一種篩查擴(kuò)張型心肌病的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種篩查擴(kuò)張型心肌病的試劑盒，所述的試劑盒的檢測(cè)基因?yàn)镸YBPC3、SCN5A、MYH7和MYPN四個(gè)基因。本發(fā)明還提供MYBPC3、SCN5A、MYH7和MYPN四個(gè)基因在制備篩查擴(kuò)張型心肌病的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明篩選出中國(guó)漢族人群最易感的4個(gè)散發(fā)性擴(kuò)張型心肌病致病基因，開發(fā)出對(duì)中國(guó)漢族人群散發(fā)性擴(kuò)張型心肌病有效的早期診斷方法和診斷試劑盒，有效提高擴(kuò)張型心肌病患者早期檢出率，從而做到早期治療，提高患者生存率；與目前昂貴且低效的擴(kuò)張型心肌病基因篩查方法相比，這4個(gè)高危致病基因的發(fā)現(xiàn)將使篩查更有針對(duì)性，從而減少檢測(cè)費(fèi)用，且提高檢出效率。
【專利說(shuō)明】一種篩查擴(kuò)張型心肌病的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)，是一種對(duì)中國(guó)漢族人群散發(fā)性擴(kuò)張型心肌病有效的早期診斷方法和篩查試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]擴(kuò)張型心肌病是最常見(jiàn)的心肌病之一，以心室腔擴(kuò)大、心肌收縮功能下降而左心室壁厚度正常為主要特征，是心力衰竭的第三位原因，是心臟移植的第一位原因?？捎晒谛牟　⑿募⊙准跋到y(tǒng)性疾病引起,但也可為原發(fā)性。原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病率約40/10萬(wàn)人，其發(fā)病的細(xì)胞及分子機(jī)制尚不明確。約有30%的病例表現(xiàn)為家族遺傳性，而最近我們發(fā)現(xiàn)，70%的散發(fā)性擴(kuò)張型心肌病同樣存在多種基因突變，提示遺傳因素在其發(fā)病中的重要地位。
[0003]對(duì)于擴(kuò)張型心肌病，目前尚缺乏有效的早期診斷和治療方法。未行心臟移植的患者中約有50%在診斷擴(kuò)張型心肌病后5年內(nèi)死亡，雖然血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β受體阻滯劑等藥物及植入型心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器等治療手段的出現(xiàn)可能會(huì)延長(zhǎng)該病患者的生存期，但迄今擴(kuò)張型心肌病仍是一種死亡率較高的疾病。通過(guò)篩查高危基因來(lái)早期發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病患者，繼而做到早期治療，是提高該病生存率的有效方法。
[0004]目前對(duì)擴(kuò)張型心肌病的高危基因篩查已在少數(shù)三甲醫(yī)院開展，但是由于沒(méi)有針對(duì)性，僅是籠統(tǒng)的囊括大部分可能的致病基因，導(dǎo)致突變檢出率很低，而且價(jià)格昂貴。
[0005]中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1824776A公開了確定患者對(duì)心臟疾病特別是擴(kuò)張型心肌病的遺傳易感性或者診斷患者心臟疾病特別是擴(kuò)張型心肌病的方法，包括檢測(cè)LMNA基因中的至少一個(gè)單核苷酸多態(tài)性，特別是LMNA基因第244位核苷酸的多態(tài)性(如G244A)或者IaminA蛋白質(zhì)第82位氨基酸的突變。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102443630A公開了人PPP2R3A的基因突變及其與擴(kuò)張性心肌病的相關(guān)性，提供了檢測(cè)人PPP2R3A基因的突變的方法，并提供了相關(guān)的檢測(cè)試劑盒，是通過(guò)確定SEQIDN0:1所示序列中第361位核苷酸，檢測(cè)其是否存在G — A突變。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101580835A公開了一種心臟鈉通道基因SCN5A新突變體及其檢測(cè)方法，公開了一種SCN5A突變，位于外顯子20、心臟鈉通道蛋白1180位A變?yōu)榱?V，該突變是擴(kuò)張性心臟病的致病原因，為擴(kuò)張型心肌病的早期診斷及新的治療方案提供了一種新方法。但是關(guān)于一種檢出率高且節(jié)省檢測(cè)費(fèi)用的擴(kuò)張型心肌病有效的早期診斷方法和篩查診斷試劑盒目前還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種篩查擴(kuò)張型心肌病的試劑盒。
[0007]本發(fā)明的再一的目的是，提供HAiffiTZ和#7/W四個(gè)基因的應(yīng)用。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種篩查擴(kuò)張型心肌病的試劑盒，所述的試劑盒的檢測(cè)基因?yàn)槿薙CN5A、MYH7和#7/W四個(gè)基因。
[0009]所述的試劑盒內(nèi)包含用于對(duì)人SCN5A、iffiTZ和#7/W基因進(jìn)行全外顯子測(cè)序的試劑。
[0010]所述的試劑盒的檢測(cè)樣本為靜脈血。
[0011 ] 所述的試劑盒對(duì)人#7說(shuō)^、5'00兒#^77和#7/^四個(gè)基因進(jìn)行全外顯子測(cè)序，從而發(fā)現(xiàn)受試者有無(wú)攜帶突變位點(diǎn)，即擴(kuò)張型心肌病的致病位點(diǎn)。
[0012]為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是-.:KMYBPC3、SCN5A、iffiTZ和MYPN四個(gè)基因在制備篩查擴(kuò)張型心肌病的試劑盒中的應(yīng)用。
[0013]所述的試劑盒內(nèi)包含用于對(duì)人#7說(shuō)^義SCN5A、JffiTZ和#7/W基因進(jìn)行全外顯子測(cè)序的試劑。
[0014]所述的試劑盒的檢測(cè)樣本為靜脈血。
[0015]貧KMYBPC3、HAiffiTZ和#7/W四個(gè)基因進(jìn)行全外顯子測(cè)序，從而發(fā)現(xiàn)受試者有無(wú)攜帶突變位點(diǎn)，即擴(kuò)張型心肌病的致病位點(diǎn)。
[0016]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
1、本發(fā)明篩選出中國(guó)漢族人群最易感的4個(gè)散發(fā)性擴(kuò)張型心肌病致病基因，開發(fā)出對(duì)中國(guó)漢族人群散發(fā)性擴(kuò)張型心肌病有效的早期診斷方法和診斷試劑盒，有效提高擴(kuò)張型心肌病患者早期檢出率，從而做到早期治療，提高患者生存率；
2、與目前昂貴且低效的擴(kuò)張型心肌病基因篩查方法相比，這4個(gè)高危致病基因的發(fā)現(xiàn)將使篩查更有針對(duì)性，從而減少檢測(cè)費(fèi)用，且提高檢出效率。 【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0018]實(shí)施例1篩選最危險(xiǎn)基因
1)入選66例散發(fā)擴(kuò)張型心肌病患者，抽取靜脈血3ml，抽提DNA；
2)通過(guò)二代測(cè)序的方法對(duì)這些患者進(jìn)行24個(gè)導(dǎo)致家族性擴(kuò)張型心肌病的基因全測(cè)
序;
3)測(cè)序結(jié)果是:共發(fā)現(xiàn)87個(gè)非同義位點(diǎn)，為明確這些位點(diǎn)是否為突變，與NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)dbSNP (單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù))、1000 genomes project database(千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù))比對(duì)，同時(shí)從千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中將197例中國(guó)成人作為同種族對(duì)照組，計(jì)算這些位點(diǎn)在數(shù)據(jù)庫(kù)和對(duì)照組中的攜帶率，與病例隊(duì)列中的攜帶率比較，計(jì)算P值；
4)根據(jù)信息生物學(xué)技術(shù)，運(yùn)用SIFT (http: "sift, icv1.0rg/)和 PolyPhen2(http: //genetics, bwh.harvard.edu/pph2/index, shtml)軟件計(jì)算位點(diǎn)的保守氨基酸改變程度、發(fā)現(xiàn)可能致病性，以進(jìn)一步篩選哪些位點(diǎn)與疾病有關(guān)，哪些是多態(tài)或與疾病無(wú)關(guān)；
5)將上述方法篩選出來(lái)的與擴(kuò)張型心肌病有關(guān)的突變位點(diǎn)和突變基因進(jìn)行整理，根據(jù)Poisson分布的原理建立數(shù)學(xué)模型，類似于計(jì)算哪些路口更容易發(fā)生交通事故，這個(gè)模型用于發(fā)現(xiàn)哪些是最易導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病的致病基因。
[0019]共發(fā)現(xiàn)87個(gè)非同義位點(diǎn)，根據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)及計(jì)算保守氨基酸改變程度，將這些位點(diǎn)分成三組(表1)，再根據(jù)Poisson分布建立數(shù)學(xué)模型(表2),根據(jù)gama值小于0.05得出四個(gè)最危險(xiǎn)基因'MYBPC3 (編碼肌球蛋白結(jié)合蛋白0、SCN5A (編碼心臟鈉通道)、iffiTZ(編碼β肌球蛋白重鏈)和(編碼肌原纖維蛋白)。[0020]本發(fā)明通過(guò)針對(duì)中國(guó)漢族人群中散發(fā)性擴(kuò)張型心肌病患者進(jìn)行候選基因全外顯子測(cè)序研究，并進(jìn)一步對(duì)新發(fā)現(xiàn)的基因位點(diǎn)進(jìn)行數(shù)模分析，成功篩選出4個(gè)導(dǎo)致散發(fā)性擴(kuò)張型心肌病患者的易感基因，針對(duì)這4個(gè)基因進(jìn)行篩查，則顯著提高患者的檢出率，并能大大節(jié)省檢測(cè)費(fèi)用。
[0021]本發(fā)明所涉及的測(cè)序方法、數(shù)據(jù)庫(kù)的選用及計(jì)算保守氨基酸改變程度的方法是已經(jīng)證實(shí)的、且被廣泛應(yīng)用的可靠方法；在此基礎(chǔ)上，對(duì)于得到的近乎海量的數(shù)據(jù)，根據(jù)Poisson分布原理建立數(shù)學(xué)模型，將所發(fā)現(xiàn)的可能致病位點(diǎn)匯總整理，得出導(dǎo)致疾病的“最危險(xiǎn)基因”，該方法曾用于計(jì)算哪些路段是交通事故高發(fā)路段，尚未見(jiàn)用于疾病易感基因分析。
[0022]與目前昂貴且低效的擴(kuò)張型心肌病基因篩查方法相比，這4個(gè)高危致病基因的發(fā)現(xiàn)將使篩查更有針對(duì)性，從而減少檢測(cè)費(fèi)用，且提高檢出效率。
[0023]實(shí)施例2篩查試劑盒
根據(jù)實(shí)施例1得出的四個(gè)“最危險(xiǎn)基因”，本發(fā)明提供一種篩查擴(kuò)張型心肌病的試劑盒，試劑盒內(nèi)包括用 hMYBPC3、SCN5A、MYH7和#7/W基因進(jìn)行全外顯子測(cè)序的試劑，僅辦hMYBPC3、SCN5A、iffiTZ和#7/W這四個(gè)基因進(jìn)行篩查，顯著提高患者的檢出率，并能大大節(jié)省檢測(cè)費(fèi)用，提高早期檢出率，從而做到早期治療，提高患者生存率。
[0024]檢測(cè)方法:受試者抽取靜脈血3ml至EDTK2抗凝管中，由檢測(cè)方抽提DNA，采用本發(fā)明的篩查擴(kuò)張型心肌病的試劑盒，對(duì)4個(gè)擴(kuò)張型心肌病最易感的致病基因5OS4、iffiT7、#7/W進(jìn)行全外顯子測(cè)序，從而發(fā)現(xiàn)受試者有無(wú)攜帶突變位點(diǎn)，即擴(kuò)張型心肌病的致病位點(diǎn)，進(jìn)一步采取預(yù)防措施和治療方案。
[0025]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]表1擴(kuò)心病(DCM)病例發(fā)現(xiàn)的87個(gè)非同義位點(diǎn)一覽表
【權(quán)利要求】
1.一種篩查擴(kuò)張型心肌病的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒的檢測(cè)基因?yàn)槿薓YBPC3、SCN5A、MYH7 和 MYPN 四個(gè)基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒內(nèi)包含用于對(duì)人SCN5A、MYH7和#7/W基因進(jìn)行全外顯子測(cè)序的試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒的檢測(cè)樣本為靜脈血。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒對(duì)人SCN5A、MYH7和#7/W四個(gè)基因進(jìn)行全外顯子測(cè)序，從而發(fā)現(xiàn)受試者有無(wú)攜帶突變位點(diǎn)，即擴(kuò)張型心肌病的致病位點(diǎn)。
5.MYBPC3、SCN5A、MYH7琳MYPN四個(gè)基因在制備篩查擴(kuò)張型心肌病的試劑盒中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑盒內(nèi)包含用于對(duì)人SCN5A、MYH7和#7/W基因進(jìn)行全外顯子測(cè)序的試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑盒的檢測(cè)樣本為靜脈血。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，對(duì)人SCN5A,MYH7和MYPN四個(gè)基因進(jìn)行全外顯子測(cè)序，`從而發(fā)現(xiàn)受試者有無(wú)攜帶突變位點(diǎn)，即擴(kuò)張型心肌病的致病位點(diǎn)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103509867SQ201310439984
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】葛均波, 孫愛(ài)軍, 范錚, 徐磊, 申程 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院