一種產油酵母脂滴蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種產油酵母脂滴蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的產油酵母脂滴蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質：(a)由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將SEQ?ID?NO：1的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有所述脂滴蛋白相關活性的由SEQ?ID?NO：1衍生的蛋白質。綠色熒光蛋白共定位和油脂發(fā)酵分析證明本發(fā)明的產油酵母脂滴蛋白及其編碼基因能顯著提高細胞油脂積累和貯存量。本發(fā)明還通過基因異源表達獲得了可顯著提高油脂積累量的重組菌株。本發(fā)明的產油酵母脂滴蛋白及其編碼基因可應用微生物油脂、脂肪酸衍生物生產菌株構建，以及作為肥胖病人治療藥物篩選的靶標。
【專利說明】一種產油酵母脂滴蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及一種產油酵母脂滴蛋白及其基因與應用。具體地，所述產油酵母脂滴蛋白以及編碼其的核苷酸來源于粘紅酵母(R.glutinis)。本發(fā)明還提供一種構建油脂生產重組細胞的方法。
【背景技術】
[0002]油脂是一種氧含量低、能量密度高、碳鏈長度適中的可再生資源，可以代替化石資源作為化學工業(yè)和可再生能源產業(yè)的基本加工原料，是人類從碳氫經濟向碳氫氧經濟過渡的重要鏈接，其市場潛力巨大。自然界中一部分微生物在特定條件下(如氮源缺乏)能在胞內貯存超過其細胞干重20%的油脂，其中以甘油三酯為主，具有這種表型的微生物稱為產油微生物，包括細菌、酵母、霉菌、藻類等，其中產油酵母包括Rhodotorula, Candida,Cryptococcus, Rhizopus, Trichosporon 和 Yarrowia 屬中的某些菌株[Ratledge C, WynnJ P.Adv Appl Microbiol2002，51，l-51]。利用微生物轉化生物質資源生產油脂，可發(fā)展成基本不依賴耕地、可連續(xù)生產、降低農業(yè)污染、資源綜合利用的新技術，形成化學品的石化資源替代品生產新途徑[趙宗保.中國生物工程雜志2005，25 (2)，8-11]。
[0003]半個世紀以來，國內外微生物油脂研究的重點集中在菌株篩選、馴化和發(fā)酵工藝優(yōu)化等領域，取得了重大進展。隨著生物技術的快速發(fā)展，單純的菌種篩選和培養(yǎng)工藝的優(yōu)化已不能滿足產油 微生物性狀改良的需要。做為某一化學品的天然生產菌株，其特定的生產性能往往并非最優(yōu)。如何優(yōu)化或改變工業(yè)菌株的代謝網絡和表達調控網絡，以提高生物基產品的積累速度或定向控制靶產品的質量，是當今生物【技術領域】研究的熱點和難點。油脂發(fā)酵研究需要油脂代謝途徑的重構和強化，賦予重組菌株生產新型脂肪酸衍生物的性能。由于優(yōu)良土著生產菌株的遺傳背景目前仍不清楚，油脂積累代謝調控相關基因克隆有限，尋找更多的油脂積累代謝調控相關基因，是目前微生物油脂研究的重要方向之一。
[0004]研究人員發(fā)現，來源于產油微生物(圓紅冬孢酵母和斯氏油脂酵母)的異檸檬酸脫氫酶(IDH)和蘋果酸酶(ME)的編碼基因在土著菌油脂積累過程中有表達差異，釀酒酵母功能互補分析也證明這些基因可增加重組菌株的油脂含量，但并沒能將一個非產油菌株成功改造成一個產油菌株[Yang F, Zhang SF, Zhou YJ, Zhu Zff, Lin XP, Zhao ZK.Appl.Microbiol.Biotechnol.2012,94(4)，1095-1105]。實驗結果暗示，微生物油脂積累代謝調控可能涉及更多的基因及其間的相互調節(jié)和相互作用。
[0005]脂滴(Lipid droplets)是細胞內中性脂肪貯存的主要場所，直徑從40nm至100 μ m不等，廣泛存在于植物、昆蟲和動物細胞中。其由極性單磷脂層包裹中性脂組成的疏水核心而構成，并且表面分布有很多蛋白，成熟脂滴中含量最豐富的表面蛋白是周脂素(perilipin)0做為脂滴相關蛋白家族(PAT家族)成員，周脂素具有典型的PAT-1結構域(氨基端1-1OOaa);其中間1/4部分為疏水氨基酸組成的脂滴錨定結構域，而羧基端則和保護甘油三酯不被水解，增加油脂含量功能相關。周脂素的功能與其磷酸化狀態(tài)有關，在基礎狀態(tài)下，周脂素未磷酸化，在脂滴表達形成一種物理屏障，阻止脂肪酶接觸到脂滴內的甘油三酯，從而保護脂滴內中性脂免受降解；在能量低下、營養(yǎng)匱乏的條件下，它被蛋白激酶A(PKA)磷酸化，招募激素敏感脂肪酶(HSL)到脂滴表面，水解中性脂，為細胞提供能量；因此該蛋白在調節(jié)脂質儲存和降解具有重要作用[Bickel PE, TanseyJT, Welte MA.BiochimBiophys Acta.2009,1791(6),419-440][Miura S, Gan Jff, Brzostowski J, Parisi MJ,Schultz CJ, Londos C,Oliver B,Kimmel AR.J Biol Chem.2002，277(35)，32253-32257]。該基因在動物與某些子實體真菌中廣泛存在，但是在釀酒酵母中未發(fā)現周脂素同源基因；在動物體內，周脂素做為一種重要的信號調控“開關裝置”，可以調控機體脂肪的儲存和釋放。
[0006] 和動物的脂肪細胞一樣，產油酵母合成的甘油三酯以脂滴的形式貯存在細胞內部，隨著油脂積累量的增加，脂滴不斷變大或相互融合，在油脂積累后期，脂滴幾乎占據了整個產油酵母的細胞大小[Zhu Zff, Zhang SF, Liu HW, Shen HW, Lin XP, Yang F，Zhou YJ,Jin GJ, Ye ML, Zou HF, ZhaoZK.Nat.Commun.2012,3,1112, Supplementary Figure S6]。2007年，在金龜子綠僵菌中首次鑒定了周脂素，并證明它具有保護脂滴免受降解的作用[Wang C，St Leger RJ.J Biol Chem.2007，282 (29)，21110-21115]。最近，通過脂滴蛋白質組學研究，我們鑒定到產油酵母粘紅酵母(R.glutinis)油脂積累期間一種新穎的周脂素樣蛋白高豐度表達，并發(fā)現該蛋白的豐度與油脂含量成正比，將其命名為RgLDPl(R.glutinis lipid droplet proteinl,粘紅酵母脂滴蛋白I),根據實驗結果,推測該基因與產油微生物油脂積累、貯運和代謝調控密切相關。截止專利提交日，NCBI上未檢索到關于粘紅酵母周脂素的任何序列信息。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種產油酵母脂滴蛋白及其編碼基因與應用。
[0008]本發(fā)明提供的產油酵母脂滴蛋白，名稱為RgLDPl (R.glutinis lipid dropletproteinl,粘紅酵母脂滴蛋白I),來源于粘紅酵母R.glutinis ATCC204091,是如下a)或
(b)的蛋白質:
[0009](a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0010](b)將SEQ ID NO:1的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有所述脂滴蛋白相關活性的由SEQ ID NO:1衍生的蛋白質。
[0011]其中所述“脂滴蛋白相關活性”是指促進脂滴融合、生長，增加脂滴內油脂積累，穩(wěn)定脂滴形態(tài)與功能，參與油脂貯運和代謝調控相關的脂滴蛋白活性。
[0012]為了使本發(fā)明的產油酵母脂滴蛋白便于純化，可以在上述(a)或(b)蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0013]表1用于純化的標簽及其序列
[0014]
【權利要求】
1.一種產油酵母脂滴蛋白，是下述(a)或(b)的蛋白質: (a)由SEQID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將SEQID NO:1的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有所述脂滴蛋白相關活性的由SEQ ID NO:1衍生的蛋白質。
2.一種編碼權利要求1的產油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列是SEQID NO:2所示的DNA分子。
4.包含權利要求2或3的核苷酸序列的重組載體。
5.一種重組細胞，所述細胞導入權利要求4所述的重組載體。
6.一種構建油脂生產重組細胞的方法，所述方法包括:將權利要求2或3所述基因導入宿主細胞中，得到油 脂生產重組細胞。
7.根據權利要求6所述的方法，其中通過用權利要求4所述的重組載體轉化宿主細胞而導入權利要求2或3所述的基因。
8.根據權利要求6所述的方法，其中所述宿主細胞選自酵母、微藻、紅球菌或大腸桿菌。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述酵母選自釀酒酵母或粘紅酵母，所述微藻選自衣藻或聚球藻，所述紅球菌是渾濁紅球菌。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述衣藻是萊茵衣藻。
【文檔編號】C12N1/21GK103965306SQ201310039417
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月31日 優(yōu)先權日:2013年1月31日
【發(fā)明者】趙宗保, 朱志偉, 張素芳 申請人:中國科學院大連化學物理研究所