培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了培養(yǎng)基及其應(yīng)用，其中用于制備上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基包含：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基適于上皮細(xì)胞生成；DFBS；維生素C磷酸鎂酯；以及地塞米松。利用本發(fā)明的培養(yǎng)基，在無(wú)需加入BMP-4等細(xì)胞因子及不采用其他種類細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基的條件下，即能夠?qū)⑷伺咛ジ杉?xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，且應(yīng)用該培養(yǎng)基的誘導(dǎo)方法快速高效、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、分化效果穩(wěn)定。
【專利說(shuō)明】培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及培養(yǎng)基及其應(yīng)用，更具體地，涉及培養(yǎng)基、試劑盒及其在制備上皮細(xì)胞中的用途以及制備上皮細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】 [0002]通過(guò)將干細(xì)胞分化為特定的細(xì)胞、組織類型，結(jié)合組織工程方法進(jìn)行組織器官構(gòu)建，從而應(yīng)用于臨床治療是再生醫(yī)學(xué)研究的主要內(nèi)容。在上皮組織和皮膚附屬器官構(gòu)建中，上皮細(xì)胞是組織器官構(gòu)建的核心因素，然而，目前報(bào)道的干細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)向上皮細(xì)胞分化的方法存在著誘導(dǎo)成本高、分化純度有限、分化時(shí)間長(zhǎng)、分化效果不穩(wěn)定等不足。
[0003]由此，將誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞的方法仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、高效地誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞的方法。
[0005]因而，根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該培養(yǎng)基包含:基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基適于上皮細(xì)胞生成；DFBS ；維生素C磷酸鎂酯；以及地塞米松。由此，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基，在無(wú)需加入BMP-4等細(xì)胞因子及不采用其他種類細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基的條件下，即能夠?qū)⑷伺咛ジ杉?xì)胞(ES細(xì)胞)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，且應(yīng)用該培養(yǎng)基的誘導(dǎo)方法快速高效、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、分化效果穩(wěn)定。
[0006]其中，需要說(shuō)明的是，本文中所用的術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞”是利用病毒感染、月旨質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、粒子轟擊等方法之一將維持干細(xì)胞多能性所需的多能性因子導(dǎo)入體細(xì)胞，從而誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程而獲得的多能干細(xì)胞。其在ES細(xì)胞培養(yǎng)條件下，與ES細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性、表面標(biāo)志物表達(dá)、移植到皮下可形成包含3個(gè)胚層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的畸胎瘤等方面與人ES細(xì)胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表達(dá)譜、染色質(zhì)狀態(tài)等方面也與人ES細(xì)胞非常相似。上述的表達(dá)方式“誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程”是指將體細(xì)胞去分化為多能性干細(xì)胞的過(guò)程。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于制備上皮細(xì)胞的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒中含有DFBS、維生素C磷酸鎂酯和地塞米松。由此，利用本發(fā)明的試劑盒能夠高效地將人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，并且分化時(shí)間短、分化效果穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便、成本較低。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種用于制備上皮細(xì)胞的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包含權(quán)前面所述的培養(yǎng)基。由此，利用本發(fā)明的試劑盒能夠有效地將人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，且應(yīng)用該試劑盒的誘導(dǎo)方法快速高效、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、分化效果穩(wěn)定。[0009]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了前面所述的試劑盒在制備上皮細(xì)胞中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用本發(fā)明的試劑盒制備上皮細(xì)胞，快速高效、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、分化時(shí)間短、分化效果穩(wěn)定，能夠獲得典型的上皮細(xì)胞。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了前面所述的培養(yǎng)基在制備上皮細(xì)胞中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠有效地將人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，且應(yīng)用該培養(yǎng)基的誘導(dǎo)方法快速高效、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、分化效果穩(wěn)定。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種制備上皮細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:利用前面所述的培養(yǎng)基，培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，以便誘導(dǎo)所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞。由此，利用本發(fā)明的制備上皮細(xì)胞的方法，能夠在不加入BMP-4等細(xì)胞因子及不采用其他種類細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基的條件下，高效地將人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，且該方法誘導(dǎo)過(guò)程快速，操作簡(jiǎn)便，分化效果穩(wěn)定，成本較低。
[0012]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0014]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，制備上皮細(xì)胞時(shí)，干細(xì)胞向上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)uc-1PS細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖；
[0015]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，制備上皮細(xì)胞時(shí)，干細(xì)胞向上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的多能性基因及上皮細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)變化的qPCR檢測(cè)結(jié)果圖；
[0016]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，制備上皮細(xì)胞時(shí)，干細(xì)胞向上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化第14天的多能性基因及上皮細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的免疫熒光結(jié)果圖；以及
[0017]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，制備上皮細(xì)胞時(shí)，干細(xì)胞向上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化第14天的多能性基因及上皮細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該培養(yǎng)基包含:基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基適于上皮細(xì)胞生成；DFBS ;維生素C磷酸鎂酯；以及地塞米松。由此，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基，在無(wú)需加入BMP-4等細(xì)胞因子及不采用其他種類細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基的條件下，即能夠?qū)⑷伺咛ジ杉?xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，且應(yīng)用該培養(yǎng)基的誘導(dǎo)方法快速高效、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、分化效果穩(wěn)定。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的種類不受特別限制，只要利于人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員，可以根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為α-ΜΕΜ培養(yǎng)基。由此，既可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又可以有效降低成本，同時(shí)利于人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞。[0021]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述培養(yǎng)基中DFBS、維生素C磷酸鎂酯和地塞米松的濃度不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述培養(yǎng)基中含有:10重量％的DFBS ;濃度為30 μ Μ-100 μ M的維生素C磷酸鎂酯；以及濃度為0.1 μ Μ-0.5 μ M的地塞米松。優(yōu)選情況下，所述培養(yǎng)基含有:10重量％的DFBS ;濃度為50 μ M的維生素C磷酸鎂酯；以及濃度為0.5 μ M的地塞米松。即該培養(yǎng)基為添加了 10重量％的DFBS，濃度為50 μ M的維生素C磷酸鎂酯，以及濃度為0.5 μ M的地塞米松的a -MEM培養(yǎng)基。由此，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基可以有效地將人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，并且分化時(shí)間短，分化效果穩(wěn)定，同時(shí)操作簡(jiǎn)單，成本較低。
[0022]其中，需要說(shuō)明的是，本文中所有的數(shù)字標(biāo)識(shí)，例如pH、溫度、時(shí)間、濃度和分子量，包括范圍，都是近似值，以0.1的增量變動(dòng)(+ )或(-)。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于制備上皮細(xì)胞的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒中含有DFBS、維生素C磷酸鎂酯和地塞米松。由此，利用本發(fā)明的試劑盒能夠高效地將人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，并且分化時(shí)間短、分化效果穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便、成本較低。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述DFBS、維生素C磷酸鎂酯和地塞米松分別設(shè)置在不同的容器中。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的用于制備上皮細(xì)胞的試劑盒進(jìn)一步包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為a-MEM培養(yǎng)基。由此，既可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又可以有效降低成本。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述DFBS、維生素C磷酸鎂酯和地塞米松溶解于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中DFBS、維生素C磷酸鎂酯和地塞米松的濃度不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有:10重量°/c^^DFBS ；濃度為30 μ Μ-100 μ M的維生素C磷酸鎂酯；以及濃度為0.1 μ Μ-0.5 μ M的地塞米松。優(yōu)選情況下，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有:10重量％的DFBS ;濃度為50 μ M的維生素C磷酸鎂酯；以及濃度為0.5 μ M的地塞米松。由此，利用本發(fā)明的試劑盒可以有效地將人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，并且分化時(shí)間短，分化效果穩(wěn)定，同時(shí)操作簡(jiǎn)單，成本較低。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種用于制備上皮細(xì)胞的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包含前面所述的培養(yǎng)基。由此，利用本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)⑷伺咛ジ杉?xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，且應(yīng)用該培養(yǎng)基的誘導(dǎo)方法快速高效、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、分化效果穩(wěn)定。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了前面所述的試劑盒在制備上皮細(xì)胞中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用本發(fā)明的試劑盒制備上皮細(xì)胞，快速高效、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、分化時(shí)間短、分化效果穩(wěn)定，能夠獲得典型的上皮細(xì)胞。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了前面所述的培養(yǎng)基在制備上皮細(xì)胞中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠有效地將人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，且應(yīng)用該培養(yǎng)基的誘導(dǎo)方法快速高效、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、分化效果穩(wěn)定。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種制備上皮細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:利用前面所述的培養(yǎng)基，培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，以便誘導(dǎo)所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞。由此，利用本發(fā)明的制備上皮細(xì)胞的方法，能夠在不加入BMP-4等細(xì)胞因子及不采用其他種類細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基的條件下，高效地將人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞，且該方法誘導(dǎo)過(guò)程快速，操作簡(jiǎn)便，分化效果穩(wěn)定，成本較低。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生自皮膚成纖維細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞和尿液細(xì)胞的至少一種。由此，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠有效地分化為上皮細(xì)胞，提高誘導(dǎo)分化的效率。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，為了實(shí)現(xiàn)更好的分化效果，在將所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行分化培養(yǎng)，需要利用含有10 y M Y-27632的mTeSRl?培養(yǎng)基、E8培養(yǎng)基或KSR條件培養(yǎng)基，于37°C條件下將所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞孵育I小時(shí)，然后利用Accutase進(jìn)行消化3_5min，以便使所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞消化為單細(xì)胞。由此，利于后續(xù)的分化培養(yǎng)，以便達(dá)到更好的分化效果。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在培養(yǎng)所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞之前，進(jìn)一步包括對(duì)所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。由此，有利于后續(xù)所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)，提高制備上皮細(xì)胞的效率。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基的種類不受特別限制，只要有利于對(duì)人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行活化，并使其保持干性即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際條件靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，通過(guò)Metrigel包被的培養(yǎng)板，利用選自mTeSRl?、E8培養(yǎng)基和KSR條件培養(yǎng)基的至少一種進(jìn)行所述預(yù)培養(yǎng)。由此，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞干性好，便于進(jìn)行后續(xù)的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，有利于提高制備上皮細(xì)胞的效率。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行分化培養(yǎng)的培養(yǎng)板及接種密度不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，通過(guò)I型膠原包被的6孔培養(yǎng)板，保持1.5-2.0X IO5細(xì)胞/孔的接種密度，進(jìn)行所述分化培養(yǎng)。由此，使得所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在最合適的環(huán)境下進(jìn)行分化培養(yǎng)，利于所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)行所述培養(yǎng)的時(shí)間不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，進(jìn)行所述培養(yǎng)10-20天。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，進(jìn)行所述培養(yǎng)14天。由此，分化得到的細(xì)胞形態(tài)較為均一，排列緊密，呈現(xiàn)典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，且無(wú)非上皮樣形態(tài)的雜細(xì)胞出現(xiàn)。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)行所述培養(yǎng)時(shí)，隔日全量換液。由此，能夠?yàn)榧?xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，保證細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)良好。需要說(shuō)明的是，上述使用的表達(dá)方式“隔日全量換液”是指每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括:在進(jìn)行所述培養(yǎng)的第一天，向所述培養(yǎng)基中添加10 ii M的Y-27632。由此，能夠有效降低處于單細(xì)胞狀態(tài)的人iPS細(xì)胞的凋亡水平。[0039]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括:通過(guò)選自免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)的至少一種方法對(duì)所述上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述鑒定是通過(guò)檢測(cè)上皮細(xì)胞特異標(biāo)記K14、K15、K18、K19、CD29和P63，以及干細(xì)胞多能性特異標(biāo)記0ct4和Nanog的至少一種實(shí)現(xiàn)的。由此，通過(guò)檢測(cè)制備獲得的細(xì)胞的干細(xì)胞多能性特異標(biāo)記和上皮細(xì)胞特異標(biāo)記的表達(dá)情況，能夠有效地確定其是否為目的細(xì)胞一上皮細(xì)胞。
[0040]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0041]實(shí)施例1.人ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)
[0042]材料與試劑:H1人胚胎干細(xì)胞(H1-ES細(xì)胞)，尿液細(xì)胞來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(UC-1PS 細(xì)胞)，mTeSR?l 培養(yǎng)基(STEMCELL catalog#05850)。
[0043]方法步驟:將Hl-ES 細(xì)胞和 UC-1PS 細(xì)胞接種于用 Metrigel(BD catalog#354277)包被的培養(yǎng)板中，加入mTeSR?l培養(yǎng)基，于37°C，5%C02條件下進(jìn)行培養(yǎng)，約4_6天采用2mg/ml 的 Dispase 酶(Gibco catalog #17105_041)消化傳代一次。
[0044]實(shí)施例2.人ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞的分化培養(yǎng)
[0045]材料與試劑:H1_ES細(xì)胞；UC_iPS細(xì)胞；添加有10重量％的DFBS (Hyclonecatalog#SH30070.03)，50 μ M 維生素 C 磷酸鎂酯(Sigma catalog#A8960)和 0.5 μ M 地塞米松(Sigmacatalog#D4902)的 a -MEM 培養(yǎng)基(Gibco catalog#32561_037);Accutase(Sigmacatalog#A6964);牛 I 型膠原(BD catalog#354231 )。
[0046]方法步驟:將實(shí)施例1中預(yù)培養(yǎng)獲得的Hl-ES細(xì)胞或UC-1PS細(xì)胞用含有ΙΟμΜΥ-27632的干細(xì)胞培養(yǎng)基，于37°C條件下孵育I小時(shí)，隨后，將Hl-ES細(xì)胞或UC-1PS細(xì)胞用Accutase消化3_5min，吹打?yàn)閱渭?xì)胞，然后接種在I型膠原包被的6孔板中，接種密度為
1.5-2.0 X IO5細(xì)胞/孔，用分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其中，在培養(yǎng)的第一天，進(jìn)一步向培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μ M的Υ_27632(此后換液不需加Υ-27632)，此后隔日全量換液，培養(yǎng)14天可見典型上皮樣細(xì)胞形成。培養(yǎng)過(guò)程中，于不同時(shí)間點(diǎn)，利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)、通過(guò)免疫熒光及流式細(xì)胞儀檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)情況。
[0047]其中，以UC-1PS細(xì)胞為例，當(dāng)對(duì)UC-1PS細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，各種檢測(cè)結(jié)果如下:
[0048]UC-1PS細(xì)胞分化培養(yǎng)0、7、14、21、28天的形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖1所示。由圖1可以看出，分化培養(yǎng)前，UC-1PS細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)；誘導(dǎo)分化第7天，細(xì)胞發(fā)生明顯形變，呈扁平狀生長(zhǎng)，初步呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞形態(tài)；誘導(dǎo)分化第14天，細(xì)胞形態(tài)較為均一，排列緊密，呈現(xiàn)典型上皮樣細(xì)胞形態(tài)；在誘導(dǎo)分化的第21天，有少部分非上皮樣形態(tài)的雜細(xì)胞出現(xiàn)；誘導(dǎo)分化28天后，雜細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步增殖，細(xì)胞形態(tài)明顯不均一。由此表明，誘導(dǎo)分化14天是較好的時(shí)間點(diǎn)，而且，這時(shí)的上皮細(xì)胞可以通過(guò)2mg/ml的Dispase酶進(jìn)行消化，以一層膜狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)進(jìn)行收集。
[0049]UC-1PS細(xì)胞分化培養(yǎng)0、7、14、21、28天，干細(xì)胞多能性基因以及上皮細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，在分化培養(yǎng)的前14天，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，干細(xì)胞多能性基因表達(dá)逐漸下調(diào)，上皮細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)程度逐漸升高，大多數(shù)上皮細(xì)胞標(biāo)記基因在分化后第14天達(dá)到最高的表達(dá)水平；14天以后，隨著誘導(dǎo)分化的持續(xù)，可能由于非上皮形態(tài)的雜細(xì)胞增殖，部分上皮細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)逐漸下降。
[0050]其中，分化培養(yǎng)第14天的UC-1PS細(xì)胞的免疫熒光及流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果分別如圖3和圖4所示。從圖3的免疫熒光結(jié)果可見:iPS細(xì)胞分化后第14天形成的上皮細(xì)胞在多能性基因(Nanog)表達(dá)上呈陰性，iPS細(xì)胞用做陽(yáng)性對(duì)照，可見Nanog呈陽(yáng)性(圖3中C1-C3);同時(shí)，細(xì)胞明顯表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記基因？63、1(14、1(15、1(18和1(19。其中，圖中左側(cè)一欄為綠色熒光下觀測(cè)到的熒光染色結(jié)果，中間一欄為對(duì)應(yīng)視野的細(xì)胞核DAPI染色結(jié)果，右側(cè)一欄為前二者的合成圖，圖中標(biāo)尺為100 iim。從圖4流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果可見，iPS細(xì)胞分化后第14天形成的上皮細(xì)胞基本不表達(dá)多能性基因Nanog，同時(shí)，在不同程度上表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白，其中，K14和K18的表達(dá)較高，p63、K15和K19的表達(dá)較低，其中，每個(gè)流式圖左側(cè)峰為同行對(duì)照組，右側(cè)峰為實(shí)驗(yàn)組。上述結(jié)果均表明iPS細(xì)胞成功分化為上皮細(xì)胞。 [0051]在本說(shuō)明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0052]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【權(quán)利要求】
1.一種用于制備上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包含: 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基適于上皮細(xì)胞生成；
DFBS ； 維生素C磷酸鎂酯；以及 地塞米松。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為a-MEM培養(yǎng)基， 任選地，按照重量百分比，所述培養(yǎng)基含有: 10重量％的DFBS ； 濃度為30 u M-100 u M的維生素C磷酸鎂酯；以及 濃度為0.1 u M-0.5uM的地塞米松， 任選地，按照重量百分比，所述培養(yǎng)基含有: 10重量％的DFBS ； 濃度為50 y M的維生素C磷酸鎂酯；以及 濃度為0.5 ii M的地塞米松。
3.一種用于制備上皮細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有DFBS、維生素C酸鎂酯和地塞米松。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述DFBS、維生素C磷酸鎂酯和地米松分別設(shè)置在不同的容器中， 任選地，進(jìn)一步包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為a -MEM培養(yǎng)基， 任選地，所述DFBS、維生素C磷酸鎂酯和地塞米松溶解于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中， 任選地，按照重量百分比，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有: 10重量％的DFBS ； 濃度為30 u M-100 u M的維生素C磷酸鎂酯；以及 濃度為0.1 u M-0.5uM的地塞米松， 任選地，按照重量百分比，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有: 10重量％的DFBS ； 濃度為50 y M的維生素C磷酸鎂酯；以及 濃度為0.5 ii M的地塞米松。
5.一種用于制備上皮細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備上皮細(xì)胞中的用途。
7.權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基在制備上皮細(xì)胞中的用途。
8.一種制備上皮細(xì)胞的方法，其特征在于，包括: 利用權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，以便誘導(dǎo)所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生自皮膚成纖維細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞和尿液細(xì)胞的至少一種， 任選地，在培養(yǎng)所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞之前，進(jìn)一步包括:將所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞消化 為單細(xì)胞， 任選地，利用Accutase進(jìn)行所述消化3_5min,任選地，在進(jìn)行所述消化之前，進(jìn)一步包括:利用含有10 μ M Υ-27632的mTeSRl?培養(yǎng)基、ES培養(yǎng)基或KSR條件培養(yǎng)基，于37°C條件下將所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞孵育I小時(shí)， 任選地，在培養(yǎng)所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞之前，進(jìn)一步包括對(duì)所述人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)， 任選地，通過(guò)Metrigel包被的培養(yǎng)板，利用選自mTeSRlTM、E8培養(yǎng)基和KSR條件培養(yǎng)基的至少一種進(jìn)行所述預(yù)培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，通過(guò)I型膠原包被的6孔培養(yǎng)板，保持`1.5-2.0X IO5細(xì)胞/孔的接種密度，進(jìn)行所述培養(yǎng)， 任選地，進(jìn)行所述培養(yǎng)10-20天， 任選地，進(jìn)行所述培養(yǎng)14天， 任選地，進(jìn)行所述培養(yǎng)時(shí)，隔日全量換液， 任選地，進(jìn)一步包括:在進(jìn)行所述培養(yǎng)的第一天，向所述培養(yǎng)基中添加ΙΟμΜ的Υ-27632, 任選地，進(jìn)一步包括:通過(guò)選自免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)的至少一種方法對(duì)所述上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定， 任選地，所述鑒定是通過(guò)檢測(cè)上皮細(xì)胞特異標(biāo)記Κ14、Κ15、Κ18、Κ19、CD29和Ρ63，以及干細(xì)胞多能性特異標(biāo)記0ct4和Nanog``的至少一種實(shí)現(xiàn)的。
【文檔編號(hào)】C12N5/074GK103525750SQ201310409332
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】裴端卿, 蔡景蕾, 劉朋飛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院