現(xiàn)出很好的抗草甘勝能力。
[0068]從抗性結(jié)果可以得出:轉(zhuǎn)P-EPSP基因的棉花部分株系表現(xiàn)出了很好的草甘膦耐受性，該基因在棉花中實現(xiàn)了很好的表達。
[0069]轉(zhuǎn)化水稻結(jié)果如下:
水稻組培苗的篩選階段:對重組載體轉(zhuǎn)化植物水稻，用潮霉素抗性篩選Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻苗，從轉(zhuǎn)基因苗中提取基因組DNA用引物3-F和3-R進行PCR分子檢測，結(jié)果陽性檢出率為90%以上。取陽性Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻苗，收獲T1代種子。
[0070]?代水稻株系的抗性篩選:Tl代水稻長出4片葉時分別噴灑2.5mM、5mM、10mM和20mM的草甘膦。7天后獲得生長良好的轉(zhuǎn)基因Tl代。結(jié)果發(fā)現(xiàn):2.5mM時野生型水稻枯萎，轉(zhuǎn)基因水稻生長良好。當草甘膦濃度達到20mM時，仍有部分株系的植株具有抗草甘膦能力，轉(zhuǎn)基因水稻的抗性苗與敏感苗比例超過2。從上面的結(jié)果可以看出:轉(zhuǎn)PEPSP合酶基因水稻部分株系也表現(xiàn)出了很好的草甘膦耐受性，該基因在水稻中實現(xiàn)了很好的表達。
[0071]轉(zhuǎn)化玉米結(jié)果如下:
Tl代轉(zhuǎn)基因玉米篩選:含有重組載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米純合親本，收獲TO代種子并播種，在其長出4片葉時噴灑2.5mM、5mM、10mM和20mM的草甘膦。7天后，未轉(zhuǎn)基因的玉米苗枯死，轉(zhuǎn)基因陽性苗生長狀態(tài)良好。結(jié)果發(fā)現(xiàn):2.5mM時野生型玉米枯萎，轉(zhuǎn)基因玉米生長良好。當草甘膦濃度達到20mM時，仍有部分株系的轉(zhuǎn)基因玉米的抗性苗與敏感苗比例超過2，轉(zhuǎn)基因玉米植株表現(xiàn)出很好的抗草甘膦能力(見附圖5)，共獲得高抗玉米株系共11株。
[0072]從上面的結(jié)果可以看出:轉(zhuǎn)P-EPSP合酶基因玉米部分株系也表現(xiàn)出了很好的草甘膦耐受性，該基因在玉米中實現(xiàn)了很好的表達。
[0073]轉(zhuǎn)化大豆結(jié)果如下:
大豆組培苗篩選:重組載體轉(zhuǎn)化糧食作物大豆，直接用草甘膦作為篩選劑在培養(yǎng)基上成苗。Tl代直接擴繁不篩選，一粒種子成苗算一個株系單株收種，T2代噴灑草甘膦直接篩選抗性株系，草甘膦濃度為2.5mM、5mM、10mM和20mM。
[0074]結(jié)果發(fā)現(xiàn):2.5mM時野生型大豆枯萎，轉(zhuǎn)基因大豆生長良好。當草甘膦濃度達到20mM時，轉(zhuǎn)P-EPSP合酶基因的大豆植株仍然表現(xiàn)出很好的抗草甘膦能力(見附圖6 )。從轉(zhuǎn)基因苗葉片中提取基因組DNA用引物3-F和引物3-R進行PCR分子檢測，結(jié)果抗性植株均為轉(zhuǎn)基因陽性苗。
[0075]從上面的結(jié)果可以看出:轉(zhuǎn)P-EPS`P合酶基因大豆部分株系也表現(xiàn)出了很好的草甘膦耐受性，該基因在大豆中實現(xiàn)了很好的表達。
[0076]最后，還需要強調(diào)的是，以上舉例的僅是本發(fā)明其中的幾個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.使植物具有草甘膦抗性的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
2.權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
3.使植物具有草甘膦抗性的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示。
4.表達盒、載體或細胞，其包含權(quán)利要求1-2所述的基因。
5.權(quán)利要求1-2所述的基因、權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求4所述的表達盒、載體或細胞、包含權(quán)利要求1-2所述的基因的植物、或表達權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)的植物在獲得具有除草劑抗性的植物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，其包括在獲得具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因植物過程中的應(yīng)用和在獲得具有草甘膦抗性的非轉(zhuǎn)基因植物過程中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5-6所述的應(yīng)用，其特征在于，通過轉(zhuǎn)基因育種方式或者非轉(zhuǎn)基因育種方式獲得具有草甘膦抗性的植物。
8.獲得具有草甘膦抗性的植物的方法，其包括如下步驟: (O使植物包含權(quán)利要求1- 2所述的基因；和/或， (2)使植物表達權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其包括轉(zhuǎn)基因、雜交、回交、自交或無性繁殖步驟。
10.鑒定植物的方法，其中植物包含權(quán)利要求權(quán)利要求1或2所述的基因的植物、表達權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)的植物或者權(quán)利要求8或9所述的方法獲得的植物，其包括如下步驟: (1)測定所述植物是否包含權(quán)利要求1或2所述的基因；和/或， (2)測定所述植物是否表達權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求ι-?ο任一項所述，其特征在于:所述植物包括單子葉植物或雙子葉植物，其中單子葉植物為水稻、玉米、小麥，雙子葉植物為擬南芥、煙草、棉花、大豆。
【文檔編號】C12N9/10GK103695446SQ201310737930
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月31日
【發(fā)明者】夏勉, 徐海英, 徐沫文, 張斌 申請人:北京未名凱拓作物設(shè)計中心有限公司