用于stec細菌的檢測和鑒定的序列以及它們的使用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基于核酸序列的存在的檢測和鑒定STEC細菌的快速方法，具體地，涉及基于PCR的檢測方法，以及涉及因此有用的寡核苷酸分子和試劑以及試劑盒。這個方法優(yōu)選地用于檢測食物或水樣品中，諸如牛肉富集物中的STEC細菌。本發(fā)明還涉及用于實施本發(fā)明的方法的分離的多核苷酸、復(fù)制組合物、試劑盒和試劑片。
【專利說明】用于STEC細菌的檢測和鑒定的序列以及它們的使用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基于核酸序列的存在檢測和鑒定產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Escherichiacoli)的方法，優(yōu)選基于PCR的檢測方法，以及涉及寡核苷酸分子及用于其的試劑和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌(E.coli)是革蘭氏陰性、桿狀細菌。雖然大多數(shù)大腸桿菌(E.coli)的菌株是良性的，并且被發(fā)現(xiàn)是人和其他動物的腸道正常菌群，但一些菌株是致病的并且能夠?qū)е录膊?。不同的致病大腸桿菌(E.coli)菌株在流行病學，臨床病程和導(dǎo)致疾病爆發(fā)的潛力方面是不同的。
[0003]產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Escherichia coli) (STEC)是一種腸出血性大腸細菌,其可引起輕度至嚴重的腸道疾病，腎臟問題，甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng)。這些菌株的致病性是由于，在很大程度上，其產(chǎn)生的志賀樣毒素Stxl和Stx2。另外，由eae基因編碼的緊密黏附素粘附蛋白的生成已被證實與細菌的致病性有關(guān)，因為其具有某種表面抗原，包括026、0111、0121、045、0103、和 0145 抗原。
[0004]一種熟知的STEC細菌血清型是大腸桿菌(E.coli)血清型0157:H7，其已經(jīng)與多起食物和水傳播的爆發(fā)相關(guān)。美國農(nóng)業(yè)部以零容忍標準控制這種細菌血清型作為碎牛肉中的摻雜物。由于其嚴格的監(jiān)管，市場上存在眾多針對大腸桿菌(E.coli) 0157:H7的測試。然而，眾多其他STEC細菌菌株也能致病，對其他STEC細菌血清型，或一般來講STEC細菌的檢測對于改善食品安全是很重要的。
[0005]因此，期望用于樣品中STEC細菌的準確檢測和鑒定的測試。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個方面是檢測樣品中STEC細菌的存在的方法，所述樣品包含核酸，所述方法包括:
[0007](a)提供反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含適宜的引物對用于擴增eae基因、StxlA基因和Stx2A基因中的一個或多個的至少一部分；
[0008](b)使用步驟(a)的所述反應(yīng)混合物進行所述樣品的所述核酸的PCR擴增；以及
[0009](c)檢測步驟(b)的所述擴增。
[0010]在某些例子中，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中STEC細菌的存在的方法，所述樣品包含核酸，所述方法包括:
[0011](a)提供反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含用于擴增和檢測SEQ ID NO:688 (eae)的至少一部分的第一引物、第二引物和探針；其中所述第一引物、第二引物和探針的每個包含5’末端和3’末端；其中所述第一引物包含SEQ ID NO: 145或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸；并且其中所述探針包含SEQ ID NO: 160或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸；[0012](b)使用步驟(a)的所述反應(yīng)混合物進行所述樣品的所述核酸的PCR擴增；以及
[0013](c)檢測步驟(b)的所述擴增。
[0014]在某些實施例中，所述第二引物包含核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO: 191或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸。在另外的實施例中，所述第一引物包含選自SEQID NOs: 146-159的序列，所述第二引物包含選自SEQ ID NOs: 192-205的序列，并且所述探針包含選自SEQ ID NOs: 161-175的序列。在附加的實施例中，所述探針的3’末端直接或間接連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在另外的實施例中，所述引物-探針復(fù)合物能被可檢測地標記。在附加的實施例中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含SEQ ID NO: 176的至少15個連續(xù)的核苷酸。在一些實施例中，所述樣品包括食物樣品或水樣品。
[0015]在其他例子中，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中STEC細菌的存在的方法，所述樣品包含核酸，所述方法包括:
[0016](a)提供反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含用于擴增和檢測SEQ ID NO:686(StxlA)的至少一部分的第一引物、第二引物和探針；其中所述第一引物、第二引物和探針的每個包含5’末端和3’末端；并且其中所述第一引物和探針選自:
[0017](I)包含SEQ ID NO:1或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的第一引物，以及其包含SEQ ID NO: 16或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的探針；
[0018](II)包含SEQ ID NO:1或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID NO:49或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的探針；以及
[0019](III)包含SEQ ID NO:55或其互補序列的第一引物，以及包含SEQ ID N0:56或其互補序列的探針；
[0020](b)使用步驟(a)的所述反應(yīng)混`合物進行所述樣品的所述核酸的PCR擴增；以及
[0021](c)檢測步驟(b)的所述擴增。
[0022]在某些實施例中，所述第二引物包含核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO:58的至少15個連續(xù)的核苷酸或包含SEQ ID N0:73。在其他的實施例中，所述第一引物包含選自SEQ ID NOs:2-15，48的序列；所述第二引物包含選自SEQ ID NOs:59-72的序列；并且所述探針包含選自SEQ ID NOs: 17-30,49-52的序列。在另外的實施例中，所述探針的3’末端直接或間接連接到所述第一引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在另外的實施例中，所述引物-探針復(fù)合物能被可檢測地標記。在附加的實施例中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含SEQ ID N0:53、54或57，或包含SEQ ID NO: 31的至少15個連續(xù)的核苷酸。在一些實施例中，所述樣品包括食物樣品或水樣品。
[0023]在進一步的例子中，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中STEC細菌的存在的方法，所述樣品包含核酸，所述方法包括
[0024](a)提供反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含用于擴增和檢測SEQ ID NO:687(Stx2A)的至少一部分的第一引物、第二引物和探針；其中所述第一引物、第二引物和探針的每個包含5’末端和3’末端；并且其中所述第一引物和探針選自:
[0025](I)包含SEQ ID N0:74或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID NO:89或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的探針；
[0026](II)包含SEQ ID NO: 120或其互補序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO: 121或122或其互補序列的探針；以及
[0027](III)包含SEQ ID NO: 125或其互補序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO: 126或其互補序列的探針；
[0028](b)使用步驟(a)的所述反應(yīng)混合物進行所述樣品的所述核酸的PCR擴增；以及
[0029](c)檢測步驟(b)的擴增。
[0030]在某些實施例中，所述第二引物包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO: 128的至少15個連續(xù)的核苷酸或包含SEQ ID NO: 143或144。在其他的實施例中，所述第一引物包含選自SEQ ID NOs:75-88的序列；所述第二引物包含選自SEQ ID NOs: 129-144的序列；并且所述探針包含選自SEQ ID NOs:90-104的序列。在附加的實施例中，所述探針的3’末端直接或間接連接到所述第一引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在另外的實施例中，所述引物-探針復(fù)合物能被可檢測地標記。在附加的實施例中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含SEQ ID N0:123、124、或127，或包含SEQ IDNO: 105的至少15個連續(xù)的核苷酸。在一些實施例中，所述樣品包括食物樣品或水樣品。[0031 ] 在另外的方面，本發(fā)明涉及包含引物-探針復(fù)合物的分離的多核苷酸，其中所述引物-探針復(fù)合物包含:
[0032](A)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含含有SEQ ID NO:1的至少15個連續(xù)的核苷酸的核酸序列，所述探針區(qū)包含SEQ ID NO: 16的至少15個連續(xù)的核苷酸；
[0033](B)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID N0:48，所述探針區(qū)包含選自SEQ IDNOs:49-52的核酸序列；
[0034](C)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 55，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO:56 ；
[0035](D)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO:74的至少15個連續(xù)的核苷酸，所述探針區(qū)包含SEQ ID NO:89的至少15個連續(xù)的核苷酸；
[0036](E)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 120，所述探針區(qū)包含選自SEQID NOs: 121-122的核酸序列；
[0037](F)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 125，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO: 126 ;以及
[0038](G)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 145的至少15個連續(xù)的核苷酸，所述探針區(qū)包含SEQ ID NO: 160的至少15個連續(xù)的核苷酸；
[0039]其中所述探針區(qū)和所述引物區(qū)各自具有5’和3’末端，其中所述探針區(qū)的所述3’末端經(jīng)由接頭部分連接到所述引物區(qū)的所述5’末端，并且其中所述引物-探針復(fù)合物還包含可檢測的標簽。
[0040]在另外的方面，本發(fā)明涉及用于樣品中STEC細菌的檢測的試劑盒和試劑片，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸。
[0041]本發(fā)明的另外的方面是檢測樣品中STEC細菌的存在的方法，所述樣品包含核酸，所述方法包括:
[0042](a)提供反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含適宜的引物對，用于擴增下列的至少一部分:
[0043]⑴所述eae基因；和[0044](ii)所述StxlA和Stx2A基因中的一個或多個；以及
[0045](b)使用步驟(a)的所述反應(yīng)混合物進行所述樣品的所述核酸的PCR擴增；以及
[0046](c)檢測步驟(b)的所述擴增。
[0047]在某些例子中，所述eae基因的一部分的擴增包括SEQ ID NO:688的至少一部分的擴增。在其他例子中，所述StxlA和Stx2A基因的一個或多個的一部分的擴增包括SEQID N0s:686和687之一或二者的至少一部分的擴增。在某些實施例中，所述反應(yīng)混合物包含適宜的引物對，用于擴增SEQ ID NOs:686-688中的所有三者的至少一部分。
[0048]在附加的實施例中，所述反應(yīng)混合物還包含適宜的引物對用于擴增編碼所述026、0111、0121、045、0103、0145、和0157表面抗原的基因的一個或多個的至少一部分。在某些例子中，此類擴增包括選自SEQ ID NOs:689-696的一個或多個核酸序列的擴增。
[0049]在某些例子中，用于擴增SEQ ID N0:686的適宜的引物對包含(A)第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID NOs: 1-15和48的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ ID N0s:58-72的核酸序列；或(B)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:55，所述第二引物包含SEQ ID N0:73。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含探針，其中:(1)其中所述第一引物選自SEQ ID NOs: 1-15，所述探針包含選自SEQ IDN0s:31-47的核酸序列；(II)其中所述第一引物包含SEQ ID NO:48，所述探針包含選自SEQ ID NOs:49-52的核酸序列；并且(III)所述第一引物包含SEQ ID N0:55，所述探針包含SEQ ID NO: 56。在進一步的例子中，所述探針的3’末端連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在進一步的例子中，所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含選自SEQ IDN0s:31-47、53-54、和 57 的核酸序列。
[0050]在某些例子中，用于擴增SEQ ID NO:687的適宜的引物對包括:(A)第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:74-88的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ ID NOs: 128-142的核酸序列;(B)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ IDNO: 120，所述第二引物包含SEQ ID NO: 143 ;或(C)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO: 125，所述第二引物包含SEQ ID NO: 144。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含探針，其中:(I)其中所述第一引物選自SEQ ID NOs:74-88，所述探針包含選自SEQID NOs:89-104的核酸序列；(II)其中所述第一引物包含SEQ ID NO: 120，所述探針包含選自SEQ ID NOs: 121-122的核酸序列；并且(III)其中所述第一引物包含SEQ ID NO: 125,所述探針包含SEQ ID NO: 126。在進一步的例子中，所述探針的3’末端連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在進一步的例子中，所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含選自 SEQ ID NOs: 105-119、123-124、和 127 的核酸序列。
[0051]在某些例子中，用于擴增SEQ ID NO:688的所述適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:145-159的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ ID NOs: 191-205的核酸序列。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含探針，其中所述探針包含選自SEQ ID NOs: 160-175的核酸序列。在進一步的例子中，所述探針的3’末端連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在進一步的例子中，所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含選自SEQ ID NOs: 176-190的核酸序列。
[0052]在某些例子中，用于擴增SEQ ID NO:689的適宜的引物對包括:(A)第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:206-220的序列，所述第二引物包含選自SEQID NOs:258-272的核酸序列；(B)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO: 251,所述第二引物包含SEQ ID N0:273 ;或(C)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ IDN0:255，所述第二引物包含SEQ ID N0:274。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含探針，其中所述探針包括:(I)其中所述第一引物選自SEQ ID NOs:206-220，所述探針包含選自SEQ ID NOs:221-235的核酸序列；(II)其中所述第一引物包含SEQ ID N0:251，所述探針包含選自SEQ ID NOs:252-253的核酸序列；以及(III)其中所述第一引物包含SEQ IDNO: 255，所述探針包含SEQ ID NO: 256。在進一步的例子中，所述探針的3’末端連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在進一步的例子中，所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含選自SEQ ID NOs: 236-250，254，和257的核酸序列。
[0053]在某些例子中，用于擴增SEQ ID NO:690的適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:275-289和324的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ ID NOs:327-341的核酸序列。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含探針，其中所述探針包括:(I)其中所述第一引物選自SEQ ID NOs:275-289，所述探針包含選自SEQID NOs:290-306的核酸序列；以及(II)其中所述第一引物包含SEQ ID N0:324，所述探針包含SEQ ID N0:325。在進一步的例子中，所述探針的3’末端連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在進一步的例子中，所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含選自SEQID NOs:307-323和326的核酸序列。 [0054]在某些例子中，用于擴增SEQ ID NO:691的適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID NOs:342-356的核酸序列，所述和第二引物包含選自SEQID NOs:393-407的核酸序列。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含探針，其中所述探針包含選自SEQ ID NOs:357-374的核酸序列。在進一步的例子中，所述探針的3’末端連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在進一步的例子中，所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含選自SEQ ID NOs:375-392的核酸序列。
[0055]在某些例子中，用于擴增SEQ ID N0:692適宜的引物對包括:(A)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:456，所述第二引物包含SEQ ID N0:480;(B)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:459，所述第二引物包含SEQ ID N0:481 ；或(C)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:462，所述第二引物包含SEQ IDN0:482。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含探針，其中所述探針包括:(1)其中所述第一引物包含SEQ ID NO:456，所述探針包含SEQ ID NO:457 ; (II)其中所述第一引物包含SEQ ID NO:459，所述探針包含SEQ ID NO:460 ;以及(III)其中所述第一引物包含SEQ IDNO:462，所述探針包含SEQ ID NO:463。在進一步的例子中，所述探針的3’末端連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在進一步的例子中，所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含選自SEQ ID NOs: 458、461和464的核酸序列。
[0056]在某些例子中，用于擴增SEQ ID NO:693的所述適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:408-423的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ ID NOs:465-479的核酸序列。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含探針，其中所述探針包含選自SEQ ID NOs:424-439的核酸序列。在進一步的例子中，所述探針的3’末端連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在進一步的例子中，所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含選自SEQ ID NOs:440-455的核酸序列。
[0057]在某些例子中，用于擴增SEQ ID NO:694的適宜的引物對包括:(A)第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:483-497和537的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ ID N0s:540-554的核酸序列；(B)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQID NO: 528，所述第二引物包含SEQ ID NO: 555 ; (C)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:531，所述第二引物包含SEQ ID NO:556 ;或(D)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:534，所述第二引物包含SEQ ID NO:557。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含探針，其中所述探針包括:(I)其中所述第一引物選自SEQ ID NOs:483-497,所述探針包含選自SEQ ID NOs:498-512的核酸序列；(II)其中所述第一引物包含SEQ IDNO:528，所述探針包含SEQ ID NO:529 ; (III)其中所述第一引物包含SEQ ID N0:531，所述探針包含SEQ ID NO:532 ; (IV)其中所述第一引物包含SEQ ID NO:534，所述探針包含SEQID NO: 535 ; (V)其中所述第一引物包含SEQ ID NO: 537，所述探針包含SEQ ID NO: 538。在進一步的例子中，所述探針的3’末端連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在進一步的例子中，所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含選自SEQ ID N0s:513-527、530、533、536、和539的核酸序列。
[0058]在某些例子中，用于擴增SEQ ID NO:695的適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID NOs:558-572的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQID NOs:603-617的核酸序列。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含探針，其中所述探針包含選自SEQ ID NOs:573-587的核酸序列。在進一步的例子中，所述探針的3’末端連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在進一步的例子中，所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含選自SEQ ID NOs:588-602的核酸序列。
[0059]在某些例子中，用于擴增SEQ ID NO:696的適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID NOs:618-633的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQID NOs:671-685的核酸序列。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含探針，其中所述探針包含選自SEQ ID NOs:634-653的核酸序列。在進一步的例子中，所述探針的3’末端連接到所述引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物。在進一步的例子中，所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含選自S EQ ID NOs:654-670的核酸序列。
[0060]在一個具體實施例中:
[0061](A)用于擴增SEQ ID NO:686的適宜的引物對包括[0062](I)第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:l_15和48的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ ID NOs:58-72的核酸序列；或者
[0063](II)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:55，所述第二引物包含SEQ ID NO:73 ；
[0064](B)用于擴增SEQ ID NO:687的適宜的引物對包括
[0065](I)第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID NOs: 74_88的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ ID NOs: 128-142的核酸序列；
[0066](II)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO: 120，所述第二引物包含SEQ ID NO: 143 ;或者
[0067](III)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO: 125，所述第二引物包含 SEQ ID NO:144 ；
[0068](C)用于擴增SEQ ID N0:688的適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:145-159的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ IDNOs: 191-205的核酸序列；
[0069](D)用于擴增SEQ ID NO:689的適宜的引物對包括
[0070](I)第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID NOs:206-220的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ ID NOs:258-272的核酸序列；
[0071](II)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:251，所述第二引物包含SEQ ID NO:273 ;或者
[0072](III)第一引物和第二引`物，所述第一引物包含SEQ ID NO:255，所述第二引物包含 SEQ ID NO:274 ；
[0073](E)用于擴增SEQ ID N0:690的適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:275-289和324的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ IDNOs:327-341的核酸序列；
[0074](F)用于擴增SEQ ID N0:691的適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:342-356的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ IDNOs:393-407的核酸序列；
[0075](G)用于擴增SEQ ID NO:692的適宜的引物對包括
[0076](I)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:456，所述第二引物包含SEQ ID NO:480 ；
[0077](II)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:459，所述第二引物包含SEQ ID NO:481 ;或者
[0078](III)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:462，所述第二引物包含 SEQ ID NO:482 ；
[0079](H)用于擴增SEQ ID N0:693的適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:408-423的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ IDNOs: 465-479的核酸序列；
[0080](I)用于擴增SEQ ID NO:694的適宜的引物對包括
[0081](I)第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:483_497和537的核酸序列，所述第一引物包含選自SEQ ID NOs:540-554的核酸序列；
[0082](II)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:528，所述第二引物包含SEQ ID NO:555 ；
[0083](III)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:531，所述第二引物包含 SEQ ID NO:556 ;或者
[0084](IV)第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO:534，所述第二引物包含SEQ ID NO:557 ；
[0085](J)用于擴增SEQ ID N0:695的適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:558-572的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ IDNOs:603-617的核酸序列；并且
[0086](K)用于擴增SEQ ID N0:696的適宜的引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含選自SEQ ID N0s:618-633的核酸序列，所述第二引物包含選自SEQ IDNOs: 671-685的核酸序列。
[0087]在附加的例子中，所述反應(yīng)混合物包含用于擴增SEQ ID NOs:686-688以及SEQ IDNOs:689-696中的一個或多個的適宜的引物對。
[0088]在具體的例子中，所述樣品包括食物樣品或水樣品。
[0089]在附加的實施例中，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1-685的核酸序列。
[0090]在其他的實施例中，本發(fā)明涉及包含引物-探針復(fù)合物的分離的多核苷酸，其中所述引物-探針復(fù)合物包含:
[0091](A)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含選自SEQ ID NOs: 1-15的核酸序列，所述探針區(qū)包含選自SEQ ID NOs:16-30的核酸序列；
[0092](B)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID N0:48，所述探針區(qū)包含選自SEQ IDNOs:49-52的核酸序列；
[0093](C)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 55，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO:56 ；
[0094](D)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含選自SEQ ID N0s:74_88的核酸序列，所述探針區(qū)包含選自SEQ ID NOs:89-104的核酸序列；
[0095](E)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 120，所述探針區(qū)包含選自SEQID NOs: 121-122的核酸序列；
[0096](F)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 125，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO:126 ；
[0097](G)引物區(qū)和探 針區(qū)，所述引物區(qū)包含選自SEQ ID NOs: 145-159的核酸序列，所述探針區(qū)包含選自SEQ ID NOs: 160-175的核酸序列；
[0098](H)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含選自SEQ ID NOs: 206-220的核酸序列，所述探針區(qū)包含選自SEQ ID NOs:221-235的核酸序列；
[0099](I)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO:251，所述探針區(qū)包含選自SEQID NOs:252-253的核酸序列；
[0100](J)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含選自SEQ ID NO:255的核酸序列，所述探針區(qū)包含選自SEQ ID NO:256的核酸序列；
[0101](K)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含選自SEQ ID NOs:275-289的核酸序列，所述探針區(qū)包含選自SEQ ID NOs:290-306的核酸序列；
[0102](L)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 324，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO:325 ；
[0103](M)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含選自SEQ ID NOs: 342-356的核酸序列，所述探針區(qū)包含選自SEQ ID NOs:357-374的核酸序列；
[0104](N)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含選自SEQ ID NOs:408-423的核酸序列，所述探針區(qū)包含選自SEQ ID NOs:424-439的核酸序列；
[0105](O)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 456，所述探針區(qū)包含SEQ IDNOs:457 ；
[0106](P)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 459，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO:460 ；
[0107](Q)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 462，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO:463 ；
[0108](R)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含選自SEQ ID NOs:483-497的核酸序列，所述探針區(qū)包含選自SEQ ID NOs:498-512的核酸序列；
[0109](S)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 528，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO:529 ；
[0110](T)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID N0:531，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO:532 ；
[0111](U)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 534，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO:535 ；
[0112](V)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQ ID NO: 537，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO:538 ；
[0113](W)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含選自SEQ ID NOs: 558-572的核酸序列，所述探針區(qū)包含選自SEQ ID NOs:573-587的核酸序列；
[0114](X)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含選自SEQ ID NOs:618-633的核酸序列，所述探針區(qū)包含選自SEQ ID NOs:634-653的核酸序列。
[0115]在某些例子中，所述探針區(qū)和引物區(qū)各自具有5’和3’末端，其中所述探針區(qū)的3’末端經(jīng)由接頭部分連接到所述引物區(qū)的5’末端。在其他例子中，所述引物-探針復(fù)合物還包含可檢測的標簽。
[0116]在另外的實施例中，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中STEC細菌的試劑盒，其包含本專利申請的分離的多核苷酸。在其他的實施例中，本發(fā)明涉及試劑片，其包含本專利申請的復(fù)制組合物。
[0117]序列說明
[0118]SEQ ID NO: 1-30是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli)StxlA基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:686的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID NOs: 1-30的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQ ID NOs:58-72的一個，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID NOs:1-15之一結(jié)合選自SEQ ID NOs: 16-30的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NOs:31-47的寡核苷酸。
[0119]SEQ ID N0:48-52是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) StxlA基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:686的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID NOs:48-52的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQ ID NOs:58-72的一個，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N0:48結(jié)合選自SEQ ID NOs:49-52的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NOs:53-54的寡核苷酸。
[0120]SEQ ID NO:55-56是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) StxlA基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:686的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:55-56的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如SEQ ID N0:73，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N0:55結(jié)合包含SEQ ID NO:56的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID N0:56探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:55引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:57。
[0121]SEQ ID NO:74-104是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) Stx2A基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:687的靶序列。可使用選自SEQ ID N0s:74-104的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQ ID NOs: 128-142的一個，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID NOs:74-88之一結(jié)合選自SEQ ID N0s:89_104的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NOs: 105-119的寡核苷酸。
[0122]SEQ ID NO: 120-122是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli)基因靶標的一部Stx2A分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:687的靶序列。可使用選自SEQ ID NOs: 120-122的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如SEQ ID N0:143，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N0:120結(jié)合選自SEQ ID NOs: 121-122的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NOs: 123-124的寡核苷酸。
[0123]SEQ ID NO: 125-126是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) Stx2A基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:687的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID NOs: 125-126的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如SEQ ID N0:144，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N0:125結(jié)合包含SEQ ID NO: 126的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID N0:126探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:125引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:127。
[0124]SEQ ID NO: 145-175是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) eae基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:688的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID NOs: 145-175的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQ ID NOs: 191-205的一個。在某些實施例中，SEQ ID NOs:145-159之一結(jié)合選自SEQ ID NOs: 160-175的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NOs: 176-190的寡核苷酸。
[0125]SEQ ID N0:206_235是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) 026表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:689的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:206-235的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQID NOs:258-272的一個。在某些實施例中，SEQ ID NOs:206-220之一結(jié)合選自SEQ IDN0s:221-235的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NOs:236-250的寡核苷酸。
[0126]SEQ ID NO: 251-253是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) 026表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:689的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:251-253的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如SEQ ID N0:273，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N`0:251結(jié)合選自SEQ ID NOs: 252-253的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:251引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:254。
[0127]SEQ ID NO: 255-256是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) 026表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:689的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0:255-256的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如SEQ ID N0:274，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N0:255結(jié)合包含SEQ ID NO:256的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID N0:256探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:255引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:257。
[0128]SEQ ID N0:275_306是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli)表面抗原基因SOlll靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:690的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:275-306的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQID NOs:327-341的一個。在某些實施例中，SEQ ID NOs:275-289之一結(jié)合選自SEQ IDNOs:290-306被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NOs:307-323的寡核苷酸。
[0129]SEQ ID NO: 324-325是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) SOlll表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID N0:690所述靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:324-325的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQ IDNOs:327-341的一個，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID NO: 324結(jié)合包含SEQ ID NO: 325的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID N0:325探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:324引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:326。
[0130]SEQ ID NO: 342-374是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) 0121表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID N0:691所述靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:342-374的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQ IDNOs:393-407的一個，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID NOs: 342-356之一結(jié)合選自SEQID N0s:357-374的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NOs:375-392的寡核苷酸。
[0131]SEQ ID N0:408-439是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) 045表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:693的靶序列?？墒褂眠x自SEQ I D N0s:408-439的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQID NOs:465-479的一個。在某些實施例中，SEQ ID NOs:408-423之一結(jié)合選自SEQ IDNOs:424-439的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NOs:440-455的寡核苷酸。
[0132]SEQ ID N0:456_457是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) 045表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:692的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:456-457的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如SEQ ID NO:480,?行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N0:456結(jié)合包含SEQ ID NO:457的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID N0:457探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:456引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:458。[0133]SEQ ID N0:459_460是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) 045表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:692的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:459-460的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如SEQ ID N0:481，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N0:459結(jié)合包含SEQ ID NO:460的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID N0:460探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:459引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:461。
[0134]SEQ ID N0:462_464是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) 045表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:692的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:464-464的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如SEQ ID N0:482，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N0:462結(jié)合包含SEQ ID NO:463的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID N0:463探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:462引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:464。
[0135]SEQ ID N0:483_512是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) 0103表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:694的靶序列。可使用選自SEQ ID N0s:483-512的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQ IDNOs:540-554的一個，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID NOs: 483-497之一結(jié)合選自SEQID N0s:498-512的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NOs:513-527的寡核苷酸。
[0136]SEQ ID NO: 528-529是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli)0103表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:694的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:528-529的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如SEQ ID N0:555，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N0:528結(jié)合包含SEQ ID NO:529的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID N0:529探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:528引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:530。
[0137]SEQ ID NO: 531-532是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli)0103表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:694的靶序列。可使用選自SEQ ID N0s:531-532的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如SEQ ID NO:556,S行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N0:5 31結(jié)合包含SEQ ID NO:532的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID N0:532探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:531引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:533。
[0138]SEQ ID NO: 534-535是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli)0103表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:694的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0:534-535的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如SEQ ID N0:557，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID N0:534結(jié)合包含SEQ ID NO:535的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID N0:535探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:534引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:536。
[0139]SEQ ID N0:537_538是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) 0103表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:694的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:537-538的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQ IDNOs:540-554的一個，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID NO: 537結(jié)合包含SEQ ID NO: 538的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID N0:538探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述SEQ ID N0:537引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并且用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并淬滅其熒光，諸如SEQ ID N0:539。
[0140]SEQ ID N0:558-587是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.coli) 0145表面抗原基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ ID NO:695的靶序列?？墒褂眠x自SEQ ID N0s:558-587的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQ IDNOs:603-617的一個，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID NOs: 558-572之一結(jié)合選自SEQID N0s:573-587的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18 -碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NOs:588-602的寡核苷酸。
[0141]SEQ ID N0:618-653是能夠用作引物或探針的核苷酸序列，用于擴增和檢測大腸桿菌(E.Co I i ) 0157原噬菌體致病因子基因靶標的一部分，諸如本文提供的如SEQ IDN0:696的靶序列。可使用選自SEQ ID NO:618-653的引物結(jié)合適宜的反向引物，諸如選自SEQ ID N0:671-685的一個，進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID NO:618-633之一結(jié)合選自SEQ ID N0:634-653的探針被用作引物。在某些其他的實施例中，所述被選探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針被可檢測地標記并用于結(jié)合分離的淬滅劑寡核苷酸，所述分離的淬滅劑寡核苷酸能夠雜交至所述探針并且淬滅其熒光，諸如選自SEQ ID NO:654-670的寡核苷酸。
[0142]SEQ ID NO:686是大腸桿菌(E.coli) StxlA基因的部分的核苷酸序列，其用于檢測樣品中StxlA基因的存在，并且最終地檢測樣品中STEC細菌的存在。用于擴增SEQ IDN0:686的適宜的引物包括SEQ ID NO: 1_30、48-52、55_56、和58-73。在某些實施例中，使用選自SEQ ID NO: 1-15的正向引物和選自SEQ ID NO:58-72的反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO: 16-30的探針和任選地選自SEQ ID NO:31-47的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在其他的實施例中，使用SEQ ID N0:48作為正向引物和選自SEQ ID N0:58_72的反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO:49-52的探針和任選地選自SEQ ID N0:53_54的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在另外的實施例中，使用SEQ ID N0:55作為正向引物和SEQ IDNO:73作為反向引物進行擴增，當使用SEQ ID NO:56作為探針和任選地SEQ ID NO:57作為淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。
[0143]SEQ ID NO:687是大腸桿菌(E.coli) Stx2A基因的部分的核苷酸序列，其用于檢測樣品中Stx2A基因的存在，并且最終地檢測樣品中STEC細菌的存在。用于擴增SEQ IDN0:687 的適宜的引物包括 SEQ ID NO:74-104、120-122、125-126 和 128-144。在某些實施例中，使用選自SEQ ID NO:74-88的正向引物和選自SEQ ID NO: 128-142的反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO:89-104的探針和任選地選自SEQ ID NO: 105-119的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在其他的實施例中，使用SEQ ID NO: 120作為正向引物和SEQ IDNO: 143作為反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO: 121-122的探針和任選地選自SEQID NO: 123-124的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在另外的實施例中，使用SEQ ID N0:125作為正向引物和SEQ ID NO: 144作為反向引物進行擴增，當使用SEQ ID N0:126作為探針和任選地SEQ ID NO: 127作為淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。
[0144]SEQ ID NO:688是大腸桿菌(E.coli) eae基因的部分的核苷酸序列，其用于檢測樣品中eae基因的存在，并且最終地檢測樣品中STEC細菌的存在。用于擴增SEQ ID NO:688的適宜的引物包括SEQ ID NO: 145-175。在某些實施例中，使用選自SEQ ID N0:145_159的正向引物和選自SEQ ID NO: 191-205的反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO: 160-175的探針和任選地選自SEQ ID NO: 176-190的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。
[0145]SEQ ID NO:689是大腸桿菌(E.coli) 026表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于檢測樣品中026表面抗原基因的存在，并且最終地檢測樣品中STEC細菌的存在。用于擴增SEQ ID N0:689 的適宜的引物包括SEQ ID NO:206_235、251-253、255_256、和258-274。在某些實施例中，使用選自SEQ ID NO:206-220的正向引物和選自SEQ ID NO:258-272的反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO: 221-235的探針和任選地選自SEQ ID NO:236-250的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在其他的實`施例中，使用SEQ ID N0:251作為正向引物和SEQ ID N0:273作為反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO:252-253的探針和任選地SEQ ID NO: 254作為淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在另外的實施例中，使用SEQ ID NO: 255作為正向引物和SEQ ID N0:274作為反向引物進行擴增，當使用SEQ ID N0:256作為探針和任選地SEQ ID NO:257作為淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。
[0146]SEQ ID NO:690是大腸桿菌(E.coli)0111表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于檢測樣品中0111表面抗原基因的存在，并且最終地檢測樣品中STEC細菌的存在。用于擴增 SEQ ID N0:690 的適宜的引物包括 SEQ ID NO:275_306、324_325、和 327-341。在某些實施例中，使用選自SEQ ID NO:275-289的正向引物和選自SEQ ID NO:327-341的反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO:290-306的探針和任選地選自SEQ ID NO:307-323的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在其他的實施例中，使用SEQ ID N0:324作為正向引物和選自SEQ ID NO:327-341的反向引物進行擴增，當使用包含SEQ ID N0:325的探針和任選地包含SEQ ID NO:326的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。
[0147]SEQ ID NO:691是大腸桿菌(E.coli)0121表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于檢測樣品中0121表面抗原基因的存在，并且最終地檢測樣品中STEC細菌的存在。用于擴增SEQ ID N0:691的適宜的引物包括SEQ ID NO:342-356和393-407。在某些實施例中，使用選自SEQ ID NO:342-356的正向引物和選自SEQ ID NO:393-407的反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO:357-374的探針和任選地選自SEQ ID NO:375-392的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。
[0148]SEQ ID NO:692是大腸桿菌(E.coli) 045表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于檢測樣品中045表面抗原基因的存在，并且最終地檢測樣品中STEC細菌的存在。用于擴增SEQ ID N0:692 的適宜的引物包括SEQ ID NO:456-457、459-460、462_463、和480-482。在某些實施例中，使用SEQ ID N0:456作為正向引物和SEQ ID N0:480作為反向引物進行擴增，當使用包含SEQ ID NO:457的探針和任選地包含SEQ ID NO:458的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在另外的實施例中，使用SEQ ID N0:459作為正向引物和SEQ ID N0:481作為反向引物進行擴增，當使用包含SEQ ID NO:460的探針和任選地包含SEQ ID N0:461的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在另外的實施例中，使用SEQ ID N0:462作為正向引物和SEQID N0:482作為反向引物進行擴增，當使用包含SEQ ID NO:463的探針和任選地包含SEQ IDNO:464的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。
[0149]SEQ ID NO:693是大腸桿菌(E.coli) 045表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于檢測樣品中045表面抗原基因的存在，并且最終地檢測樣品中STEC細菌的存在。用于擴增SEQ ID N0:692的適宜的引物包括SEQ ID NO:408-439，和465-479。在某些實施例中，使用選自SEQ ID NO:408-423的正向引物和選自SEQ ID NO:465-479的反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO:424-439的探針和任選地選自SEQ ID NO:44-455的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。
[0150]SEQ ID NO:694是大腸桿菌(E.coli)0103表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于檢測樣品中0103表面抗原基因的存在，并且最終地檢測樣品中STEC細菌的存在。用于擴增 SEQ ID N0:694 的適宜的引物包括SEQ ID NO:483_512、528-529、531-532、534_535、537-538、和540-557。在某些實施例中，使用選自SEQ ID NO:483-497的正向引物和選自SEQ ID NO:550-554的反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO:498-512的探針和任選地選自SEQ ID NO:513-527的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在其他的實施例中，使用SEQ IDN0:528作為正向引物和SEQ ID NO:555作為反向引物進行擴增，當使用SEQ ID N0:529作為探針和任選地SEQ ID NO:530作為淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在另外的實施例中，使用SEQ ID N0:531作為正向引物和SEQ ID NO:556作為反向引物進行擴增，當使用SEQ IDNO: 532作為探針和任選地SEQ ID NO: 533作為淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在附加的實施例中，使用SEQ ID NO:534作為正向引物和SEQ ID NO: 557作為反向引物進行擴增，當使用SEQ ID NO:535作為探針和任選地SEQ ID NO:536作為淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。在另外的實施例中，使用SEQ ID N0:537作為正向引物和選自SEQ ID NO:550-554的反向引物進行擴增，當使用SEQ ID NO:538作為探針和任選地SEQ ID NO:539作為淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。
[0151]SEQ ID勵:695是大腸桿菌化.(:01丨)0145表面抗原基因的部分的核苷酸序列，其用于檢測樣品中0145表面抗原 基因的存在，并且最終地檢測樣品中STEC細菌的存在。用于擴增SEQ ID N0:695的適宜的引物包括SEQ ID NO:558-587和603-617。在某些實施例中，使用選自SEQ ID NO:558-572的正向引物和選自SEQ ID N0:603_617的反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO:573-587的探針和任選地選自SEQ ID NO:588-602的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。
[0152]SEQ ID NO:696是大腸桿菌(E.coli) 0157原噬菌體致病因子基因的部分的核苷酸序列，其用于檢測樣品中0157原噬菌體致病因子基因的存在，并且最終地檢測樣品中STEC細菌的存在。用于擴增SEQ ID N0:696的適宜的引物包括SEQ ID NO:618-653和671-685。在某些實施例中，使用選自SEQ ID NO:618-633的正向引物和選自SEQ IDN0:671-685的反向引物進行擴增，當使用選自SEQ ID NO:634-653的探針和任選地選自SEQID NO:654-670的淬滅劑寡核苷酸完成檢測時。
[0153]SEQ ID Ν0:697_700包含用于擴增SV40DNA的核苷酸序列，其在一些例子中被用作陽性對照反應(yīng)。在某些例子中，使用SEQ ID Ν0:697或698作為正向引物結(jié)合SEQ IDΝ0:700作為反向引物進行擴增。在某些實施例中，SEQ ID NOs:697或698之一結(jié)合SEQ IDΝ0:699探針作為被用作引物。在某些其他的實施例中，所述SEQ ID Ν0:699探針的3’末端經(jīng)由適宜的接頭部分，諸如18-碳的隔片，連接到所述被選引物的5’末端。在附加的實施例中，所述探針由報告基因-淬滅劑對可檢測地標記，并在所述探針區(qū)的側(cè)翼具有自身互補序列，從而使得核酸分子自雜交形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，從而使得通過淬滅劑分子淬滅所述報告基因信號。
[0154]所述序列符合37C.F.R.1.1.822.821-1.825(“對含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公開內(nèi)容的專利申請的要求-序列規(guī)則”(“Requirements for Patent ApplicationsContaining Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-theSequence Rules”))，并且符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(World Intellectual PropertyOrganization) (WIPO)ST.25 標準(1998)以及 EPO 和 PCT 的序列表要求(規(guī)則 5.2 和 49.5(a_bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208節(jié)和附錄C)。核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)所用的符號和形式遵循如37C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)則。
[0155]優(yōu)選實施例具體說明
[0156] 申請人:特別將所有引用的參考文獻的完整內(nèi)容引入本公開內(nèi)容中。此外，當數(shù)量、濃度或其他數(shù)值或參數(shù)以范圍、優(yōu)選范圍或優(yōu)選上限數(shù)值和優(yōu)選下限數(shù)值的列表形式給出時，其應(yīng)理解為具體地公開由任何范圍上限或優(yōu)選數(shù)值和任何范圍下限或優(yōu)選數(shù)值的任何一對所構(gòu)成的所有范圍，而無論所述范圍是否被單獨地公開。凡在本文中給出某一數(shù)值范圍之處，該范圍都意在包括其端點，以及位于該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分數(shù)，除非另行指出。不旨在將本發(fā)明的范圍限制為限定范圍時詳述的具體值。
[0157]紅
[0158]在本公開中，使用了多個術(shù)語和縮寫。給出了如下定義。
[0159]如本文所用，術(shù)語“約”或“大約”表示在給定值或范圍的20%內(nèi)，優(yōu)選地在10%內(nèi)，還更優(yōu)選地在5%內(nèi)。
[0160]術(shù)語“包含”旨在包括由術(shù)語“基本上由…組成”和“由…組成”涵蓋的實施例。類似地，術(shù)語“基本上由…組成”旨在包括由術(shù)語“由…組成”涵蓋的實施例。
[0161]“聚合酶鏈反應(yīng)”縮寫為PCR。
[0162]術(shù)語“分離的”指如下物質(zhì)，例如核酸分子和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含或者去除了在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分。分離的多核苷酸可從它們天然存在于其中的宿主細胞純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得分離的多核苷酸。該術(shù)語也涵蓋重組多核苷酸和化學合成的多核苷酸。
[0163]術(shù)語“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“寡核苷酸”在本文中可互換使用。這些術(shù)語涵蓋核苷酸序及類似的范圍。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它們可以是單鏈或雙鏈，任選地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因組DNA、合成DNA或它們的混合物的一條或多條鏈構(gòu)成。
[0164]術(shù)語“擴增產(chǎn)物”或“擴增子”指在引物引導(dǎo)的擴增反應(yīng)期間產(chǎn)生的核酸片段。引物引導(dǎo)的擴增的典型方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，或鏈置換擴增反應(yīng)(SDA)。如果選擇了 PCR方法，所述復(fù)制組合物可包含用于核酸復(fù)制的所述組分，例如:核苷酸三磷酸、具有適當序列的兩個(或多個)引物、熱穩(wěn)定的聚合酶、緩沖劑、溶質(zhì)和蛋白質(zhì)。在美國專利 4，683，202 (1987，Mullis,等人)和美國專利 4，683，195 (1986，Mullis,等人)中提供了這些試劑和它們用于擴增核酸的詳述步驟。如果選擇LCR方法，則所述核酸復(fù)制組合物可包含，例如:熱穩(wěn)定的連接酶(例如，水生棲熱菌(Thermus aquaticus)連接酶),兩組鄰近的寡核苷酸(其中每組的一個成員與每個所述靶鏈互補)，Tris-HCl緩沖液，KCl，乙二胺四乙酸(EDTA)，NAD，二硫蘇糖醇，以及鮭精DNA。參見，例如，Tabor等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.82:1074-1078 (1985)。
[0165]術(shù)語“引物”指(合成的或天然存在的)寡核苷酸，當被置于其中通過聚合酶催化互補鏈合成的條件下時，它能夠作為沿互補鏈進行核酸合成或復(fù)制的起始點。引物還能包含可檢測的標簽，例如5’末端標簽。在某些實施例中，本發(fā)明的引物為長度8-60個的核酸。在其他的實施例中，引物為長度10-50，14-40，或20-30個的核酸。在特定實施例中，引物為長度至少約 8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，49或60個的核苷酸。
[0166]術(shù)語“探針”是指(合成的或天然存在的)寡核苷酸，其與所關(guān)注的多核苷酸互補(但不一定完全互補)并且通過與所關(guān)注的`多核苷酸的至少一條鏈雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)。探針或引物-探針復(fù)合物還可包含可檢測的標簽。在某些實施例中，本發(fā)明的探針為長度8-60個的核酸。在其他的實施例中，探針為長度10-50，14-40，或20-30個的核酸。在特定實施例中，探針為長度至少約 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，49 或 60 個的核苷酸。
[0167]探針可以是一個獨立的實體或復(fù)合或換句話講連接到引物，諸如其中探針經(jīng)由其3’末端連接到引物的5’末端。此類連接可以為直接的或非直接的，諸如當所述連接通過接頭完成時，其可以為核苷酸或非核苷酸接頭并且其可以為非擴增的接頭，諸如六乙二醇(HEG)或18-碳接頭。在這種情況下，這將被命名為“引物-探針復(fù)合物”。此類引物-探針復(fù)合物的一個例子可見于以引用的方式并入本文的美國專利6，326，145，其被常稱為“蝎子探針”或“蝎子引物”。
[0168]如本文所用，術(shù)語“標簽”和“可檢測的標簽”是指能夠檢測包括但不限于放射性同位素、熒光劑、化學發(fā)光劑、酶、酶底物、酶的輔助因子、酶抑制子、發(fā)色團、染料、金屬離子、金屬溶膠、半導(dǎo)體納米晶體、配基(例如，生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或半抗原)等的分子?？蓹z測的標簽也可包括報告基因和淬滅劑的組合。
[0169]術(shù)語“報告基因”是指物質(zhì)或其一部分，其能夠表現(xiàn)出可檢測的信號，其信號能被淬滅劑抑制。所述報告基因的可檢測的信號為例如在可檢測范圍內(nèi)的熒光。術(shù)語“淬滅劑”是指物質(zhì)或其一部分，其能夠抑制、降低、抑制等由所述報告基因產(chǎn)生的可檢測的信號。
[0170]如本文所用，術(shù)語“淬滅”和“熒光能量傳遞”是指如下過程，即，當報告基因和淬滅劑密切接近時，并且所述報告基因被能量源激發(fā)，所述激發(fā)態(tài)的能量的主要部分非輻射性地轉(zhuǎn)移至所述淬滅劑，其中它要么非輻射性地耗散或者以不同于所述報告基因的發(fā)射波長發(fā)身寸。
[0171]優(yōu)選地，所述報告基因可選自用適宜的連接基團修飾的熒光有機染料，以連接至所述寡核苷酸，諸如連接至所述末端3’碳或末端5’碳。所述淬滅劑也可選自有機染料，取決于本發(fā)明的實施例，所述有機染料可以為熒光的，也可以不是熒光的。一般來講，如果所述淬滅劑是熒光的或只是通過非輻射衰減從所述報告基因釋放被轉(zhuǎn)移的能量，所述淬滅劑的吸收帶會至少基本上覆蓋所述報告基因的熒光射線帶以優(yōu)化淬滅。非熒光淬滅劑或暗淬滅劑通常通過從被激發(fā)的報告基因吸收能量起作用，但不放射性地釋放所述能量。
[0172]對于特定探針的適宜的報告基因-淬滅劑對的選擇可根據(jù)已知技術(shù)進行。在例如 Berlman 的 Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,第二版，Academic Press, New York, 1971中列出并詳述了可選擇的來自示例性報告基因-淬滅劑對的熒光和暗淬滅劑以及它們相關(guān)的光學性能，其內(nèi)容以引用的方式并入本文。在例如 Haugland 的 Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, MolecularProbes ofEugene, Oreg.，1992中可找到經(jīng)由常見的反應(yīng)基團(能添加至本發(fā)明的寡核苷酸)的共價連接修飾報告基因和淬滅劑的例子，其內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0173]優(yōu)選的報告基因-淬滅劑對可選自咕噸類染料，包括熒光素和羅丹明染料。這些化合物的多個適宜形式可商購獲得，所述化合物苯基上具有取代基，其可被用作結(jié)合位點或作為連接至寡核苷酸的結(jié)合官能團。另一個用作報告基因的優(yōu)選的熒光化合物基團為萘胺，其在α-或β-位點具有氨基。包含在此類萘胺化合物中的有1-二甲基氨萘基-5磺酸、1-苯氨基-8-萘磺酸和2-對甲苯胺基-6-萘磺酸。其他染料包括3-苯基-7-香豆素
異氰酸酯；吖啶諸如9-異硫氰酸酯吖啶；Ν-(P-(2-苯并鳴唑基)苯基)馬來酰亞胺；苯并喝二唑；芪類；芘等等。
[0174]最優(yōu)選地，所述報告基因和淬滅劑選自熒光素和羅丹明染料。連接至寡核苷酸的這些染料和適當?shù)倪B接方法為本領(lǐng)域所熟知。
[0175]淬滅劑的適宜的例子可選自6-羧基-四甲基-羅丹明、4-(4- 二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABYL)、四甲基羅丹明(TAMRA)、BHQ-0?、BHQ-l?、BHQ-2?、以及 BHQ-3?，其中每個購自 Biosearch Technologies, Inc.0f Novato, Calif.，QSY-7?、QSY-9?、QSY-21? 和QSY-35?，其中每個購自 Molecular Probes, Inc.等。
[0176]報告基因的適宜的例子可選自染料諸如SYBR綠、5-羧基熒光素(5-FAM?購自Applied Biosystems of Foster City, Calif.)、6_ 駿基焚光素(6-FAM)，四氣 _6_ 駿基焚光素(TET)、2，7- 二甲氧基-4 ，5- 二氣-6-駿基焚光素、六氣-6-駿基焚光素(HEX)、6_駿基-2，，4，7，7，-四氯熒光素(6-TET? 購自 Applied Biosystems)、羧基-X-羅丹明(R0X)、6-羧基 _4’ , 5’ - 二氯 _2’ , 7’ - 二甲氧基突光素(6-JOE? 購自 Applied Biosystems)、VIC?染料產(chǎn)品(購自 Molecular Probes, Inc.)、NED? 染料產(chǎn)品(購自 Applied Biosystems)等。
[0177]包含報告基因和淬滅劑的探針的一個例子是處于單分子或雙分子構(gòu)象的蝎子探針。在單分子蝎子中，所述引物-探針復(fù)合物的探針部分側(cè)翼為自身互補區(qū)，當所述探針從其靶DNA解綁時所述自身互補區(qū)使得所述探針形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。另外，在單分子蝎子(探針)中，報告基因通常連接在或靠近所述自身互補區(qū)的一個，諸如在所述蝎子探針的5’末端處，而淬滅劑連接在或靠近另一個所述自身互補區(qū)，諸如緊接所述非擴增接頭的5’，使得當所述探針處于其莖-環(huán)構(gòu)象時所述淬滅劑足夠靠近所述報告基因以導(dǎo)致淬滅。在雙分子蝎子(探針)中，通常不采用自身互補側(cè)翼區(qū)，而是采用分離的“阻斷寡核苷酸”或“淬滅寡核苷酸”結(jié)合所述蝎子探針。當所述探針從其靶DNA解綁時，這個阻斷寡核苷酸能雜交至所述蝎子探針的探針區(qū)。另外，在雙分子蝎子(探針)中，所述報告基因通常連接到所述蝎子探針的探針區(qū)，諸如所述蝎子探針的5’末端，而所述淬滅劑連接至所述阻斷寡核苷酸，諸如所述阻斷寡核苷酸的3’末端，使得當所述探針從其靶DNA解綁并且相反雜交至所述阻斷寡核苷酸時，所述淬滅劑足夠接近所述報告基因以導(dǎo)致淬滅。
[0178]包含報告基因和淬滅劑的探針的另一個例子是在5’-核酸外切酶測定中使用的探針，諸如Taqman?實時聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)。在此上下文中，所述寡核苷酸探針鄰近5’端其將具有足夠數(shù)量的磷酸二酯鍵使得產(chǎn)生的5’至3’核酸酶活性能高效地降解所述綁定探針以分離所述報告基因和淬滅劑。包含報告基因和淬滅劑的探針的另一個例子是Molecular Beacon型探針，其包含探針區(qū)，側(cè)翼具有自身互補區(qū)，所述自身互補區(qū)使得所述探針從所述探針的靶序列解綁時形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。此類探針通常具有連接至或靠近一側(cè)末端的報告基因和連接或靠近另一側(cè)末端的淬滅劑，使得當所述探針處于解綁狀態(tài)并且從而形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)時，所述淬滅劑足夠接近所述報告基因以導(dǎo)致淬滅。
[0179]術(shù)語“復(fù)制抑制部分”是指任何連接至寡核苷酸的3’末端羥基的原子、分子或化學基團，其將阻止核酸鏈復(fù)制的鏈延伸的引發(fā)。例子包括但不限于:3’_脫氧核苷酸(例如，蟲草素)，雙脫氧核苷酸，磷酸酯，配體(例如，生物素和二硝基苯酚)，報告基因分子(例如，熒光素和羅丹明)，碳鏈(例如，丙醇)`，錯配的核苷酸或多核苷酸，或肽核酸單位。術(shù)語“非參與”是指對于核酸分子的擴增反應(yīng)缺乏探針或引物的參與。具體地非參與探針或引物是將不作為底物或被DNA或RNA聚合酶延伸的探針或引物?！胺菂⑴c探針”本質(zhì)上不能通過聚合酶延伸鏈。它可以有或沒有復(fù)制抑制部分。
[0180]當所述核酸分子的單鏈形式能夠在合適的溫度和溶液離子濃度條件下對其他核酸分子退火時，核酸分子對另一個核酸分子如cDNA、基因組DNA、或RNA來說是“可雜交的”。雜交和洗滌條件為人們所熟知，示例參見例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch, E.F.和Maniatis, T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory: Co Id Spring Harbor, NY( 1989),尤其是在該文獻第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)中進行了例示。溫度和離子強度條件確定雜交的“嚴格性”。對于同源核酸初步篩選，低嚴格性雜交條件對應(yīng)于Tm為55 °C，可使用例如5XSSC，0.1%SDS，0.25%牛奶，并且無甲酰胺；或30%甲酰胺，5XSSC，0.5%SDS。中度嚴格性雜交條件對應(yīng)于更高的Tm，例如,40%甲酰胺,和5X或6XSSC。雜交需要兩種核酸含有互補序列,但取決于雜交的嚴格性，堿基之間可能會發(fā)生錯配。用于使核酸雜交的合適的嚴格性取決于核酸的長度和互補的程度，它們?yōu)楸绢I(lǐng)域熟知的變量。兩條核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的雜交體的Tm值就越大。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對應(yīng)較高的Tm)按以下順序依次降低:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。對于長度大于100個核苷酸的雜交體，已經(jīng)獲得了計算Tm的方程式(參見Sambrook等人，同上,9.50-9.51)。對于較短核酸(即寡核苷酸)的雜交，錯配的位置變得更重要，而且寡核苷酸的長度決定了其特異性(參見Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一個優(yōu)選的實施例中，可雜交核酸的長度為至少約10個核苷酸。更優(yōu)選地，可雜交核酸的最小長度為至少約11個核苷酸，至少約12個核苷酸，至少約13個核苷酸，至少約14個核苷酸，至少約15個核苷酸，至少約16個核苷酸，至少約17個核苷酸，至少約18個核苷酸，至少約19個核苷酸，至少約20個核苷酸，至少約21個核苷酸，至少約22個核苷酸，至少約23個核苷酸，至少約24個核苷酸，至少約25個核苷酸，至少約26個核苷酸，至少約27個核苷酸，至少約28個核苷酸，至少約29個核苷酸，或者，最優(yōu)選地，至少30個核苷酸。此外，技術(shù)人員將認識到，必要時可根據(jù)諸如探針長度之類的因素來調(diào)節(jié)溫度和洗滌溶液的鹽濃度。
[0181]本文所用的標準重組DNA和分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，并且描述于例如，Sambrook 等人(supra)；以及 Ausubel, F.M.等人，CurrentProtocoIs in MolecularBiology 中，Greene Publishing Assoc.和 Wiley-1nterscience 出版(1987)。
[0182]寡核苷酸
[0183]已開發(fā)出通過檢測選自StxlA, Stx2A, eae, 026，0111，0121，045，0103，0145，和0157的一個或多個基因靶標來檢測STEC細菌的方法。在某些實施例中，所述方法涉及檢測StxlA 和 Stx2A 之一或二者，以及檢測 eae,以及，任選地 026，0111，0121，045，0103，0145，和0157中的一個或多個。在另外的實施例中，所述方法涉及檢測SEQ ID NO:686-688中的一個或多個。在某些實施例中，所述方法涉及檢測SEQ ID NO:686-687中的一個或多個，以及檢測SEQ ID NO: 688， 以及任選地SEQ ID NO: 689-696中的一個或多個。已開發(fā)出用于檢測此類核苷酸序列和STEC細菌的后續(xù)檢測和鑒定的寡核苷酸，包括正向和反向引物、探針和淬滅劑寡核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸可用做聚合酶鏈反應(yīng)擴增的引物。表1中示出了示例性的引物對和它們對應(yīng)的靶標、阻斷寡核苷酸和探針。
[0184]表1-靶序列和與其相關(guān)的引物、探針和淬滅劑
[0185]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測樣品中STEC細菌的存在的方法，所述樣品包含核酸，所述方法包括: (a)提供反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含用于擴增和檢測SEQID N0:688的至少一部分的第一引物、第二引物和探針；其中所述第一引物、第二引物和探針的每個包含5’末端和3’末端；其中所述第一引物包含SEQ ID NO: 145或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸；并且其中所述探針包含SEQ ID NO: 160或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸； (b)使用步驟(a)的所述反應(yīng)混合物進行所述樣品的所述核酸的PCR擴增；以及 (c)檢測步驟(b)的所述擴增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二引物包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO: 191或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第一引物包含選自SEQID NO:146-159的序列，所述第二引物包含選自SEQ ID NO: 192-205的序列，并且所述探針包含選自SEQ IDNO: 161-175 的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述探針的3’末端直接或間接連接到所述第一引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物，并且其中所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含SEQ ID NO: 176的至少15個連續(xù)的核苷酸。
6.用于檢測樣品中STEC細菌的存在的方法，所述樣品包含核酸，所述方法包括: (a)提供反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含用于擴增和檢測SEQID NO:686的至少一部分的第一引物、第二引物和探針；其中所述第一引物、第二引物和探針的每個包含5’末端和3’末端；并且其中所述第一引物和探針選自: (I)包含SEQID NO:1或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID NO: 16或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的探針； (II)包含SEQID NO:1或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID NO: 49或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的探針；以及 (III)包含SEQID NO:55或其互補序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO:56或其互補序列的探針； (b)使用步驟(a)的所述反應(yīng)混合物進行所述樣品的所述核酸的PCR擴增；以及 (c)檢測步驟(b)的所述擴增。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第二引物包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:58的至少15個連續(xù)的核苷酸或包含SEQ IDNO:73?
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第一引物包含選自SEQID N0:2-15，48的序列；所述第二引物包含選自SEQ ID NO:59-72的序列；并且所述探針包含選自SEQ IDNO: 17-30，49-52 的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項所述的方法，其中所述探針的3’末端直接或間接連接到所述第一引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物，并且其中所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含SEQ ID N0:53、54、或57，或包含SEQ ID NO: 31的至少15個連續(xù)的核苷酸。
11.用于檢測樣品中STEC細菌的存在的方法，所述樣品包含核酸，所述方法包括: (a)提供反應(yīng)混合物，所述應(yīng)混合物包含用于擴增和檢測SEQID N0:687的至少一部分的第一引物、第二引物和探針；其中所述第一引物、第二引物和探針的每個包含5’末端和3’末端；并且其中所述第一引物和探針選自: (I)包含SEQID N0:74或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的第一引物，以及包含SEQ ID N0:89或其互補序列的至少15個連續(xù)的核苷酸的探針； (II)包含SEQID NO: 120或其互補序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO: 121或122或其互補序列的探針；以及 (III)包含SEQID NO: 125或其互補序列的第一引物，以及包含SEQ ID NO: 126或其互補序列的探針； (b)使用步 驟(a)的所述反應(yīng)混合物進行所述樣品的所述核酸的PCR擴增；以及 (c)檢測步驟(b)的所述擴增。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述第二引物包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO: 128的至少15個連續(xù)的核苷酸或包含SEQ ID NO: 143或144。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述第一引物包含選自SEQID NO:75_88的序列；所述第二引物包含選自SEQ ID NO: 129-144的序列；并且所述探針包含選自SEQ IDNO:90-104 的序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項所述的方法，其中所述探針的3’末端直接或間接連接到所述第一引物的5’末端，形成引物-探針復(fù)合物，并且其中所述引物-探針復(fù)合物被可檢測地標記。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包含淬滅劑寡核苷酸，所述淬滅劑寡核苷酸包含SEQ ID NO: 123、124、或127，或包含SEQ ID NO: 105的至少15個連續(xù)的核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求1、6或11所述的方法，其中所述樣品包括食物樣品或水樣品。
17.包含引物-探針復(fù)合物的分離的多核苷酸，其中所述引物-探針復(fù)合物包含: (A)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含含有SEQID NO:1的至少15個連續(xù)的核苷酸的核酸序列，所述探針區(qū)包含SEQ ID NO: 16的至少15個連續(xù)的核苷酸； (B)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQID N0:48，所述探針區(qū)包含選自SEQ IDNO:49-52的核酸序列； (C)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQID NO:55，所述探針區(qū)包含SEQ ID NO:56 ； (D)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQID NO:74的至少15個連續(xù)的核苷酸，所述探針區(qū)包含SEQ ID NO:89的至少15個連續(xù)的核苷酸； (E)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQID NO: 120，所述探針區(qū)包含選自SEQ IDNO: 121-122的核酸序列； (F)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQID NO:125，所述探針區(qū)包含SEQ IDNO: 126 ;以及 (G)引物區(qū)和探針區(qū)，所述引物區(qū)包含SEQID NO: 145的至少15個連續(xù)的核苷酸，所述探針區(qū)包含SEQ ID NO: 160的至少15個連續(xù)的核苷酸；其中所述探針區(qū)和所述引物區(qū)各自具有5’和3’末端，其中所述探針區(qū)的所述3’末端經(jīng)由接頭部分連接到所述引物區(qū)的所述5’末端，并且其中所述引物-探針復(fù)合物還包含可檢測的標簽。
18.用于檢測樣品中STEC細菌的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求17所述的分離的多核苷酸。
19.試劑片，包含根 據(jù)權(quán)利要求18所述的復(fù)制組合物。
【文檔編號】C12Q1/68GK103890192SQ201280047286
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月28日
【發(fā)明者】S.瓦基, D.R.德馬科, M.A.詹森 申請人:納幕爾杜邦公司