一種抑食金球藻的快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，一種抑食金球藻Aureococcus?anophagefferens的快速檢測(cè)方法。利用抑食金球藻的特異性的引物和探針通過熒光定量PCR擴(kuò)增及其熒光信號(hào)對(duì)海水中的抑食金球藻進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明檢測(cè)方法包括藻基因組DNA提取、熒光定量PCR檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、藻密度檢測(cè)范圍寬。
【專利說明】一種抑食金球藻的快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，一種抑食金球藻Aureococcus anophagefferens的快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抑食金球藻Aureococcus anophagefferens是一種可以引發(fā)褐潮的微微型藻類，抑食金球藻褐潮暴發(fā)時(shí)海水變成黃褐色，并嚴(yán)重影響貝類的攝食活動(dòng)，是一種對(duì)貝類養(yǎng)殖業(yè)具有破壞性影響的微微型藻。以往抑食金球藻主要在美國和南非等地發(fā)現(xiàn)，近年來我國北方海域時(shí)已有發(fā)現(xiàn)。
[0003]抑食金球藻直徑約2-3 μ m，形態(tài)上不易與其他微微型藻區(qū)分，因而常規(guī)顯微觀察的方法不適用于抑食金球藻的定量觀測(cè)。Popels等根據(jù)該藻18S的基因片段建立一套Taqman探針熒光定量檢測(cè)的方 法，該方法雖然靈敏簡(jiǎn)便，適用于大量樣品的檢測(cè)，但也具有若干不適用野外觀測(cè)的特性。比如在不同野外環(huán)境生長(zhǎng)的抑食金球藻，其18S的拷貝數(shù)不同，可能存在18S拷貝數(shù)與真實(shí)藻密度不對(duì)應(yīng)的問題；同時(shí)該方法的可信檢測(cè)上線為104cellS/mL，然而褐潮暴發(fā)是藻密度經(jīng)常到達(dá)106cells/mL，因此該方法不利于高密度樣品的直接檢測(cè)。因此需要建立一種更加特異、穩(wěn)定且適用于高密度褐潮藻華監(jiān)控的技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種檢測(cè)速度快、特異性高、靈敏穩(wěn)定的快速檢測(cè)抑食金球藻的快速檢測(cè)方法。
[0005]一種抑食金球藻的快速檢測(cè)方法，利用抑食金球藻的特異性的引物和探針通過熒光定量PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)對(duì)海水中的抑食金球藻進(jìn)行檢測(cè)；
[0006]其中，特異性的引物和探針分別為:
[0007]上游引物7365F5 ‘-GCGGAGGTCGTGGAGAGG-3’，
[0008]下游引物7366R5 ‘-GGGTGCGTCCGTAGACTTGA-3’，
[0009]探針:5‘-CTCGGCTTCACGGGCGGCTTCC-3’。
[0010]進(jìn)一步的說，以海水樣品中藻基因組總DNA為模版，利用抑食金球藻的特異性的引物和探針通過熒光定量PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)對(duì)海水中的抑食金球藻進(jìn)行檢測(cè)。
[0011]所述熒光定量PCR體系為:反應(yīng)總體積為10 μ L，包括基因組DNA1-4 μ L，
2X Premix Ex Taq Buffer Mix (Takara, Takara 商業(yè)化產(chǎn)品)5 μ L,探針 0.4μ?(濃度ΙΟμΜ),引物各0.2yL (濃度10 μ Μ),最后加滅菌去離子水至10 μ L。
[0012]所述熒光定量PCR條件為95°C預(yù)變性30s ;95°C變性5s，60°C退火/延伸30s，收集Texas Red突光,40個(gè)循環(huán)。
[0013]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明檢測(cè)方法采用脲基甲酸酯水解酶(allophanatehydrolase)為目標(biāo)基因，其是抑食金球藻基因組中具有較高特異性的單拷貝基因。以該基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman探針，采用熒光定量PCR的技術(shù)手段進(jìn)行檢測(cè)具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏、檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的擴(kuò)增結(jié)果圖示圖。
[0015]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的目標(biāo)基因的比對(duì)情況圖。
[0016]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
[0018]首先在采樣點(diǎn)采取IL海水樣品，迅速通過80 μ m的紗絹過濾，樣品避光保存待用。每個(gè)采樣點(diǎn)的海水取出三份，每份準(zhǔn)確定量200ml (褐潮暴發(fā)期IOOml )，分別通過5 μ m，和
0.45 μ m的濾膜 ，抽濾壓力不能大于0.02MPa。0.45 μ m的濾膜_20°C冷凍保存，直至下步操作。按照Takara基因組提取試劑盒的造作說明提取總DNA。
[0019]然后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為:基因組DNA模版1-4 μ L，2 X Premix ExTaq Buffer Mix5 μ L,探針 0.4 μ L (濃度 10 μ Μ)，引物各 0.2 μ L (濃度 10 μ Μ)，最后加滅菌去離子水至IOyL ;熒光定量PCR儀器的程序參數(shù)為:95°C預(yù)變性30s ;95°C變性5s，60°C退火/延伸30s,收集Texas Red突光,40個(gè)循環(huán)。
[0020]其中特異性的引物和探針為:
[0021]上游引物7365F5 ‘-GCGGAGGTCGTGGAGAGG-3’，
[0022]下游引物7366R5 ‘-GGGTGCGTCCGTAGACTTGA-3’，
[0023]探針:5‘-CTCGGCTTCACGGGCGGCTTCC-3’。
[0024]通過上述PCR擴(kuò)增結(jié)果以及熒光信號(hào)對(duì)樣品海水中的抑食金球藻進(jìn)行檢測(cè)；其中上述熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果呈典型的PCR擴(kuò)增曲線(參見圖1 )。
[0025]采用本發(fā)明的方法無需后處理，不用電泳、拍照，檢測(cè)過程可在I小時(shí)左右結(jié)束，大大縮短反應(yīng)時(shí)間。同時(shí)本發(fā)明方法檢測(cè)的目標(biāo)基因?yàn)閱慰截惞δ芑?，?jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)，基因同源性相對(duì)較低(參見圖2)，不存在非特異性擴(kuò)增的可能，保證PCR反應(yīng)的準(zhǔn)
確可靠。
[0026]將上述樣品經(jīng)熒光定量PCR反應(yīng)后得出的Ct值，可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線(參見圖3)換算藻樣品的實(shí)際含量，進(jìn)而可確定本發(fā)明的方法檢測(cè)范圍為5-106cellS/mL，檢測(cè)靈敏，檢測(cè)范圍寬，可完全滿足野外調(diào)查的需要。
【權(quán)利要求】
1.一種抑食金球藻的快速檢測(cè)方法，其特征在于:利用抑食金球藻的特異性的引物和探針通過熒光定量PCR擴(kuò)增及其熒光信號(hào)對(duì)海水中的抑食金球藻進(jìn)行檢測(cè)； 其中，特異性的引物和探針分別為:
上游弓 I 物 7365F5 ‘ -GCGGAGGTCGTGGAGAGG-3 ’， 下游引物 7366R5 ‘-GGGTGCGTCCGTAGACTTGA-3’， 探針:5 ‘-CTCGGCTTCACGGGCGGCTTCC-3’。
2.按權(quán)利要求1所述的抑食金球藻的快速檢測(cè)方法，其特征在于:以海水樣品中藻基因組總DNA為模版，利用抑食金球藻的特異性的引物和探針通過熒光定量PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)對(duì)海水中的抑食金球藻進(jìn)行檢測(cè)。
3.按權(quán)利要求1或2所述的抑食金球藻的快速檢測(cè)方法，其特征在于:所述熒光定量PCR體系為:反應(yīng)總體積為10μ L，包括基因組DNAl-4y L，2XPremix Ex Taq Buffer Mix(Takara，Takara商業(yè)化產(chǎn)品，無中文)5μ L，探針0.4yL(濃度10 μ Μ)，引物各0.2 μ L (濃度10 μ Μ),最后加滅菌去離子水至10 μ L0
4.按權(quán)利要求1或2所述的抑食金球藻的快速檢測(cè)方法，其特征在于:所述熒光定量PCR條件為95°C預(yù)變性30s ;95°C變性5s，60°C退火/延伸30s，收集Texas Red熒光，40個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12R1/89GK103468803SQ201310409553
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】宋林生, 邱麗梅, 劉瑞, 張清春, 張峘 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所