一種豬印跡基因Grb10的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬印跡基因Grb10及其應(yīng)用，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。通過PCR、序列比較發(fā)現(xiàn)該豬Grb10基因第17外顯子157位和215位堿基的SNP位點(diǎn)，進(jìn)一步應(yīng)用該位點(diǎn)鑒定Grb10基因的印跡狀態(tài)。本發(fā)明所公開的豬印跡基因Grb10，豐富了豬印跡基因的數(shù)量，為探索印跡基因在不同物種間的保守性、調(diào)控機(jī)制以及在豬生長發(fā)育過程中的功能作用提供信息，可用于以豬作為動(dòng)物模型研究人類Grb10基因異常疾病。
【專利說明】—種豬印跡基因GrbIO
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種印跡基因及其應(yīng)用，尤其涉及一種豬印跡基因GrblO及其應(yīng)用，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]哺乳動(dòng)物是二倍體生物，包含有兩套染色體，一套來源于母本，一套來源于父本。哺乳動(dòng)物的正常發(fā)育需要雙親基因組的正確表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中，多數(shù)基因是雙等位基因表達(dá)的。然而，一部分基因的表達(dá)具有親源特異性，只表達(dá)來源于母本或父本的等位基因，這類基因被稱為印跡基因。將母源等位基因表達(dá)，父源等位基因不表達(dá)的基因，稱為父源印跡基因；父源等位基因表達(dá)，母源等位基因不表達(dá)的基因，稱為母源印跡基因。
[0003]印跡基因存在于哺乳動(dòng)物中，作為一類不遵循傳統(tǒng)孟德爾遺傳規(guī)律的特殊基因而存在，其功能體現(xiàn)在對胚胎生長發(fā)育、胎盤功能的調(diào)控以及出生后行為的影響上。印跡基因的異常表達(dá)還引起多種疾病，比如在克隆豬的生產(chǎn)中，主要表現(xiàn)為胚胎和胎盤過度生長及胎盤異常等，主要由于體細(xì)胞的表觀重編程異?；蛴≯E基因異常等所造成。對于印跡基因的研究，始終圍繞著三個(gè)層次展開:印跡基因的篩選鑒定、印跡基因功能的探索、印跡基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究。到目前為止，在小鼠和人中發(fā)現(xiàn)的印跡基因數(shù)量超過150個(gè)，研究內(nèi)容涵蓋了包括基因功能、分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、印跡機(jī)制和疾病相關(guān)等方面。
[0004]與對小鼠和人的研究相比較，印跡基因在豬中的研究仍集中于挖掘與鑒定階段。主要包括了候選印跡基因的克隆，印跡狀態(tài)的鑒定與不同組織器官的差異表達(dá)等方面。印跡基因的主要功能體現(xiàn)在對胚胎和胎盤的影響，印跡基因的異常表達(dá)，在人上會(huì)導(dǎo)致如生長過剩、侏儒癥等各種生長發(fā)育方面的問題，在動(dòng)物中則較明顯的表現(xiàn)為流產(chǎn)率的提高、出生率的降低。
[0005]本發(fā)明根據(jù)印跡基因在哺乳動(dòng)物中具有較高保守性這一特征，利用生物信息學(xué)方法，將小鼠的印跡基因序列與豬的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對分析，從而對豬印跡基因進(jìn)行預(yù)測并篩選、鑒定，以此豐富豬印跡基因的數(shù)量，為探索印跡基因在不同物種間的保守性、調(diào)控機(jī)制以及在豬生長發(fā)育過程中的功能作用提供信息。
[0006]GrblO位于小鼠11號(hào)染色體近端， 編碼生長因子受體結(jié)合蛋白10，GrblO蛋白通過結(jié)合于胰島素受體(insulin receptor, IR)和胰島素樣生長因子I受體(insulin-likegrowth factor I receptor, IGFIR)等調(diào)節(jié)受體酪氨酸激酶活性。GRBlO位于人7號(hào)染色體短臂上，這個(gè)區(qū)域包含多個(gè)印跡基因簇，并且與印跡基因異常引起的疾病-SRS有關(guān)，該疾病主要表現(xiàn)為出生前后生長遲緩及發(fā)育異常等。小鼠上，通過基因捕獲技術(shù)獲得的GrblO第2外顯子至第4外顯子敲除的小鼠，在出生前后均發(fā)生異常，表現(xiàn)為胎兒期胎體及胎盤過度生長；成年后身體組成發(fā)生改變，包括肌肉含量增加及脂肪含量減少等。父源GrblODMR的敲除導(dǎo)致小鼠出生前和出生后發(fā)生嚴(yán)重的生長阻滯。小鼠GrblO由18個(gè)外顯子組成，翻譯起始位點(diǎn)位于第3外顯子內(nèi)，于第18外顯子翻譯終止。其中，第5外顯子在alpha亞型中存在，在beta亞型中缺失。人GRBlO由至少22個(gè)外顯子組成。在小鼠和人中，GrblO存在組織特異性啟動(dòng)子及多種剪接亞型。而且，印跡狀態(tài)也具有組織特異性。小鼠GrblO在多數(shù)組織中母源表達(dá)，在腦中父源表達(dá)；在人中，GRBlO在多數(shù)組織中雙等位基因表達(dá)，在腦中父源表達(dá)，GRBlO Y I亞型在骨骼肌中母源表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種豬印跡基因GrblO，其cDNA序列為SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列。
[0008]所述GrblO在第17外顯子的157位和215位堿基存在SNP位點(diǎn)；所述第17外顯子的序列如序列SEQ ID N0.2所示。
[0009]獲得所述豬印跡基因GrblO的方法，主要包括以下步驟:
[0010](I)以豬胎兒成纖維細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得GrblO基因；所述PCR擴(kuò)增引物為 cl-GrblO:5’ -CGATGTGATTGGCGGAAAG-3’(正向)和 5’ -GTAAACATAGCGGTTTTAATTGTCAAG-3’(反向)；
[0011](2)以豬耳組織DNA為模版，PCR擴(kuò)增GrblO基因第17外顯子，測序法尋找到在第17外顯子157位和215位堿基處存在SNP位點(diǎn)；所述PCR擴(kuò)增引物為dtD_GrblO:5，-GTCTTCTTCTGTCTCCCCAGTGC-3，(正向)和 5，-GTAAACATAGCGGTTTTAATTGTCAAG-3’(反向)。
[0012]本發(fā)明的第二個(gè)目的是要提供豬印跡基因GrblO在指示豬的生長發(fā)育指標(biāo)和以豬作為動(dòng)物模型研究人類Slc22a3基因異常疾病與腫瘤發(fā)生中的應(yīng)用，可用于區(qū)分父母源等位基因、鑒定印跡方向。
[0013]以I月齡仔豬15種組織器官和胎盤cDNA為模板，dt-GrblO為引物，對于第17外顯子處的SNP位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行cDNA測序，確定其印跡方向，測序結(jié)果表明，GrblO基因在I月齡仔豬的舌、腎、卵巢、胃、小腸、膀胱和腦中父源等位基因表達(dá)，在其他組織器官中雙等位基因表達(dá)；所述引物dt-GrblO的序列為5’ -CCAAAGGCATTTGTCCTCACAC-3’(正向)和5’ -GTCGGCACAGAACGAACGG-3’(反向)。
[0014]以dt-GrblO為引物對I月齡仔豬15種組織器官和胎盤進(jìn)行SYBR法熒光定量PCR，描述基因在各組織器官的表達(dá)模式。結(jié)果表明，GrblO在豬各組織器官中廣泛表達(dá)，在肺組織中表達(dá)水平最高，在腦中表達(dá)水平最低。
[0015]本發(fā)明所提供的豬GrblO基因是豬印跡基因，與豬生長發(fā)育指標(biāo)相關(guān)，可用于研究豬的數(shù)量性狀相關(guān)；同時(shí)以豬作為動(dòng)物模型研究人類GRBlO基因異常疾病。
[0016]本發(fā)明所提供的一種豬印跡基因GrblO， 豐富了豬印跡基因的數(shù)量，為探索印跡基因在不同物種間的保守性、調(diào)控機(jī)制以及在豬生長發(fā)育過程中的功能作用提供信息。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1GrblO基因克隆引物的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
[0018]圖2GrblO基因外顯子克隆引物的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜；M =Maker ；1:dtD-GrblO 的 PCR 產(chǎn)物；2:dt-Grbl0 的 PCR 產(chǎn)物。
[0019]圖3GrblO_exonl7的第157位堿基PCR膠回收產(chǎn)物測序峰圖；1:母本早NBBffl 100115的耳組織DNA第157位堿基測序峰圖；2:父本(? 007062的耳組織DNA第157位堿基測序峰圖；3:F1代仔豬早007003的耳組織DNA第157位堿基測序峰圖；4:F1代仔豬(I 007004的耳組織DNA第157位堿基測序峰圖；箭頭指向SNP位點(diǎn)。
[0020]圖4GrblO_exonl7的第215位堿基PCR膠回收產(chǎn)物測序峰圖；1:母本早NBBffl 100115的耳組織DNA第215位堿基測序峰圖；2:父本c? 007062的耳組織DNA第215位堿基測序峰圖；3:F1代仔豬早007003的耳組織DNA第215位堿基測序峰圖；4:F1代仔豬007004的耳組織DNA第215位堿基測序峰圖；箭頭指向SNP位點(diǎn)。
[0021]圖5豬GrblO基因印跡表達(dá)狀態(tài)峰圖；1月齡仔豬15種組織器官和胎盤的測序峰圖，I~16分別為:肌肉、脂肪、舌、肝、肺、心、腎、卵巢、子宮、睪丸、脾、胃、小腸、膀胱、腦；箭頭指向SNP位點(diǎn)。
[0022]圖6豬GrblO在各組織器官的相對表達(dá)水平。
【具體實(shí)施方式】
[0023]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0024]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地，用于SNP位點(diǎn)檢測的豬包括大白豬5頭、長白豬10頭、叢江豬4頭和巴馬豬17頭，選取耳組織用于DNA提取。Fl代I月齡雜合仔豬3頭，屠宰選取組織器官，液氮凍存運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室，_80°C冰箱保存。
[0025]實(shí)施例1Grbl O基因的克隆
[0026]以豬胎兒成纖維細(xì)胞cDNA為模板，以cl-GrblO為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為 5’ -CGATGTGATTGGCGGAAAG-3’ (反向)和 5’ -GTAAACATAGCGGTTTTAATTGTCAAG-3’ (正向)，PCR 反應(yīng)體系為 50μ L:LA Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L，10XLA Taq Buffer (Mg2+Plus)5 μ L, dNTPs8 μ L (Takara),模板 50ng, 10 μ mol/L 上下游引物各 I μ L, ddH20 補(bǔ)足。PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸2min，40個(gè)循環(huán)；72°C終延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收并連接PMD18-T載體進(jìn)行測序，得到長度為181Ibp的cDNA序列(SEQ ID N0.1)。GrblO克隆序列包含1455bp的開放閱讀框(Open Reading Frame，0RF)和356bp的3’端非編碼區(qū)(3primeuntranslated regions, 3’ UTR)。通過 DNAMAN 軟件將 GrblO 克隆序列與預(yù)測序列(NCBI,NM_001134965)比對，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)得到的序列第4外顯子與第5外顯子缺失，能夠編碼457個(gè)氨基酸。
[0027]實(shí)施例2GrblO基因外顯子的克隆
[0028]以豬耳組織DNA為模板，dtD-GrblO為引物，引物序列為5，-GTCTTCTTCTGTCTCCCCAGTGC-3，(正向)和 5，-GTAAACATAGCGGTTTTAATTGTCAAG-3’(反向)，PCR 反應(yīng)體系為 50μ L:Ex Taq DNA 聚合酶 0.25 μ L，IOXEx Taq Buffer (Mg2+Plus)
5μ L, dNTPs4 μ L (Takara)，模板 50ng, 10 μ mol/L 上下游引物各 I μ L, ddH20 補(bǔ)足。PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，40個(gè)循環(huán)；72°C終延伸lOmin，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖2所示。
[0029]實(shí)施例3Slc22a3基因外顯子SNP的尋找[0030]根據(jù)實(shí)施例2中的方法，對36頭親本豬的耳組織進(jìn)行測序比對，用于SNP位點(diǎn)的檢測。如圖3、圖4中的I號(hào)和2號(hào)測序峰圖所示，在巴馬豬早NBBffl 100115 (T/T G/G)與巴馬豬cf 007062 (C/T C/G)的GrblO第17外顯子的第157位和第215位各存在I個(gè)位點(diǎn)的SNP突變。
[0031]選取親本為早NBBffl 100115 (T/T G/G) X (I 007062 (C/T C/G)的 7 頭仔豬耳組織DNA進(jìn)行檢測，F(xiàn)l代仔豬基因型見(表1)，選擇雜合型Fl代仔豬早007003和/ 007004,SNP位點(diǎn)峰圖見圖3、圖4中的3號(hào)和4號(hào)測序峰圖，表明這兩頭仔豬均為雜合型，其中等位基因第157位T與215位G來自母本，第157位C與215位C來自父本。
[0032]表1Fl代仔豬基因型列表
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種豬印跡基因Slc22al8，其特征在于，其cDNA序列為SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述Slc22al8基因，其特征在于，在第4外顯子的79位堿基存在SNP位點(diǎn)；所述第4外顯子的序列如序列SEQ ID N0.2所示。
3.獲得權(quán)利要求1所述豬印跡基因的方法，包括以下步驟: (O以豬胎兒成纖維細(xì)胞cDNA為模版，PCR擴(kuò)增獲得Slc22al8基因； (2)以豬耳組織DNA模版，分別PCR擴(kuò)增Slc22al8基因第2、3、4、5外顯子，測序法尋找到在第4外顯子第79位堿基存在SNP位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求1所述基因Slc22al8在以豬為動(dòng)物模型研究人類Slc22al8基因異常疾病引發(fā)的腫瘤和指示豬的生長發(fā)育中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其 特征在于，可用于區(qū)分父母源等位基因、鑒定印跡方向。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103468707SQ201310409329
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】孔慶然, 尹智, 劉忠華, 周洋 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)