一種無(wú)動(dòng)物源的低蛋白培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體提供一種新的支持CHO細(xì)胞大規(guī)模貼壁培養(yǎng)和單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無(wú)動(dòng)物源低蛋白培養(yǎng)基，充分利用現(xiàn)有技術(shù)中的成分代替動(dòng)物來(lái)源的組分，最終獲得的培養(yǎng)基無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分，能去除血清對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的干擾，降低成本，實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞高密度貼壁培養(yǎng)和單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，為生物制品的規(guī)?；a(chǎn)提供方便。
【專利說(shuō)明】一種無(wú)動(dòng)物源的低蛋白培養(yǎng)基
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種適于CHO細(xì)胞大規(guī)模貼壁培養(yǎng)和單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無(wú)動(dòng)物源的低蛋白培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CH0)細(xì)胞為代表的真核表達(dá)系統(tǒng)是現(xiàn)代制藥工業(yè)的重要組成部分，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，它具有許多優(yōu)點(diǎn):第一，具有高效的重組基因擴(kuò)增和表達(dá)能力；第二，有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子；第三，很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，具有產(chǎn)物胞外分泌功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；第四，CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，既可以貼壁生長(zhǎng)，也可以懸浮生長(zhǎng)。即CHO細(xì)胞既可以貼壁生長(zhǎng)在微載體介質(zhì)表面，也可以懸浮生長(zhǎng)在發(fā)酵罐中。微載體作為一種新興的利用CHO細(xì)胞貼壁附著在微載體上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于組織工程中種子細(xì)胞的擴(kuò)增(王常勇.采用微載體技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)組織工程種子細(xì)胞[J].生物醫(yī)學(xué)工程與臨床，2002,6(1):51254.);發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器等大規(guī)模懸浮培養(yǎng)CHO細(xì)胞的技術(shù)，以其易于擴(kuò)大化等優(yōu)勢(shì)，也在工程細(xì)胞培養(yǎng)中得到了廣泛應(yīng)用。(陳志南，楊向民.基于抗體等重組蛋白表達(dá)產(chǎn)品的哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2009，4 (5):325 — 328.)兩種培養(yǎng)方式均在重組藥物的研究中占據(jù)重要的位置。從這個(gè)角度來(lái)講，研發(fā)一種既滿足CHO細(xì)胞不同生長(zhǎng)方式，同時(shí)又適合其大規(guī)模高密度擴(kuò)增的培養(yǎng)基具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]此外，傳統(tǒng)的CHO細(xì)胞貼壁培養(yǎng)是在含8%~10%牛血清的培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)，血清雖然營(yíng)養(yǎng)成分豐富，但是有很多不足的地方--第一，血清各批次間差異很大，其成分不能保持一致；第二，血清或血清來(lái)源的物質(zhì)，如血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素或其他外源性物質(zhì)中可能存在支原體或病毒等污染物，會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用；第三，血清組分復(fù)雜，給產(chǎn)品純化帶來(lái)了巨大困擾，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的提升；第四，由于組分不明確，很難根據(jù)不同細(xì)胞株設(shè)計(jì)和優(yōu)化能夠支持其高密度培養(yǎng)和高水平表達(dá)的培養(yǎng)基。
[0004]綜上可知，在CHO無(wú)血清培養(yǎng)基中摒棄動(dòng)物來(lái)源成分，同時(shí)盡可能降低培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量，無(wú)論從產(chǎn)品產(chǎn)量還是質(zhì)量角度來(lái)講都是開發(fā)CHO無(wú)血清培養(yǎng)基的主流方向。
[0005]關(guān)于無(wú)血清培養(yǎng)基的開發(fā)，已經(jīng)有過(guò)許多嘗試:
[0006]Gyun Min Lee 等人(Gyun M L, Eun J K, No S K, et al.Development of aserum-free medium for the production of erythropoietin by suspension culture ofrecombinant Chinese hamster ovary cells using a statistical design[J].Journalof Biotechnology, 1999 (69):85-93.)開發(fā)了無(wú)血清培養(yǎng)基，以頂DM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了 2mg/LFe (NO3) 3.9H20,0.0025mg/L CuCl2、和 lmg/LZnS04.7H20 作為微量元素，同時(shí)添加了 2.5-5mg/L胰島素，10-20mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用于表達(dá)EPO的CHO工程細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。[0007]Chi Hsien Liu 等人(Chi H L, 1-Ming C，Shiaw M H, et al.Factorial designscombined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHOcells [J].Enzyme and Microbial Technology, 2001, 28:314-321.)開發(fā)了無(wú)血清培養(yǎng)基，以MDM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了 1%SITE (硒，胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，乙醇胺)，0.3g/L酵母抽提物，0.09%亞麻油脂-牛血清白蛋白，用于CHO細(xì)胞的無(wú)血清懸浮培養(yǎng)，這些添加物能夠很好的促進(jìn)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0008]Chisa Hayashi 等人(Chisa H, Kentaro S, Hideki Y, et al.Comparative Studyon Delivery of Phosphatidic Acid to Serum-Free Culture of Chinese Hamster OvaryCells[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2003,96 (2):196-198.)在 CHO無(wú)血清懸浮培養(yǎng)中，以MEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2.2g/L碳酸氫鹽，15mM羥乙基哌嗪乙磺酸,0.lg/L卡那霉素硫酸鹽，10mg/L纖連蛋白，lmg/L吐溫80,10mg/L磷脂酸(或10mg/L環(huán)糊精)，發(fā)現(xiàn)吐溫80和磷脂酸在該培養(yǎng)基促進(jìn)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)的作用較為顯著，提示脂類是CHO細(xì)胞無(wú)血清生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
[0009]J.L.Moreira 等人(J.L.Moreira, P.M.Alves, A.S.Feliciano, et al.Serum-freeand serum-containing media for growth of suspended BHK aggregates in stirredvessels[J].Enzyme and Microbial Technology,1995，17:437-444.)以 DMEM/F12 (v/v,1:1)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加了 10mg/L人胰島素,5pg/L巰基乙醇,4mM谷氨酰胺,4g/L葡萄糖，lmg/L膽固醇，lmg/L谷胱甘肽，lg/L血清白蛋白等成分，開發(fā)出的無(wú)血清培養(yǎng)基，能很好的適用于BHK細(xì)胞(敘利亞倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)的培養(yǎng)，同時(shí)有效緩解了細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。
[0010]Kiyoshi Ohnuma 等人(Kiyoshi O, Yohei H, Miho F, et al.Serum-free cultureconditions for serial subculture of undifferentiated PC12cells[J].Journal ofNeuroscience Methods, 2006,151:250-261.)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞(大鼠嗜鉻瘤細(xì)胞)，以RPMI1640:DMEM(v/v, I:1)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時(shí)添加30ug/ml胰島素，3_30ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，2g/L碳酸氫鹽，15`mM輕乙基哌嗪乙磺酸,5mM L-谷氨酰胺，IOnM亞硒酸鈉，110mg/L丙酮酸鈉,3.25g/L葡萄糖和100mg/L卡那霉素硫酸鹽,發(fā)現(xiàn)該無(wú)血清培養(yǎng)基能夠較含血清培養(yǎng)基更好的支持PC12細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，且貼壁形態(tài)良好。
[0011 ] 雖然以上列舉的無(wú)血清培養(yǎng)基能夠?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)提供良好的營(yíng)養(yǎng)條件，但是其中含有較多的動(dòng)物來(lái)源蛋白質(zhì)，使得產(chǎn)品質(zhì)量和安全面臨考驗(yàn)，同時(shí)也為純化帶來(lái)了困難。而商品化的Hyclone、Invitrogen無(wú)血清培養(yǎng)基雖然不含蛋白質(zhì),但是其價(jià)格昂貴,成分秘而不宣，為CHO細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)增加了巨大的成本。
[0012]申請(qǐng)?zhí)枮?00910053506.8的中國(guó)專利“適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基”公開了一種無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基，其可用于CHO細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，最大活細(xì)胞密度達(dá)到3.75X 106cells/ml，但是未證明其能否適合CHO細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，使該培養(yǎng)基在微載體培養(yǎng)技術(shù)方面的應(yīng)用受到了限制。
[0013]因此，目前市場(chǎng)急需開發(fā)一種無(wú)動(dòng)物來(lái)源成份、蛋白含量較低、適合CHO細(xì)胞大規(guī)模貼壁培養(yǎng)和單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)并能高效擴(kuò)增的培養(yǎng)基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足和空白，本發(fā)明的發(fā)明人提供一種新的支持CHO細(xì)胞大規(guī)模貼壁培養(yǎng)和單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無(wú)動(dòng)物源低蛋白培養(yǎng)基，其無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分，能去除血清對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的干擾，降低成本，實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞高密度貼壁培養(yǎng)和單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，為生物制品的規(guī)?；a(chǎn)提供方便。。
[0015]本發(fā)明的具體技術(shù)方案是:
[0016]采用RPMI1640/F12 (v/v，1:1)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用酵母抽提物和大豆水解物替代動(dòng)物來(lái)源成分，特別是血清成分，采用金精三羧酸和硫酸鋅代替胰島素，采用檸檬酸鐵代替轉(zhuǎn)鐵蛋白，并添加化學(xué)組分明確的脂類物質(zhì)、微量元素、抗氧化劑、保護(hù)細(xì)胞免受流體剪切力損傷和抑制細(xì)胞結(jié)團(tuán)的化合物、以及其他物質(zhì)；
[0017]其中所述的脂類物質(zhì)包括:磷脂酰膽堿、乙醇胺、吐溫80 ；
[0018]所述的微量元素包括:硝酸鐵、氯化銅、硫酸鋅、亞硒酸鈉；
[0019]所述的抗氧化劑為:β -巰基乙醇；
[0020]所述的保護(hù)細(xì)胞免受流體剪切力損傷和抑制細(xì)胞結(jié)團(tuán)的化合物包括:嵌段式聚醚F-68 (Pluronic F-68)、硫酸葡聚糖；
[0021]所述的其他添加物為:L_谷氨酰胺；
[0022]其具體配比如下:
[0023]每升RPMI1640/F12 (v/v，1:1)培養(yǎng)基中，各組分具體用量如下:
[0024]
酵母抽提物500-5000毫克/升
大豆水解物500-10000毫克/升
金精三羧酸5-100毫克/升
杵檬酸鐵2-500毫克/升
磷脂酰膽堿丨-20毫克/升
乙醇胺1-30毫克/升
吐溫800.5-10毫克/升
硝酸鐵0.5-2毫克/升
氯化銅0.001-().02毫克/升
硫酸鋅0.1-2毫克/升
亞硒酸鈉15-300毫克/升
P-鼓基乙醇10-50μΜ
嵌段式聚醚F-68(Pluronic F-(爾 〗00-3000毫克/升
硫酸葡聚糖30-100毫克/升
L-谷氨酰胺292-1460毫克/升；
[0025]其中所述的RPMI1640/F12 (v/v，1:1)培養(yǎng)基為將購(gòu)買的液體RPMI1640培養(yǎng)基與液體F12培養(yǎng)基按體積比1:1混合，然后將各組分溶解于RPMI1640/F12 (v/v，l:l)培養(yǎng)基中，定容至終體積1L，用0.22 μ m微孔膜濾器過(guò)濾除菌獲得。
[0026]其中，金精三羧酸是一種是核酸酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的抑制劑，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)它還可以通過(guò)增加酪氨酸和絲氨酸的磷酸化進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；硫酸鋅能調(diào)節(jié)胰島素和受體的水平，在維持受體磷酸化和去磷酸化水平及胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)硫酸鋅作為一種微量元素，在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)方面也發(fā)揮重要作用；檸檬酸鐵可作為替代的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與細(xì)胞膜上的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體結(jié)合，促進(jìn)鐵的穿膜傳遞、穩(wěn)定培養(yǎng)基的活性、對(duì)細(xì)胞起機(jī)械保護(hù)作用。更重要的是，胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白中含有大量動(dòng)物來(lái)源成份，為下游純化帶來(lái)了困擾，而金精三羧酸、硫酸鋅和檸檬酸鐵不含動(dòng)物來(lái)源成份，可以作為胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的良好替代品。
[0027]酵母抽提物和大豆水解物均含豐富的蛋白水解物，能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供重要的氨基酸、短肽等營(yíng)養(yǎng)物，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；乙醇胺和磷脂酰膽堿與磷脂的合成有關(guān)，后者在生物膜的構(gòu)建與重塑過(guò)程中發(fā)揮作用；吐溫80為非離子型表面活性劑，一方面促進(jìn)培養(yǎng)基的溶解，一方面減小細(xì)胞受到的剪切力損傷；硝酸鐵，氯化銅，亞硒酸鈉等微量元素通過(guò)與蛋白質(zhì)和其他有機(jī)基團(tuán)結(jié)合，形成了酶、激素、維生素等生物大分子，發(fā)揮著重要的生理生化功能；β -巰基乙醇是一種抗氧化劑，為細(xì)胞提供還原環(huán)境，使細(xì)胞免受自由基和活性氧的損傷，同時(shí)也是部分酶的抑制劑和激素的激活劑；嵌段式聚醚F-68(PluiOnic F-68)是細(xì)胞生長(zhǎng)中重要的脂類物質(zhì)，也是良好的剪切力保護(hù)劑；硫酸葡聚糖既是一種剪切力保護(hù)劑，又可以減少細(xì)胞的聚集；L_谷氨酰胺可以為細(xì)胞提供必需的氮源，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。
[0028]其中在培養(yǎng)基的選擇上，本發(fā)明選用了 RPMI1640/F12 (v/v，1:1)培養(yǎng)基，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基與現(xiàn)在常用的DMEM/F12 (v/v, 1:1)培養(yǎng)基相比，與本發(fā)明的其他添加物的組合效果要好，故而首次采用了這種混合培養(yǎng)基。
[0029]而且本發(fā)明的發(fā)明人結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終在眾多的添加物中選取了上述的物質(zhì)，其組合效果最好，可以實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞高密度貼壁培養(yǎng)和單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，為生物制品的規(guī)?；a(chǎn)提供方便，較之現(xiàn)有的培養(yǎng)基有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。
[0030]在上述配比的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步確定了較為優(yōu)選的技術(shù)方案，其具體配比如下:
[0031]每升RPMI1640/F12培養(yǎng)基中，含有下述用量的組分:
[0032]
酵母抽提物3000-5000毫克/升
大豆水解物2000-5000毫克/升
金精三羧酸8-60毫克/升
4寧檬酸鐵40-70毫克/升
磚脂酰膽堿4-7毫克/升
乙醇胺3-6毫克/升
吐溫800.5-3毫克/升
硝酸鐵0.8-2毫克/升
氯化銅0.0025-0.01毫克/升 硫酸鋅0.9-1.2毫克/升
亞硒酸鈉20-50毫克/升
β-巰基乙醇15-35 μΜ
嵌段式聚醚 F-68(P1uronic.F-68) 80-1500 毫克/升
[0033]硫酸葡聚糖25-70毫克/升
L-谷氨酰胺292-876毫克/升。
[0034]在上述兩個(gè)配比的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步確定了兩個(gè)最優(yōu)選的技術(shù)方
案，其具體配比如下:
[0035]A:每升RPMI1640/F12(v/v，1:1)培養(yǎng)基中，各組分具體用量如下:
[0036]
酵母抽提物5000毫克/升
大豆水解物4000毫克/升
金精三羧酸10毫克/升
杵檬酸鐵
50毫克/升
磷脂酰膽堿5毫克/升
乙縛胺3毫克/升
吐溫800.5毫克/升
硝酸鐵2毫克/升
氯化銅0.0025毫克/升
硫酸鋅1毫克/升
亞硒酸鈉50毫克/升
β-巰基乙醇20 μ M
嵌段式聚醚F-68(Pluronic F-68)100毫克/升
硫酸葡聚糖40毫克/升
L-谷氨醜胺292毫克/升；
[0037]B:每升RPMI1640/F12(v/v，1:1)培養(yǎng)基中，各組分具體用量如下:
[0038]
酵母抽提物3000毫克/升
大豆水解物2000毫克/升
金精三羧酸55毫克/升
檸檬酸鐵
50毫克/升
磷脂it膽堿5毫克/升
乙醇胺3毫克/升
吐溫802,5毫克/升
硝酸鐵2毫克/升
氯化銅0.0025毫克/升
碗酸鋅1毫克/升
亞硒酸鈉50毫克/升
(3-巰基乙醇20 μ M
嵌段式聚醚F-68(P丨uronic F-68)1000毫克/升
硫酸葡聚糖40毫克/升
L-谷氨聽胺292毫克/升；[0039]上述兩個(gè)配比的技術(shù)方案能夠更好地支持CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)，特別是當(dāng)金精三羧酸濃度在8-60毫克/升范圍內(nèi)、檸檬酸鐵濃度在40-70毫克/升范圍內(nèi)、硫酸鋅濃度在
0.9-1.2毫克/升范圍內(nèi)時(shí)，CHO細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)消耗和供給可以得到更好的平衡，細(xì)胞可以獲得較高的生長(zhǎng)密度。
[0040]上述培養(yǎng)基的制備方法較為普通，將購(gòu)買的液體RPMI1640培養(yǎng)基與液體F12培養(yǎng)基按體積比1:1混合，將各組分溶解于RPMI1640/F12 (v/v,1:1)培養(yǎng)基中，定容至終體積1L，用0.22 μ m微孔膜濾器過(guò)濾除菌后即可獲得；應(yīng)用時(shí)，可直接按照普通含血清培養(yǎng)基的使用方法直接使用。
[0041]綜上所述，本發(fā)明提供一種新的支持CHO細(xì)胞大規(guī)模貼壁培養(yǎng)和單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無(wú)動(dòng)物源低蛋白培養(yǎng)基，充分利用現(xiàn)有技術(shù)中的成分代替動(dòng)物來(lái)源的組分，最終獲得的培養(yǎng)基無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分，能去除血清對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的干擾,降低成本,實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞高密度貼壁培養(yǎng)和單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，為生物制品的規(guī)?；a(chǎn)提供方便。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1倒置顯微鏡下觀察的CHO細(xì)胞在實(shí)施例2制備的培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)48小時(shí)后的細(xì)胞圖；
[0043]圖2CH0細(xì)胞在實(shí)施例2制備的培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)的活細(xì)胞密度變化圖；
[0044]圖3CH0細(xì)胞在實(shí) 施例3制備的培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)的活細(xì)胞密度變化圖；
[0045]圖4倒置顯微鏡下觀察的CHO細(xì)胞在實(shí)施例4制備的培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)72小時(shí)后的細(xì)胞圖；
[0046]圖5CH0細(xì)胞在實(shí)施例4制備的培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的活細(xì)胞密度變化圖；
[0047]圖6CH0細(xì)胞在實(shí)施例5制備的培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的活細(xì)胞密度變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面通過(guò)具體的制備實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實(shí)施例僅僅是用于更詳細(xì)具體地說(shuō)明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。
[0049]本發(fā)明實(shí)施例中所使用的培養(yǎng)基成分和CHO細(xì)胞均可市購(gòu)獲得:
[0050]CHO-KI細(xì)胞:購(gòu)自美國(guó)ATCC ;
[0051]RPMI1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、嵌段式聚醚F68 (Pluronic F-68)、L-谷氨酰胺:購(gòu)自Gibco公司；
[0052]酵母抽提物、大豆水解物:購(gòu)自BD公司；
[0053]金精三羧酸、硫酸鋅、檸檬酸鐵、乙醇胺、磷脂酰膽堿、吐溫80、硝酸鐵、氯化銅、亞硒酸鈉、β-巰基乙醇、硫酸葡聚糖:購(gòu)自sigma公司；
[0054]其余培養(yǎng)基成分均可市購(gòu)獲得。
[0055]Plackett-Burman 試驗(yàn)的定義:
[0056]Plackett-Burman試驗(yàn)就是篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì),主要針對(duì)因子數(shù)較多，且未確定眾因子相對(duì)于響應(yīng)變量的顯著影響，采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。方法主要通過(guò)對(duì)每個(gè)因子取兩水平來(lái)進(jìn)行分析，通過(guò)比較各個(gè)因子兩水平的差異與整體的差異來(lái)確定因子的顯著性。篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)不能區(qū)分主效應(yīng)與交互作用的影響，但對(duì)顯著影響的因子可以確定出來(lái)，從而達(dá)到篩選的目的，避免在后期的優(yōu)化試驗(yàn)中由于因子數(shù)太多或部分因子不顯著而浪費(fèi)試驗(yàn)資源。
[0057]響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的定義:
[0058]是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過(guò)試驗(yàn)得到一定的數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法。
[0059]實(shí)施例1
[0060]用Plackett-Burman試驗(yàn)法篩選影響CHO無(wú)血清培養(yǎng)基的主要因素及其使用濃度，實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0061]將CHO細(xì)胞(CHO-Kl)置于本發(fā)明所述的無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行單細(xì)胞懸浮培養(yǎng):接種于美國(guó)Corning公司的125毫升搖瓶中，培養(yǎng)液體積為20毫升，接種密度為6 X IO5細(xì)胞/毫升，置二氧化碳培養(yǎng)箱中搖動(dòng)培養(yǎng)，溫度36.5°C，二氧化碳5vt%，轉(zhuǎn)速150rpm。
[0062]CHO細(xì)胞懸浮培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)以RPMI1640/F12 (v/v,1:1)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)酵母提取物(XI)、金精三羧酸(X2)、檸檬酸鐵(X3)、大豆提取物(X4)、磷脂酰膽堿(X5)、乙醇胺(乂6)、吐溫80(乂7)、微量元素(X8)、β-巰基乙醇(Χ9)、嵌段式聚醚F-68(X10)、硫酸葡聚糖(X11)、L-谷氨酰胺(X12)共12個(gè)因子進(jìn)行考察，每個(gè)因子分別取低和高2個(gè)水平，響應(yīng)值為活細(xì)胞密度(Y)，平行實(shí)驗(yàn)3次，試驗(yàn)情況參見下述各表:
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種無(wú)動(dòng)物源的低蛋白培養(yǎng)基，以RPMI1640/F12，v/v為1:1作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其特征在于:培養(yǎng)基中含有如下物質(zhì): 酵母抽提物，大豆水解物，金精三羧酸，檸檬酸鐵，脂類物質(zhì)、微量元素、抗氧化劑、保護(hù)細(xì)胞免受流體剪切力損傷和抑制細(xì)胞結(jié)團(tuán)的化合物、以及其他物質(zhì)；其中， 所述的脂類物質(zhì)包括:磷脂酰膽堿、乙醇胺、吐溫80 ； 所述的微量元素包括:硝酸鐵、氯化銅、硫酸鋅、亞硒酸鈉； 所述的抗氧化劑為:β -巰基乙醇； 所述的保護(hù)細(xì)胞免受流體剪切力損傷和抑制細(xì)胞結(jié)團(tuán)的化合物包括:嵌段式聚醚F-68 (Pluronic F-68)、硫酸葡聚糖； 所述的其他添加物為:L-谷氨酰胺。
2.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的無(wú)動(dòng)物源的低蛋白培養(yǎng)基，其特征在于:每升RPMI1640/F12培養(yǎng)基中，含有下述用量的組分: 酵母抽提物500-5000毫克/升大豆水解物500-10000毫克/升 金精三羧酸5-100毫克/升 檸檬酸鐵2-500毫克/升 磷脂醜膽域1-20毫克/升 乙醇胺1-30毫克/升 吐溫800,5-10毫克/升 硝酸鐵0.5-2毫克/升氯化銅0.001 -0.02毫克/升 硫酸鋅0,1-2毫克/升 亞爾酸鈉15-300毫克/升 P-巰基乙醇10-50 μ.Μ.嵌段式聚醚F-68(P〗uiOnic F-68)100-3000毫克/升 硫酸葡聚糖30-100毫克/升L-谷氨酰按292-1460毫克/升^
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)動(dòng)物源的低蛋白培養(yǎng)基，其特征在于:每升RPMI1640/F12培養(yǎng)基中，含有下述用量的組分:酵母抽提物3000-5000毫克/升 大豆水解物2000-5000毫克/升 金精三羧酸8-60毫克/升 檸檬酸鐵40-70毫克/升 磷脂酰膽堿4-7毫克/升 乙醇胺3-6毫克/升 吐溫肋0.5-3毫克/升 硝酸鐵0.8-2毫克/升 氯化銅0.0025-0,01毫克/升 硫酸鋅0,9-1,2毫克/升 亞硒酸納20-50毫克/升 β-巰基乙醇15-35 μΜ
嵌段式聚醚 F-68(Pluronic F-68)80-1500 毫克/升 硫酸葡聚糖25-70毫克/升 L-谷氨酰胺292-876毫克/升?`
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的無(wú)動(dòng)物源的低蛋白培養(yǎng)基，其特征在于:每升RPMI1640/F12培養(yǎng)基中，含有下述用量的組分: 酵母抽提物5000毫克/升 大豆水解物4000毫克/升 金精三羧酸10毫克/升 杵檬酸鐵50毫克/升 磷脂醜膽堿5毫克/升 乙醇胺3毫克/升 吐溫800.5毫克/升 硝酸鐵2毫克/升 氯化銅0.0025毫克/升 磽酸鋅I毫克/升 亞硒酸鈉50毫克/升 P-巰基乙醇20 μ M
嵌段式聚醚F-68(Pkironic F~68)100毫克/升 硫酸葡聚糖40毫克/升 L-谷氨酰胺292毫克/升。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的無(wú)動(dòng)物源的低蛋白培養(yǎng)基，其特征在于:每升RPMI1640/F12培養(yǎng)基中，含有下述用量的組分:酵母抽提物3000毫克/升大豆水解物2000毫克/升金精三羧酸55毫克/升檸檬酸鐵50毫克/升磷脂酰膽堿5毫克/升乙醇胺3毫克/升吐溫802.5毫克/升硝酸鐵2毫克/升氯化銅0.0025毫克/升硫酸鋅I毫克/升亞硒酸鈉50毫克/升P-巰基乙醇20 μ M嵌段式聚醚F-68(Pluronic F-68)1000毫克/升疏酸葡聚糖40毫克/升 L-谷氨酰胺292毫克/升《.
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103484426SQ201310481858
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】劉吉, 孫麗霞, 李劍鳳, 王桂江, 劉傳磊, 張建軍, 朱蕾 申請(qǐng)人:齊魯制藥有限公司