一種提高白酒風味物質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus sp.)B-010固體培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高白酒風味物質(zhì)芽孢桿菌（Bacillussp.）B-010固體培養(yǎng)方法，包含以下步驟：將芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，于30-40℃培養(yǎng)12-36h；液體種子培養(yǎng)：接種斜面種子，接種量為10-15%，30-40℃，100-300rpm，培養(yǎng)時間15-30h；固體種曲培養(yǎng)：接種的三級液體種子，拌勻，接種溫度30-40℃，培養(yǎng)時間為15-30h；通風培養(yǎng)：以1-10‰的接種量接種的固體種曲，翻料混勻，培養(yǎng)時間16-30h，期間進行間歇鼓風，控制品溫在40-60℃。利用本方法制曲，芽孢桿菌（Bacillussp.）B-010經(jīng)固體培養(yǎng)后，α-乙酰乳酸脫羧酶活力為80-150U/g，糖化酶20U/g-50U/g，中性蛋白酶100U/g-500U/g，堿性蛋白酶300U/g-800U/g。另外該菌株還產(chǎn)生3-羥基丁酮的量為：10-20mg/g。
【專利說明】—種提高白酒風味物質(zhì)芽孢桿菌(公C/7/?/s Sp.)B-010固體培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于釀酒的細菌固體培養(yǎng)方法，屬生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種由芽孢桿菌制備并應(yīng)用于芝麻香白酒的細菌培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]在芝麻香白酒生產(chǎn)中，麩曲質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響白酒的產(chǎn)量、質(zhì)量與風格。隨著芝麻香型白酒研究的進展，微生物在白酒釀造中的機理逐漸明了。其中，細菌具有一定的液化力、糖化力、蛋白質(zhì)分解力和脂肪分解力，為美拉德反應(yīng)提供多種氨基酸，推進美拉德反應(yīng)的進行，生成芝麻香香味成份及其前體，芽孢桿菌能產(chǎn)生大量中/堿性蛋白酶，原料中的蛋白質(zhì)通過細菌蛋白酶的作用，為美拉德反應(yīng)提供多種氨基酸，這些氨基酸是生成芝麻香香味成份的前體物質(zhì)；另外，芽孢桿菌能夠通過自身代謝產(chǎn)生3-羥基丁酮，進一步合成四甲基吡嗪等芝麻香微量香味物質(zhì)，是形成芳香物質(zhì)的重要菌源。因此細菌是提高芝麻香型白酒質(zhì)量的有效菌株，在芝麻香型白酒生產(chǎn)中的作用日益受到重視。
[0003]本項目研究選育了一株高產(chǎn)脫羧酶、中/堿性蛋白酶，及少量3-羥基丁酮的芽孢桿菌B-010，經(jīng)過一、二、三級液體種子培養(yǎng)、固體種曲培養(yǎng)、通風培養(yǎng)，制成芽孢桿菌{Bacillus sp.) B-010，在不改變原有工藝的前提下添加到芝麻香白酒生產(chǎn)中，進行連續(xù)發(fā)酵試驗。結(jié)果表明:添加芽孢桿菌B-010的芝麻香白酒窖池出酒率無明顯變化，但是優(yōu)質(zhì)酒產(chǎn)量平均提高15.7%，最高可達24.4%，芝麻香型白酒中四甲基吡嗪、3-羥基丁酮、高級醇類、高級酯類、以及3-甲硫基丙醇等風味物質(zhì)明顯提高，芝麻香白酒香味協(xié)調(diào)，尾凈，風格較突出，真正達到降低消耗，增加效益的目的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種提高白酒風味物質(zhì)芽孢桿菌sp.) B-OlO固體培養(yǎng)方法。
[0005]本方法主要通過一、二、三級液體種子培養(yǎng)、固體種曲培養(yǎng)、通風培養(yǎng)，制成芽孢桿麗{Bacillus sp.) B-OlO0 一種芽孢桿菌(ifeciJrJrW1S sp.) B-010固體培養(yǎng)方法,其特征在于包含以下步驟:
將芽孢桿菌(feci77心sp.) B-010 (CJMCC N0.1922)接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，于 30-40°C培養(yǎng) 12-36h。
[0006]一、二、三級液體種子培養(yǎng):牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，pH7.0，滅菌，接種芽孢桿菌 UaciWm sp.) B-010 (CJMCC N0.1922)接種量為 10-15%，30_40°C，100-300rpm，培養(yǎng)時間 15_30h。
[0007]固體種曲培養(yǎng):取麩皮加水潤料2-6h，蒸料20-80min，使水分控制在40_60%，接種三級液體種子，拌勻，接種溫度30-40°C，培養(yǎng)時間為15-30h，期間翻曲，控制品溫在30-60。。。
[0008]通風培養(yǎng):取麩皮，加水潤糧了 2-8h，蒸料20-90min，使水分控制在40_60%，用酒糟調(diào)整酸度1.0%-2.0%，以1_10%。的接種量接種固體種曲，翻料混勻，培養(yǎng)時間16-30h，期間進行間歇鼓風，控制品溫在40-60°C。作為對本方法的進一步改進，通風培養(yǎng)過程中要2h-10h以后間歇通風，控制頂溫不超過40-60°C，成品酸度〈1%-3.5%。
[0009]作為對本技術(shù)方案的進一步改進，通風培養(yǎng)要2-10h以后間歇通風，控制頂溫不超過40-60°C，成品酸度〈1%-3.5%。
[0010]作為對本技術(shù)方案的進一步改進，用葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)脫羧酶的量為300-500U/mL，產(chǎn)3-羥基丁酮的量為5_20g/L。
[0011]作為對本技術(shù)方案的進一步改進，選擇的葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基為:葡萄糖1-5%,蛋白胨0.5-5%，牛肉膏0.1-1%，酵母膏0.1-1%，硫酸鎂0.001-0.1%，磷酸氫二鉀0.1-2%，硫酸銨0.1-5%，硫酸鋅0.001-0.01%。在工業(yè)化的生產(chǎn)中可用牛肉汁代替，牛肉汁的用量為30-80%。
[0012]本發(fā)明的芽孢桿菌sp.) B-OlO菌株具有以下培養(yǎng)特征:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)24h，菌落呈現(xiàn)圓形，乳白色，凸起，邊緣有絨毛不規(guī)整，表面光滑粘稠不易挑起。
[0013]本發(fā)明的芽孢桿菌sp.) B-OlO菌株具有以下形態(tài)特征:于光學顯微鏡觀察芽孢桿菌的菌體形態(tài)，該菌株特征為:菌體桿狀，單生，大小約0.8X1.65ym(TO),W芽孢，橢圓形，包囊不膨大，中生或次中生。
[0014]本發(fā)明的芽孢桿菌5/7.) B-OlO具有以下生物學特征:芽孢桿菌{Bacillus sp.) B-OlO的生長溫度為20_60°C，最適生長溫度為30_50°C，在pH3_8的范圍內(nèi)均能生長。
[0015]本發(fā)明的芽孢桿菌sp.)B-010菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，連續(xù)傳代數(shù)代培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征及形態(tài)均無明顯變化，該菌株的生物學性狀穩(wěn)定。
[0016]本發(fā)明涉及的應(yīng)用于芝麻香白酒生產(chǎn)的細菌培養(yǎng)方法具有如下顯著進步:
O培養(yǎng)應(yīng)用于生產(chǎn)的菌種B-010是一株耐高溫的芽孢桿菌,產(chǎn)香功能較好；
2)利用該方法培養(yǎng)的B-010，香氣濃郁，曲料粘稠，氨味較重；
3)利用該方法培養(yǎng)的B-010，適合于釀酒工藝中的高溫堆積高溫發(fā)酵，豐富了原生產(chǎn)用細菌菌種類型。
[0017]利用本方法制曲，一、二、三級液體種子培養(yǎng)中三級液體種子細胞數(shù):10 X 108-100 X 108個/mL ;種曲細胞數(shù):100 X 108-500 X 108個/g ;通風曲細胞數(shù):100 X 108-1000 X 108個/g。用葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)菌株B-OlO脫羧酶活力可達200-600U/mL，產(chǎn) 3-羥基丁酮的量為:5_20g/L。
[0018]芽孢桿菌(feci77心sp.) B-010經(jīng)固體培養(yǎng)后，α-乙酰乳酸脫羧酶活力為80-150U/g 糖化酶 20U/g-50U/g，中性蛋白酶 100U/g_500U/g，堿性蛋白酶 300U/g_800U/go另外該菌株還產(chǎn)生3-輕基丁酮的量為:10-20mg/g。
[0019]將該菌種應(yīng)用于芝麻香白酒生產(chǎn)中，發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)微量成分分析可知，不僅能提高四甲基吡嗪、2，3- 丁二醇、3-羥基丁酮等重要風味物質(zhì)的含量，通過添加新菌種B-010，增加體系中的α -乙酰乳酸脫羧酶和3-羥基丁酮，從而提高2，3- 丁二醇、3-羥基丁酮、四甲基吡嗪等相關(guān)物質(zhì)的含量,豐富芝麻香型白酒香氣成分；同時可大大增加釀造體系里中/堿性蛋白酶的含量，增加體系中氨基酸的含量從而為美拉德反應(yīng)提供大量的前體物質(zhì)；此外，B-OlO還能產(chǎn)生少量的糖化酶，為提高出酒率做出貢獻。
[0020]由此可見，在芝麻香型白酒的釀造中，在不改變原有釀酒工藝的基礎(chǔ)上，將固體培養(yǎng)的芽孢桿菌(feci77心sp.) B-010以適當比例添加到原生產(chǎn)中，能夠有效的豐富白酒的香氣成分，提聞白酒品質(zhì)。

【具體實施方式】
[0021]以下是本發(fā)明的一種提高白酒風味物質(zhì)芽孢桿菌sp.)B-010固體培養(yǎng)方法的具體實施例，下面的實施例是對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步描述。但，本發(fā)明的保護范圍不限于這些實施例，凡是不背離本發(fā)明技術(shù)方案構(gòu)思的改變或?qū)ζ浼夹g(shù)特征的等同代替均包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0022]實施方式一:
a)將芽孢桿菌心sp.) B-010 (CJMCC N0.1922)接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)12h。
[0023]b) 一、二、三級液體種子培養(yǎng):牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，ρΗ7.0,121°C滅菌20min，接種步驟a)的斜面種子，接種量為10%，30°C，lOOrpm，培養(yǎng)時間15h。
[0024]c)固體種曲培養(yǎng):取麩皮加水潤料2h，蒸料20min，使水分控制在40%，接種步驟b)的三級液體種子，拌勻，接種溫度30°C，培養(yǎng)時間為15h，期間翻料，控制品溫在30°C。
[0025]d)通風培養(yǎng):取麩皮，加水潤糧2h，蒸料20min，使水分控制在40%，用酒糟調(diào)整酸度1.0%，以1_10%。的接種量接種步驟C)的固體種曲，翻料混勻，培養(yǎng)時間16h，期間進行間歇鼓風，控制品溫在40°C，即可得到本方法所述的芽孢桿菌。
[0026]實施方式二:
a)將芽孢桿菌心sp.) B-010 (CJMCC N0.1922)接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，于30-40°C培養(yǎng)12-36h。
[0027]b) 一、二、三級液體種子培養(yǎng):牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，pH7.0，121°C滅菌20min，接種步驟a)的斜面種子，接種量為15%，40°C，300rpm，培養(yǎng)時間30h。
[0028]c)固體種曲培養(yǎng):取麩皮加水潤料6h，蒸料80min，使水分控制在60%，接種步驟b)的三級液體種子，拌勻，接種溫度40°C，培養(yǎng)時間為30h，期間翻料，控制品溫在60°C。
[0029]d)通風培養(yǎng):取麩皮，加水潤糧8h，蒸料90min，使水分控制在60%，用酒糟調(diào)整酸度2.0%，以1_10%。的接種量接種步驟c)的固體種曲，翻料混勻，培養(yǎng)時間30h，期間進行間歇鼓風，控制品溫在60°C，即可得到本方法所述的芽孢桿菌。
[0030]實施方式三:
a)將芽孢桿菌心sp.) B-010 (CJMCC N0.1922)接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，于30-40°C培養(yǎng)12-36h。
[0031]b) 一、二、三級液體種子培養(yǎng):牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，ρΗ7.0,121°C滅菌20min，接種步驟a)的斜面種子，接種量為13%，35°C，200rpm，培養(yǎng)時間23h。
[0032]c)固體種曲培養(yǎng):取麩皮加水潤料4h，蒸料50min，使水分控制在50%，接種步驟
b)的三級液體種子，拌勻，接種溫度35°C，培養(yǎng)時間為23h，期間翻料，控制品溫在45°C。
[0033]d)通風培養(yǎng):取麩皮，加水潤糧5h，蒸料55min，使水分控制在50%，用酒糟調(diào)整酸度1.0%-2.0%，以1_10%。的接種量接種步驟c)的固體種曲，翻料混勻，培養(yǎng)時間24h，期間進行間歇鼓風，控制品溫在50°C。即可得到本方法所述的芽孢桿菌。
[0034]利用本方法制曲，一、二、三級液體種子培養(yǎng)中三級液體種子細胞數(shù):10 X 108-100 X 108個/mL ;種曲細胞數(shù):100 X 108-500 X 108個/g ;通風曲細胞數(shù):100 X 108-1000 X 108個/g。用葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)菌株B-OlO脫羧酶活力可達200-600U/mL，產(chǎn) 3-羥基丁酮的量為:5_20g/L。
[0035]芽孢桿菌(feci77心sp.) B-010經(jīng)固體培養(yǎng)后，α-乙酰乳酸脫羧酶活力為80-150U/g，糖化酶 20U/g-50U/g，中性蛋白酶 100U/g_500U/g，堿性蛋白酶 300U/g_800U/g。另外該菌株還產(chǎn)生3-羥基丁酮的量為:10-20mg/g。
[0036]將該菌種應(yīng)用于芝麻香白酒生產(chǎn)中，發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)微量成分分析可知，不僅能提高四甲基吡嗪、2，3- 丁二醇、3-羥基丁酮等重要風味物質(zhì)的含量，通過添加新菌種B-010，增加體系中的α -乙酰乳酸脫羧酶和3-羥基丁酮，從而提高2，3- 丁二醇、3-羥基丁酮、四甲基吡嗪等相關(guān)物質(zhì)的含量見下表，豐富芝麻香型白酒香氣成分；同時可大大增加釀造體系里中/堿性蛋白酶的含量，增加體系中氨基酸的含量從而為美拉德反應(yīng)提供大量的前體物質(zhì)；此外，Β-010還能產(chǎn)生少量的糖化酶，為提高出酒率做出貢獻。
[0037]由此可見，在芝麻香型白酒的釀造中，在不改變原有釀酒工藝的基礎(chǔ)上，將固體培養(yǎng)的芽孢桿菌(feci77心sp.) B-010以適當比例添加到原生產(chǎn)中，能夠有效的豐富白酒的香氣成分，提聞白酒品質(zhì)。
【權(quán)利要求】
1.一種提高白酒風味物質(zhì)芽孢桿菌(^3ci77i/5.sp.)B-010固體培養(yǎng)方法,其特征在于包含以下步驟: a)將芽孢桿菌Uaci77心sp.) B-OlO (CJMCC N0.1922)接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，于30-40°C培養(yǎng)12-36h ； b)一、二、三級液體種子培養(yǎng):牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，pH7.0，121°C滅菌20min，接種步驟a)的斜面種子，接種量為10_15%，30-40°C，100-300rpm,培養(yǎng)時間 15-30h ； c)固體種曲培養(yǎng):取麩皮加水潤料2-6h，蒸料20-80min，使水分控制在40_60%，接種步驟b)的三級液體種子，拌勻，接種溫度30-40°C，培養(yǎng)時間為15-30h，期間翻料，控制品溫在 30-60 0C ； d)通風培養(yǎng):取麩皮，加水潤糧2-8h，蒸料20-90min，使水分控制在40_60%，用酒糟調(diào)整酸度1.0%-2.0%，以1_10%。的接種量接種步驟c)的固體種曲，翻料混勻，培養(yǎng)時間16-30h,期間進行間歇鼓風，控制品溫在40-60°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高白酒風味物質(zhì)芽孢桿菌sp.) B-010培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的通風培養(yǎng)要2-10h以后間歇通風，控制頂溫不超過40-60°C，成品酸度〈1%-3.5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高白酒風味物質(zhì)芽孢桿菌sp.) B-010培養(yǎng)方法，其特征在于:用葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)脫羧酶的量為300-500U/mL，產(chǎn)3-羥基丁酮的量為5-20g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高白酒風味物質(zhì)芽孢桿菌(Bacillussp.) B-OlO培養(yǎng)方法，其特征在于:選擇的葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基為，葡萄糖1_5%，蛋白胨0.5-5%，牛肉膏0.1-1%，酵母膏0.1-1%，硫酸鎂0.001-0.1%，磷酸氫二鉀0.1-2%，硫酸銨0.1-5%，硫酸鋅 0.001-0.01%。
【文檔編號】C12N1/20GK104250622SQ201310259607
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月27日
【發(fā)明者】袁建國, 趙紀文, 李峰, 任明 申請人:山東省中協(xié)食品添加劑研究開發(fā)中心, 山東扳倒井股份有限公司