一種高效吸附水溶液中鈾的基因重組釀酒酵母及構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效吸附水溶液中鈾的基因重組釀酒酵母及構(gòu)建方法。該基因重組釀酒酵母是通過對人肝金屬硫蛋白基因進(jìn)行密碼子改造，與釀酒酵母表達(dá)載體重組并轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞，獲得正確的表達(dá)而構(gòu)建成的。該基因重組釀酒酵母有效的提高了酵母細(xì)胞對鈾（VI）的吸附容量，且具有吸附成本低、生物量可重復(fù)使用，不會造成二次污染的特點(diǎn)，對減輕鈾污染程度和回收鈾資源方面具有積極的推動作用。
【專利說明】一種高效吸附水溶液中鈾的基因重組釀酒酵母及構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效吸附水溶液中鈾(VI)的基因重組釀酒酵母，屬于環(huán)境生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]生物吸附是指對于經(jīng)過一系列生物化學(xué)作用使重金屬離子被生物細(xì)胞吸附的過程。研究表明，多種微生物被用于重金屬離子的生物吸附，包括藻類、細(xì)菌、真菌及酵母等。其中，釀酒酵母(SaccAaro焊Ce1S cerevisiae、已被證明對 Cu2+、Cr3+、Pb2+、Hg2+、Cd2+、As3+ 等多種金屬離子具有較強(qiáng)的吸附能力，同時(shí)具有安全、易于培養(yǎng)和生長的優(yōu)良特性。微生物吸附成本低、效率高、生物量可重復(fù)使用，且不會造成二次污染，在處理含鈾廢水和回收鈾資源方面有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]對于鈾(VI)的生物吸附研究，盡管目前已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，然而經(jīng)過多年的研究，鈾(VI)的生物吸附容量已經(jīng)接近飽和，導(dǎo)致生物吸附研究始終停留在經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室階段，對于實(shí)現(xiàn)實(shí)用化和工業(yè)化應(yīng)用，目前面臨的主要問題是如何進(jìn)一步提高微生物對鈾的生物吸附容量，降低生產(chǎn)成本。
[0004]目前對于微生物吸附包括鈾(VI)在內(nèi)的重金屬的研究機(jī)制認(rèn)為，細(xì)胞壁是重金屬離子的主要積累場所，金屬離子可與細(xì)胞壁上的活性基團(tuán)發(fā)生定量結(jié)合反應(yīng)。鑒于此，考慮在微生物細(xì)胞表面表達(dá)金屬絡(luò)合物，增強(qiáng)金屬離子在細(xì)胞壁上的結(jié)合，已成為提高細(xì)胞吸附容量的一條有效途徑。金屬硫蛋白(MTs)就是這類物質(zhì)最典型的代表，MTs已被證明可以有效的結(jié)合Hg2+、Cd2+、Ag+、Zn2+、Cu2+等多種金屬陽離子，不同物種及不同亞型的MTs對重金屬的吸附能力各不相同，其中人類的金屬硫蛋白絡(luò)合能力最強(qiáng)。
[0005]細(xì)胞表面展示技術(shù)的原理是將外源肽以融合蛋白的形式固定在細(xì)胞的外膜，被表達(dá)的多肽可以保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，使表達(dá)、純化、固定于一體，在醫(yī)藥、食品、生物燃料、環(huán)境保護(hù)等多個(gè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。近兩年來，很多學(xué)者已經(jīng)將生物吸附的研究重心轉(zhuǎn)移到將金屬結(jié)合蛋白表達(dá)到微生物細(xì)胞外膜表面，解決重金屬生物吸附的容量問題，這一領(lǐng)域已經(jīng)逐漸成為目前生物吸附的研究熱點(diǎn)。
[0006]截止目前，對于在釀酒酵母細(xì)胞外膜表達(dá)MTs是否可以提高對鈾(VI)的生物吸附容量，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種表面展示金屬硫蛋白的重組釀酒酵母，通過在細(xì)胞表面表達(dá)金屬硫蛋白，增強(qiáng)鈾(VI)在細(xì)胞壁上的絡(luò)合，達(dá)到提高細(xì)胞吸附容量的目的。
[0008]所述金屬硫蛋白基因克隆于載體PYDI,并轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae ) EBY100 中。
[0009]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的具體方案為:1)改造人肝金屬硫蛋白基因編碼序列，合成該基因；
2)將金屬硫蛋白基因與釀酒酵母表面展示載體連接，得到重組表達(dá)載體；
3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母cerevisiae)EBYlOO中，得到基因重組釀酒酵母。
[0010]下面是本發(fā)明技術(shù)方案的具體描述:
質(zhì)粒及基因重組釀酒酵母的構(gòu)建:
根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫中公布的人肝金屬硫蛋白基因編碼序列，經(jīng)密碼子改造后，進(jìn)行全基因合成；將人工合成的金屬硫蛋白基因克隆到質(zhì)粒pYDl (購自Invitrogen生物技術(shù)有限公司，貨號:V835-01)構(gòu)建表面展不表達(dá)載體；將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母 EBYlOO (MATa ura3_52 trpl leu2Al his3A200 pep4::HIS3 prblAl.6Rcanl GAL (pIU211: URA3))。PCR (Pl:5’ -ATGGACCCAAACTGCTCCTGCGCTA-3’ ；P2:5’ -AGCACAGCAAGAGCACTTTTCTGAT-3’ )驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子。
[0011]重組酵母EBY100-MT細(xì)胞的培養(yǎng):
種子培養(yǎng)基:0.67 (w/v)YNB (含硫酸銨，不含氨基酸)，0.5% (w/v)水解酪蛋白氨基酸，2% (w/v)葡萄糖。固體培養(yǎng)基添加2% (w/v)的瓊脂粉。
[0012]發(fā)酵培養(yǎng)基:0.67 (w/v)YNB (含硫酸銨，不含氨基酸)，0.5% (w/v)水解酪蛋白氨基酸，2% (界八)半乳糖，1151:滅菌201^11。
[0013]從斜面中接種重組釀酒酵母單菌落于IOml的種子培養(yǎng)基中，30°C，180rpm過夜培養(yǎng)至0D600在2-5之間，離心收集細(xì)胞并用無菌水洗滌，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，至0D600為
0.5-1，于20°C，180rpm震蕩培養(yǎng)36-48h。細(xì)胞經(jīng)離心、洗滌、凍干，用于水溶液中鈾(VI)的吸附。
[0014]吸附實(shí)驗(yàn):
稱取0.01 g基因重組釀酒酵母EBY100-MT細(xì)胞，加入50mL—定濃度的鈾(VI)溶液中，密封振蕩，離心取上清液，用偶氮胂III法測定其鈾(VI)濃度，如下公式計(jì)算吸附量:
【權(quán)利要求】
1.一種高效吸附水溶液中鈾的基因重組釀酒酵母，其特征在于含有外源金屬硫蛋白基因。
2.權(quán)利要求1所述的高效吸附水溶液中鈾的基因重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: 51.按照釀酒酵母的密碼子使用規(guī)律，改造人肝金屬硫蛋白基因編碼序列，合成該基因； 52.將金屬硫蛋白基因與釀酒酵母表面展示載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體； 53.將上述構(gòu)建得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(cerevisiae)EBYlOO中，構(gòu)建基因重組釀酒酵母。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效吸附水溶液中鈾的基因重組釀酒酵母應(yīng)用于水溶液中鈾(VI)的吸附。`
【文檔編號】C12R1/865GK103525713SQ201310423531
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】李敏, 梁波, 張志斌, 徐瓊, 于梁梁 申請人:東華理工大學(xué)