組織和器官的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供重構(gòu)有成熟功能的組織及器官的手段。組織或器官的制作方法，其特征在于將器官細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞及未分化間葉系細(xì)胞共培養(yǎng)，制作器官芽，將其移植進(jìn)非人動(dòng)物，其后，從非人動(dòng)物取出移植的器官芽來(lái)源的組織或器官。
【專利說(shuō)明】組織和器官的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從人工多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)等的未分化細(xì)胞制作器官芽、組織、和器官的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年，利用具有向各種各樣的功能細(xì)胞分化的能力的iPS細(xì)胞等的多能性干細(xì)胞，通過(guò)對(duì)創(chuàng)造性新藥篩選或再生醫(yī)療有益的人功能細(xì)胞的分化誘導(dǎo)來(lái)開(kāi)展研發(fā)的方法引人關(guān)注。至今進(jìn)行著通過(guò)向多能性干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)添加各種各樣的誘導(dǎo)因子等，分化誘導(dǎo)各種功能細(xì)胞的多種嘗試(M.Schuldiner，et al.PNAS，97 (21)，11307-11312 (2000)，K.Si_Taiyeb，et al.Hepatology, 51 (1):297-305 (2010))。但是，在以往的不伴隨三維組織結(jié)構(gòu)的重構(gòu)的分化誘導(dǎo)法中，存在難以誘導(dǎo)功能細(xì)胞的終末分化，分化誘導(dǎo)的效率低，再現(xiàn)性也低這樣的大問(wèn)題。
[0003]另一方面，對(duì)于重度的器官功能衰竭，在臨床上進(jìn)行器官移植或人工器官置換治療。但是，器官移植存在排斥反應(yīng)或絕對(duì)的供體不足，人工器官僅可短期間代替功能的一部分等(特開(kāi)平9-56814號(hào)公報(bào)、特開(kāi)2004-166717號(hào)公報(bào))，根本性的問(wèn)題還是留下來(lái)沒(méi)有解決。對(duì)于人組織的人為的制造而言，雖然考查了使用將終末分化的細(xì)胞下雹接種到載體(支架材料)的方法等，但對(duì)于肝臟等有復(fù)雜的高級(jí)功能的器官而言，現(xiàn)狀是尚不存在已經(jīng)明確建立的方法(非專利文獻(xiàn)I)。即，現(xiàn)狀是尚未實(shí)現(xiàn)明確建立用由在成體組織見(jiàn)到的多個(gè)細(xì)胞譜系構(gòu)成的有秩序的立體結(jié)構(gòu)的人組織一器官的重構(gòu)法。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005]專利文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)1:特開(kāi)平9-56814號(hào)公報(bào)
[0007]專利文獻(xiàn)2:特開(kāi)2004-166717號(hào)公報(bào)
[0008]非專利文獻(xiàn)
[0009]非專利文獻(xiàn)l:Uygun，B.E.，et al.Nat Med, 16 (7)，814-820 (2010)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]發(fā)明要解決的技術(shù)課題
[0011]以往、使用多能性干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)法是，通過(guò)組合添加液性因子的或基因?qū)氲雀鞣N各樣的分化因子來(lái)試圖誘導(dǎo)細(xì)胞分化。但是，這些以往的方法不僅無(wú)法誘導(dǎo)終末分化的功能細(xì)胞，也未充分實(shí)現(xiàn)朝向其前體集團(tuán)的組織干細(xì)胞的初期分化誘導(dǎo)。
[0012]另一方面，構(gòu)成組織或器官的細(xì)胞不僅只有`功能細(xì)胞，還存在血管系細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞種類，再者，它們依靠取得有秩序的空間配置，通過(guò)發(fā)生協(xié)調(diào)性的相互作用而形成組織結(jié)構(gòu)。但是，現(xiàn)狀是，作為人組織一器官的重構(gòu)技術(shù)只存在使用支架材料等的載體的方法，存在著接種的功能細(xì)胞的植入率極其低，長(zhǎng)期培養(yǎng)困難，重構(gòu)的組織一器官的功能顯著未成熟的問(wèn)題。[0013]本發(fā)明旨在解決以上的問(wèn)題，以提供重構(gòu)有成熟功能的組織及器官的手段作為目的。
[0014]解決課題的技術(shù)方案
[0015]為了解決這些問(wèn)題，發(fā)明人認(rèn)為精致地再現(xiàn)化器官發(fā)生過(guò)程，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞分化和形態(tài)形成是必須的。即，開(kāi)發(fā)出用于使用多種細(xì)胞，將不同的細(xì)胞譜系適宜地在時(shí)間空間內(nèi)再構(gòu)建成配置為3維組織結(jié)構(gòu)體的新技術(shù)是極其重要的。本發(fā)明試著通過(guò)器官生長(zhǎng)中產(chǎn)生的由多種細(xì)胞的細(xì)胞間相互作用的再現(xiàn)化的方法，開(kāi)發(fā)3維的組織一器官的重構(gòu)技術(shù)。
[0016]在生理性的器官生長(zhǎng)過(guò)程中，通過(guò)器官細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞及未分化之間葉系細(xì)胞具有密切的細(xì)胞間相互作用而進(jìn)行自律性的組織結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和伴隨細(xì)胞分化的器官形成。
[0017]在本發(fā)明中旨在通過(guò)人為地再現(xiàn)這樣的器官發(fā)生的早期過(guò)程，進(jìn)行經(jīng)由多種細(xì)胞譜系的相互作用的初期分化誘導(dǎo)，誘導(dǎo)完成初期分化的器官細(xì)胞的組織形成能力，在試管內(nèi)人為地制作成為組織一器官的基原的器官芽(organ bud)。再者，將在培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)的器官芽移植到活體內(nèi)而開(kāi)始血液流通，進(jìn)行由終末分化的功能細(xì)胞和血管系統(tǒng)組成的組織一器官的制作。
[0018]具體而言，將由iPS細(xì)胞等的多能性干細(xì)胞得到的最適分化階段的器官細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞及間葉系細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。將這3種不同的細(xì)胞成分以最適的混合比率進(jìn)行培養(yǎng)，在被細(xì)胞外基質(zhì)成分支持的特殊的環(huán)境下，進(jìn)行含特定的營(yíng)養(yǎng)因子一液性因子的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的初步短期間培養(yǎng)，從而使在試管內(nèi)誘導(dǎo)有微小血管結(jié)構(gòu)的立體的器官芽變得可能。再者，通過(guò)將在培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)的器官芽移植到活體內(nèi)，通過(guò)促進(jìn)血管化而開(kāi)始血液流通，從而使制作有與成體組織同等的有高度秩序的組織結(jié)構(gòu)的組織一器官變得可能。認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞中任何一方或兩方也可用由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的因子，由間葉系細(xì)胞分泌的因子，由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞這二者存在而分泌的因子等的物質(zhì)代替?！?br> [0019]關(guān)注于這樣的多種細(xì)胞的細(xì)胞間相互作用，嘗試組織一器官的3維的重構(gòu)的方法在過(guò)去是不存在的，被認(rèn)為是新穎性極高的方法。
[0020]本發(fā)明的要點(diǎn)如下。
[0021](I)器官芽的制作方法，其包括將器官細(xì)胞與選自下述至少I種細(xì)胞及/或因子一同培養(yǎng)，所述的細(xì)胞及/或因子是:血管內(nèi)皮細(xì)胞、間葉系細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的因子；由間葉系細(xì)胞分泌的因子；由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞這二者存在而分泌的因子。
[0022](2) (I)所述的器官芽的制作方法，其中器官細(xì)胞是分化的細(xì)胞。
[0023](3) (I)所述的器官芽的制作方法，其中器官細(xì)胞是未分化的細(xì)胞。
[0024](4) (I)~(3)中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中器官細(xì)胞是:內(nèi)胚葉性器官的細(xì)胞或可能分化為內(nèi)胚葉性器官的細(xì)胞的細(xì)胞、中胚葉性器官的細(xì)胞或可能分化為中胚葉性器官的細(xì)胞的細(xì)胞、或者外胚葉性器官的細(xì)胞或可能分化為外胚葉性器官的細(xì)胞的細(xì)胞。
[0025](5) (4)所述的器官芽的制作方法，其中器官細(xì)胞是內(nèi)胚葉性器官的細(xì)胞或可能分化為內(nèi)胚葉性器官的細(xì)胞的細(xì)胞。[0026](6) (5)所述的器官芽的制作方法，其中內(nèi)胚葉性器官是肝臟或胰腺。
[0027](7) (I)~(6)中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中器官細(xì)胞是人工多能性干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞。
[0028](8) (7)所述的器官芽的制作方法，其中人工多能性干細(xì)胞是人來(lái)源。
[0029](9) (I)~(8)中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其與選自由血管內(nèi)皮細(xì)胞、間葉系細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的因子，由間葉系細(xì)胞分泌的因子，由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞這二者存在而分泌的因子的至少I種細(xì)胞及/或因子一同將器官細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0030](10) (I)~(9)中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其與選自由血管內(nèi)皮細(xì)胞、間葉系細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的因子，由間葉系細(xì)胞分泌的因子，由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞這二者存在而分泌的因子的至少I種細(xì)胞及/或因子一同將器官細(xì)胞接種于凝膠上進(jìn)行培養(yǎng)。
[0031](11) (I)~(10)中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞是分化的細(xì)胞。
[0032](12) (I)~(10)中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞是未分化的細(xì)胞。
[0033](13) (I)~(12)中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中間葉系細(xì)胞是分化的細(xì)胞。
[0034](14) (I)~(12)中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中間葉系細(xì)胞是未分化的細(xì)胞。
·[0035](15)組織或器官的制作方法，其包括:將由(I)~(14)中任一項(xiàng)所述的方法制作的器官芽移植到非人動(dòng)物，分化為組織或器官。
[0036](16)器官芽的移植方法，其包括:將由(I)~(14)中任一項(xiàng)所述的方法制作的器官芽移植進(jìn)人或非人動(dòng)物。
[0037](17) (16)所述的器官芽的移植方法，其中器官芽的移植部位選自:顱內(nèi)、腸系膜、肝臟、脾臟、腎臟、腎被膜下、門靜脈上。
[0038](18)組織或器官的再生或功能恢復(fù)方法，其包括:將由(I)~(14)中任一項(xiàng)所述的方法制作的器官芽移植到人或非人動(dòng)物，使之分化為組織或器官。
[0039](19)非人嵌合體動(dòng)物的制作方法，其包括:將由(I)~(14)中任一項(xiàng)所述的方法制作的器官芽移植到非人動(dòng)物，使之分化為組織或器官。
[0040](20)評(píng)價(jià)藥劑的方法，其中使用選自由(I)~(14)中任一項(xiàng)所述的方法制作的器官芽、由(15)所述的方法制作的組織及器官、以及由(19)所述的方法制作的非人嵌合體動(dòng)物的至少一種。
[0041]【發(fā)明效果】
[0042]以往、從多能性干細(xì)胞通過(guò)分化誘導(dǎo)得到的功能細(xì)胞，與構(gòu)成活體組織的功能細(xì)胞相比，止于未成熟的分化階段。這是因?yàn)?，在以往的分化誘導(dǎo)法中，不誘導(dǎo)功能細(xì)胞的終末分化。由本發(fā)明，期待基于立體的的組織重構(gòu)的人功能細(xì)胞的終末分化的誘導(dǎo)法的確立(例如，對(duì)血管結(jié)構(gòu)的細(xì)胞極性的再構(gòu)成等)，從而作為人功能細(xì)胞的制造技術(shù)價(jià)值高。
[0043]另外，在以往的多能性干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)法中，完全無(wú)法得到組織干細(xì)胞。由本發(fā)明，只要實(shí)現(xiàn)從iPS細(xì)胞制造組織干細(xì)胞，本發(fā)明人通過(guò)聯(lián)用過(guò)去開(kāi)發(fā)的人肝干細(xì)胞操作技術(shù)(國(guó)際公開(kāi)編號(hào):W0/2009/139419)，可期待對(duì)于人肝細(xì)胞的大量制造有用的細(xì)胞操作技術(shù)。
[0044]再者，在本發(fā)明中，通過(guò)人為地再現(xiàn)器官發(fā)生中發(fā)生的多種細(xì)胞間相互作用來(lái)重構(gòu)有血管系統(tǒng)的立體的人組織結(jié)構(gòu)體是可能的。從而，期待成為以往的技術(shù)完全無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，用于制作有血管系統(tǒng)適宜地配置的血流的人組織一器官的平臺(tái)技術(shù)。
[0045]本說(shuō)明書(shū)包含作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本國(guó)專利申請(qǐng)、特愿2011-210157的說(shuō)明書(shū)及/或附圖中記載的內(nèi)容。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0046]圖1:顯示人iPS細(xì)胞來(lái)源的肝臟內(nèi)胚葉細(xì)胞的自律的組織化的圖。左下圖顯示人肝臟內(nèi)胚葉細(xì)胞。左上圖顯示由肝臟內(nèi)胚葉細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及未分化間葉系細(xì)胞的三者的共培養(yǎng)形成的三維結(jié)構(gòu)體(肝芽)(培養(yǎng)開(kāi)始4天后)。右上圖是上述三維結(jié)構(gòu)體的熒光顯微鏡照片。血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)被EGFP標(biāo)記，未分化間葉系細(xì)胞(hMSC)被KO標(biāo)記。iPS細(xì)胞未被標(biāo)記。
[0047]圖2:顯示構(gòu)成器官芽的細(xì)胞等的標(biāo)志物蛋白質(zhì)的表達(dá)量的圖。圖中的“H印.End.HUVEC MSC”表示構(gòu)成器官芽的細(xì)胞，“undiff iPS”及“ iPS”表示iPS細(xì)胞，“Def End”表示由激活素誘導(dǎo)的內(nèi)胚葉系細(xì)胞，“Hep End”表示由BMP4及FGF2誘導(dǎo)的肝臟內(nèi)胚葉細(xì)胞?！癐H-樣”表示 K.S1-Taiyeb，et al.Hepatology, 51 (I):297-305 (2010)所述的不成熟的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，“MH-樣”表示 K.Si_Taiyeb，et al.Hepatology, 51 (1):297-305 (2010)所述的成熟的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。
[0048]圖3:顯示構(gòu)成器官芽的細(xì)胞等的標(biāo)志物蛋白質(zhì)的表達(dá)量的圖。圖中的“H印.End.HUVEC MSC”表示構(gòu)成器官芽的細(xì)胞，“iPS”表示iPS細(xì)胞，“Def End”表示由激活素誘導(dǎo)的內(nèi)胚葉系細(xì)胞，“H印End”表示由BMP4及FGF2誘導(dǎo)的肝臟內(nèi)胚葉細(xì)胞?！?IH-樣”表示K.S1-Taiyeb, et al.Hepatology, 5`1 (1):297-305 (2010)所述的不成熟的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，“MH-樣”表示 K.S1-Taiyeb，et al.Hepatology, 51 (I):297-305 (2010)所述的成熟的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。
[0049]圖4:顯示向免疫缺陷小鼠活體內(nèi)移植的肝芽的狀態(tài)的圖。iPS細(xì)胞被GFP標(biāo)記，未分化內(nèi)皮細(xì)胞被KO標(biāo)記。
[0050]圖5:組織學(xué)解析移植2周后的肝芽的圖。
[0051]圖6:顯示胰腺β細(xì)胞的自立的組織化的圖。左圖顯示共培養(yǎng)的胰腺β細(xì)胞，右圖顯示單獨(dú)培養(yǎng)的胰腺β細(xì)胞。
[0052]圖7:顯示胰腺β細(xì)胞的集塊及血管樣管腔結(jié)構(gòu)的圖。
[0053]圖8:顯示向移植的細(xì)胞塊的血液回流的圖。
[0054]圖9:顯示胰腺β細(xì)胞的球形形成過(guò)程的圖。血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)被GFP標(biāo)記，胰腺β細(xì)胞(ΜΙΝ6)被KO標(biāo)記。
[0055]圖10:顯示向胰腺β細(xì)胞集團(tuán)內(nèi)的血管形成的圖。血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)被GFP標(biāo)記，胰腺β細(xì)胞(ΜΙΝ6)被KO標(biāo)記。
[0056]圖11:顯示向胰腺β細(xì)胞集團(tuán)內(nèi)部的血液回流的圖。由標(biāo)記的右旋糖苷可視化血流。
[0057]圖12:組織學(xué)解析胰腺β細(xì)胞集團(tuán)的圖。
[0058]圖13:使用hiPSCs的人肝芽(hiPSC-LBs)的制成。(a)本方法的略圖。(b)肝內(nèi)胚葉分化(hiPSC-Hep)在第9天將HNF4A及AFP用抗體染色評(píng)價(jià)(結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示、n=3)。(c)將hiPSC-H印s與HUVECs及hMSCs共培養(yǎng)時(shí)的hiPSC-LBs的3維的自身組織化。在hiPSC-LBs內(nèi)確認(rèn)內(nèi)皮發(fā)芽。綠色、EGFP標(biāo)記的HUVEC ;紅色、KOFP (Kusabira橙色熒光蛋白)標(biāo)記的hMSC。標(biāo)尺長(zhǎng)度是100μπι。(d)在不含hMSCs的培養(yǎng)系統(tǒng)中確認(rèn)不到hiPSC-LBs的形成。標(biāo)尺長(zhǎng)度是1mm。(e)由使用共聚焦顯微鏡的時(shí)間推移觀察，確認(rèn)使用 Cell Tracker Red CMTMR (Molecular Probes)標(biāo)記的 hiPSC-Heps 的自律的的組織化。圖像是最大強(qiáng)度的共聚焦Z方向的圖像的投影。(f)用轉(zhuǎn)孔培養(yǎng)基，96小時(shí)、hiPSC-1feps單獨(dú)或與HUVEC及hMSCs共培養(yǎng)時(shí)的將HNF4A、F0XA2、AFP、RBP4、TTR及ALB的表達(dá)由定量RT-PCR (qPCR)解析(結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示、n=3)。(g、h)顯示肝分化標(biāo)志物基因的表達(dá)解析的結(jié)果，由BMP抑制劑頭蛋白(500ng/ml)及FGF抑制劑SU-5402 (50μΜ)的添加，妨礙與HUVEC及hMSCs共培養(yǎng)的hiPSC-H印s的有效的肝成熟(g)。另一方面，通過(guò)添加BMP4 (20ng/ml)及FGF2 (20ng/ml)，盡管用hiPSC-H印s單獨(dú)進(jìn)行培養(yǎng)，確認(rèn)肝分化標(biāo)志物的表達(dá)亢進(jìn)(h)(結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示、n=3)。
[0059]圖14:hiPSC-LBs的在體外的特性解析。(a)細(xì)胞角蛋白8及18 (CK8.18), AFP,PECAM-1 (CD31)、Flk-l、結(jié)蛋白、PCNA及5'-溴-2'-脫氧尿苷(BrdU)的抗體染色。標(biāo)尺長(zhǎng)度是100 μ m。(b、c、d、e)各細(xì)胞表征的比率如下:肝芽細(xì)胞、AFP陽(yáng)性/CK8.18陽(yáng)性；增殖細(xì)胞、(PCNA陽(yáng)性或BrdU陽(yáng)性)/CK8.18陽(yáng)性；內(nèi)皮細(xì)胞、(⑶31陽(yáng)性或Flkl陽(yáng)性)/DAPI陽(yáng)性；間葉細(xì)胞、結(jié)蛋白陽(yáng)性/DAPI陽(yáng)性。hiPSC-LBs內(nèi)的各細(xì)胞種的比率與E10.5小鼠LBs CmLBs)的比率大致近似。在b、C、d中，將結(jié)果作為平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差，e中，表示為平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差、n=3。(f)顯示小鼠和人的肝臟發(fā)生時(shí)、對(duì)于階段性地表達(dá)升高的83種肝臟特異性·基因，由微陣列數(shù)據(jù)取得的熱圖譜。在體外的肝芽形成之后，這些肝臟中特征性的基因組的表達(dá)顯著地升高。hiPSC-Def ;hiPSC來(lái)源的胚體內(nèi)胚葉細(xì)胞、hiPSC-Hep ；hiPSC來(lái)源的肝內(nèi)胚葉細(xì)胞、hiPSC-1H ；hiPSC來(lái)源的未成熟肝細(xì)胞樣細(xì)胞、hiPSC-MH ；hiPSC來(lái)源的成熟肝細(xì)胞樣細(xì)胞、hFLT ;胎兒(妊娠后期、22-40周)肝臟組織、hALT ;人成體(30歲)肝臟組織。
[0060]圖15:在體內(nèi)有功能性的血管網(wǎng)的人肝臟組織的制成。(a)向N0D/SCID小鼠的顱窗內(nèi)移植hiPSC-LBs。肉眼觀察進(jìn)行移植的hiPSC-LBs的結(jié)果，從移植約48小時(shí)后，確認(rèn)向人血管的血液流入。點(diǎn)區(qū)域顯示移植的hiPSC-LBs。標(biāo)尺長(zhǎng)度是1mm。(b)由經(jīng)時(shí)的共聚焦顯微鏡的活體觀察的結(jié)果確認(rèn)由hiPSC-LBs中的血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管網(wǎng)的形成。(c)由葡聚糖的靜脈內(nèi)施用，在移植第3天確認(rèn)，通過(guò)功能性的人血管網(wǎng)使hiPSC-LBs完全地灌流。小圖顯示人和小鼠血管的連結(jié)。虛線顯示移植片的末端。標(biāo)尺長(zhǎng)度是500 μ m。(d)將HUVECs (綠色、GFP)和宿主血管(藍(lán)色、Alexa647標(biāo)記的小鼠特異性的⑶31、靜脈施用)的連結(jié)直接可視化。標(biāo)尺長(zhǎng)度是250ym。(e、f)在移植第15天觀察形成的肝臟組織內(nèi)的hMSCs或hiPSC來(lái)源細(xì)胞的所在位置。標(biāo)尺長(zhǎng)度是100 (e)及250 (f)ym0 (g)體內(nèi)的hiPSC-LB移植片內(nèi)部的人血管網(wǎng)的定量解析(結(jié)果以平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示、n=3)。(h)在hiPSC-LB和HUVEC hMSC移植片(Tx)間比較功能性的血管的長(zhǎng)度(結(jié)果以平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示、n=5、*:P<0.01)。(i)注入FITC-葡聚糖之后的活體內(nèi)共聚焦觀察。hiPSC-LB來(lái)源的組織的血管新生是與正常的成體小鼠肝臟的血管新生大致相同程度(結(jié)果以平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示、n=5、*:P〈0.01)。
[0061]圖16:hiPSC來(lái)源的肝臟組織的在體內(nèi)的功能解析。(a)將移植60天后的組織切片HE染色的結(jié)果，確認(rèn)含血竇樣的內(nèi)皮細(xì)胞的肝細(xì)胞索的形成，而在HUVEC hMSC移植片(Tx)內(nèi)確認(rèn)不到。虛線顯示在腦上的移植片的界限。標(biāo)尺長(zhǎng)度是200 μ m (上部)及100 μ m(下部)。(b)顯示hiPSC-LB及hFLC-LB來(lái)源的在組織內(nèi)的肝臟標(biāo)志物的表達(dá)的免疫染色。標(biāo)尺長(zhǎng)度是100 μ m (左、中央)及25 μ m (右)。(C、d)經(jīng)時(shí)的小鼠血清中的人ALB及AAT量(結(jié)果以平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示、c是n=6、d是n=3)。AAT產(chǎn)生與hiPSC-LB的移植片數(shù)有比例關(guān)系。分別將2個(gè)LB移植到顱，將3或6個(gè)LB移植到腸系膜。(e)顯示由CE-TOFMS測(cè)定的hiPSC-LB移植片的代謝特征的Venn圖(圖31)。在hiPSC-LB移植片上發(fā)現(xiàn)的代謝物之中，78%與成體肝臟的代謝物一致。右圖顯示在hiPSC-LB移植片及健康的人成體肝臟的兩方檢測(cè)，原來(lái)的hiPSCs中檢測(cè)不到的主要的代謝物。(f)由質(zhì)譜法在小鼠尿中檢測(cè)的人特異性的酮洛芬代謝物(結(jié)果以平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示、n=3、*:P〈0.05)。(g)在經(jīng)口施用異喹胍的小鼠的血清代謝物中用藥物動(dòng)態(tài)解析探討4-0HDB的形成。(h)在顱內(nèi)移植(CW)或腸系膜移植的小鼠間比較血清4-0HDB代謝物的形成(結(jié)果以平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示、n=3、*:P<0.05)。(i) hiPSC-LB移植后的TK-NOG小鼠的Kaplan-Meier生存曲線。由Wilcoxon統(tǒng)計(jì)解析顯示,受模擬處置的對(duì)照組和hiPSC-LB移植組的曲線有顯著的差異(P=0.0120)。
[0062]圖17:hiPSC的向肝內(nèi)胚葉的初期分化誘導(dǎo)。(a)，通過(guò)在第6天及第9天對(duì)F0XA2、S0X17、HNF4A及AFP分別免疫染色來(lái)監(jiān)測(cè)從hiPSC的向胚體內(nèi)胚葉的分化及向肝內(nèi)胚葉的分化。(b)通過(guò)在誘導(dǎo)第6天對(duì)F0XA2及S0X17進(jìn)行免疫染色來(lái)評(píng)價(jià)向胚體內(nèi)胚葉的分化效率(結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；n=3)。
[0063]圖18:在體外的hiPSC來(lái)源肝芽形成條件的優(yōu)化。(a)通過(guò)與各種細(xì)胞類型的共培養(yǎng)的肝芽(LB)的形成。標(biāo)尺長(zhǎng)度是1mm。(b)將肝內(nèi)胚葉細(xì)胞，在各種基質(zhì)蛋白質(zhì)上，與HUVECs及hMSCs共培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于`基質(zhì)膠(LAM COL ENT)上，觀察hiPSC來(lái)源LB(hiPSC-LB)的形成。LAM:層粘連蛋白；ENT:巢蛋白；C0L:膠原IV。(c)給LB形成帶來(lái)的基質(zhì)蛋白質(zhì)濃度的效果。(d) hiPSC-LB的qPCR基因表達(dá)分析。通過(guò)與內(nèi)皮及間葉系細(xì)胞共培養(yǎng)，顯示作為初期肝分化標(biāo)志物基因的ALB，RBP4, TTR及G6PC的顯著的表達(dá)升高(結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；n=3)。
[0064]圖19:與間葉細(xì)胞的共培養(yǎng)物來(lái)源液性因子的鑒定。(a)與未分化hiPS細(xì)胞比較，與內(nèi)皮及間葉細(xì)胞的共培養(yǎng)物中上調(diào)的5000種基因的基因本體論(GO)分析。條表示，對(duì)于生物學(xué)過(guò)程，60:0008083 (生長(zhǎng)因子活性)內(nèi)的特定GO分類的顯著性(P值)。在間葉細(xì)胞特異性基因之中，F(xiàn)GF信號(hào)途徑(紅色)及BMP信號(hào)途徑(藍(lán)色)強(qiáng)調(diào)。(b，c)顯示內(nèi)皮及間葉細(xì)胞高表達(dá)FGF2及BMP4，(b) FGFs及(c) BMPs的qPCR分析。
[0065]圖20:由代表性的肝標(biāo)志物基因的微陣列分析的表達(dá)表征。將hiPSC-LB的基因表達(dá)與人胎兒(妊娠22-40周)及成體肝組織(30歲)的基因表達(dá)比較，在適宜的階段。TAT:酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；G6PC:葡萄糖-6-磷酸酶；TD02:色氨酸-2，3-脫氧酶；GLUT2:葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 ；GYS2:糖原合酶2 ;AP0L6:載脂蛋白L ；KNG1:激肽原I ;CFB:補(bǔ)體B因子；CF1:補(bǔ)體I因子；PCK1:磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶；LDHD:乳酸脫氫酶D ；CP:細(xì)胞纖溶酶;ACTB:肌動(dòng)蛋白β。
[0066]圖21:從小鼠肝芽來(lái)源細(xì)胞的小鼠肝組織的制作。(a)EGFP標(biāo)記E13.5mFLC移植片的經(jīng)時(shí)的活體內(nèi)熒光像。移植30天后，由尾靜脈注入四甲基若丹明葡聚糖，得知血管是有功能的。(b)制作的小鼠肝組織的HE染色。肝細(xì)胞群集含血竇內(nèi)皮細(xì)胞(右、箭頭)。在群集內(nèi)部形成膽管狀的結(jié)構(gòu)物，由細(xì)胞角蛋白免疫染色確認(rèn)(右、下部)。
[0067]圖22:制作的小鼠肝組織、E13.5胎兒肝組織及成體肝組織的組織學(xué)比較。(a)500ng/ml的HGF及200ng/ml的EGF的添加使肝組織的再構(gòu)成增強(qiáng)。(b)制作的小鼠肝組織與E13.5胎兒肝組織比較，有與成體肝組織類似的組織學(xué)特征。標(biāo)尺長(zhǎng)度:200μπι。
[0068]圖23:hFLC-LBs的體內(nèi)移植。將在體外制成的hFLC-LBs向N0D/SCID小鼠的顱窗下移植。(a)顯示血管新生的進(jìn)行的經(jīng)時(shí)的肉眼像。功能性的血流在第3天開(kāi)始，然后經(jīng)時(shí)，血管隨進(jìn)一步復(fù)雜化的同時(shí)穩(wěn)定化。(b) hFLC-LBs來(lái)源組織的在第3天的活體內(nèi)共聚焦像。綠色:表達(dá)EGFP的hFLCs ;紅色:表達(dá)KOFP的HUVECs。標(biāo)尺長(zhǎng)度是100 μ m。
[0069]圖24:hFLC來(lái)源肝組織內(nèi)的功能的血管網(wǎng)的體內(nèi)形成。由德克薩斯紅葡聚糖的注入(第3天)顯示的持續(xù)性脈管結(jié)構(gòu)。
[0070]圖25:與宿主血管連結(jié)的人血管網(wǎng)的形成對(duì)于hiPSC-Η印上首尾的植入不可或缺。(a)HUVECs (綠色、GFP)及宿主血管(藍(lán)色、Alexa647結(jié)合小鼠特異性⑶31 ;靜脈注射)間的連結(jié)的直接可視化。將灌流的血管由帶有熒光的葡聚糖(紅色)的靜脈注射，在第10天可視化。標(biāo)尺長(zhǎng)度是250 μ m及25 μ m。(b)外植的hiPSC-LB移植片的種特異性⑶31免疫染色顯示hiPSC來(lái)源肝組織中的人及小鼠血管之間的直接連結(jié)。標(biāo)尺長(zhǎng)度是100μπι。(c)不含內(nèi)皮細(xì)胞的hiPSC/hMSC移植片的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肉眼像。完全見(jiàn)不到可鑒定的血管。(d)hiPSC/hMSC移植片的HE染色，在30天后，顯示纖維性組織的形成。結(jié)果顯示hiPSC來(lái)源肝細(xì)胞的植入的失敗，提示內(nèi)·皮細(xì)胞的必要性。標(biāo)尺長(zhǎng)度是100μπι。
[0071]圖26:制作的人肝臟及體內(nèi)的正常的小鼠肝臟的脈管結(jié)構(gòu)的活體內(nèi)成像。(a)移植30天后，由FITC結(jié)合葡聚糖的注入可視化的，僅HUVEC hMSC (上段)或hiPSC-LB移植片(下段)的血管結(jié)構(gòu)。(b)可視化由FITC葡聚糖的血流的正常的小鼠肝臟的活體成像。標(biāo)尺長(zhǎng)度是200 μ m。
[0072]圖27:肝組織內(nèi)部的人血管網(wǎng)及肝細(xì)胞形態(tài)的活體內(nèi)評(píng)價(jià)。(a)由FITC葡聚糖注入可視化的功能性人血管。接下來(lái)使用MetaMorph Angiogenesis Module軟件處理像投影(左側(cè)小圖)。右側(cè)小圖顯示各像的分段圖像。(b)血管直徑的定量(平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差；n=3)。(c) hiFLC-LB移植片內(nèi)部的肝細(xì)胞形態(tài)的活體內(nèi)像、及細(xì)胞圓形度(形狀因子)的推定(結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；n=3 ;對(duì)于各樣品測(cè)量100個(gè)以上的細(xì)胞；*:P<0.05 ；N.S.:不顯著)。
[0073]圖28:hiPSC_LB移植片的在體內(nèi)的經(jīng)時(shí)變化。(a) hiPSC-LB移植片的長(zhǎng)時(shí)間HE染色。如在正常的小鼠肝臟發(fā)生中觀察到\圓形的hiPSC來(lái)源肝芽細(xì)胞大規(guī)模增殖，分化為有增大的細(xì)胞質(zhì)的未成熟肝細(xì)胞。標(biāo)尺長(zhǎng)度是50 μ m。(b)在體內(nèi)的hiPSC-LB移植片內(nèi)的增殖性細(xì)胞數(shù)的2周后，在1、2及4個(gè)月后的由Ki67免疫染色的定量。
[0074]圖29:hiPSC_LB或hFLC_LB移植片的全標(biāo)本包埋免疫染色。(a)顯示制作的肝組織內(nèi)的基底膜蛋白質(zhì)的再構(gòu)成的膠原IV免疫染色。標(biāo)尺長(zhǎng)度是IOOym及50μπι。(b)與正常的小鼠肝組織同樣地，由成熟肝細(xì)胞及間葉細(xì)胞組成的移植片來(lái)源人肝組織。標(biāo)尺長(zhǎng) 50 u nio
[0075]圖30:hFLC-LB來(lái)源人肝組織的免疫染色及透過(guò)型電子顯微鏡分析。(a)hFLC_LB移植片來(lái)源的肝組織表達(dá)肝細(xì)胞特異性抗原(HSA)，但不表達(dá)AFP (左側(cè)小圖)。對(duì)人⑶31及α平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)的免疫染色顯示肝組織內(nèi)部中的主要血管的形成(右側(cè)小圖)。標(biāo)尺長(zhǎng)度是100μπι。(b，c，d，e)hFLC-LB來(lái)源肝組織的電子顯微鏡圖像。顯示有緊密連接(b，C)、毛細(xì)膽管、豐富的線粒體、以及有糖原及脂質(zhì)的蓄積(d，e)的肝細(xì)胞。
[0076]圖31:hiPSC_LB移植片的表達(dá)基因的表征。由移植60天后的多數(shù)的肝成熟標(biāo)志物基因的(a)微陣列表征及(b) qPCR驗(yàn)證的結(jié)果得知，hiPSC-LB向由移植的成熟肝細(xì)胞成熟。
[0077]圖32:60天hiPSC-LB移植片(藍(lán)色)、人成體肝臟(紅色)及未分化hiPSCs (綠色)的代謝途徑圖譜。將在途徑圖譜中鑒定的代謝物用不同的顏色著色的四角顯示。N.D.:未檢測(cè)到。
[0078]圖33:向治療用途的腸系膜移植模型的確立。(a)將在體外增殖的hiPSC或FLC來(lái)源LB移植到用纖維蛋白糊覆蓋的腸系膜。(b)移植60天后的hiPSC來(lái)源肝組織的肉眼觀察。用點(diǎn)圍起來(lái)的區(qū)域顯示移植片。(c)hiPSC-LB移植30天后，的2/3PH而人白蛋白的產(chǎn)生增大。(n=3) (d) DT注入Alb-TRECK/SCID小鼠的，hFLC-LB移植的(n=8)或偽手術(shù)的(n=7)組中的Kaplan-Meier生存曲線。
[0079]實(shí)施方式
[0080]以下，詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
[0081]本發(fā)明的器官芽的制作方法的特征在于，將器官細(xì)胞與選自由血管內(nèi)皮細(xì)胞、間葉系細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的因子，由間葉系細(xì)`胞分泌的因子，由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞這二者存在而分泌的因子的至少I種細(xì)胞及/或因子一同培養(yǎng)器官細(xì)胞。
[0082]本發(fā)明中“器官芽”是指通過(guò)成熟可分化為器官的結(jié)構(gòu)體，即器官細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、及未分化間葉系細(xì)胞或含從其分化的細(xì)胞的三種細(xì)胞的結(jié)構(gòu)體。何種結(jié)構(gòu)體是器官芽可通過(guò)下述方法確認(rèn)，例如，研究將該結(jié)構(gòu)體向活體移植是否可分化為目的器官(向目的器官分化，則可判斷為器官芽。)、及/或研究是否結(jié)構(gòu)體含全部上述的三種細(xì)胞(含全部三種細(xì)胞，則可判斷為器官芽。)。器官芽可為分化為例如，腎臟、心臟、肺臟、脾臟、食道、胃、甲狀腺、副甲狀腺、胸腺、生殖腺、腦、脊髓等的器官的器官芽等，但優(yōu)選為分化為肝臟的器官芽(肝芽)、分化為胰腺的器官芽(胰腺芽)、分化為腸道的器官芽等分化為內(nèi)胚葉性器官的器官芽。何種結(jié)構(gòu)體是分化為內(nèi)胚葉性器官的器官芽可通過(guò)研究成為標(biāo)志物的蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)確認(rèn)(表達(dá)后述的標(biāo)志物蛋白質(zhì)之任何一種或多種，則可判斷為器官芽。)。例如，在肝芽中，HHEX、S0X2、HNF4A、AFP、ALB等成為標(biāo)志物，胰腺芽中，PDXl、SOXl7、S0X9等成為標(biāo)志物，分化為腸道的器官芽中，CDX2、S0X9等成為標(biāo)志物。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的用語(yǔ)之中，肝芽、肝盲囊、肝類器官、胰腺(背側(cè)或腹側(cè))芽、胰腺原基、胰腺類器官、腸芽、腸憩室、腸類器官(K.Matsumoto，et al.Science.19 ；294 (5542):559-63.(2001))等包括在本發(fā)明中的器官芽中。
[0083]本發(fā)明中“器官細(xì)胞”是指，構(gòu)成器官的功能細(xì)胞、或者向功能細(xì)胞分化的未分化細(xì)胞。作為“未分化的器官細(xì)胞”，可舉出例如，可分化為腎臟、心臟、肺臟、脾臟、食道、胃、甲狀腺、副甲狀腺、胸腺、生殖腺、腦、脊髓等的器官的細(xì)胞等，可分化為腦、脊髓、腎上腺髓質(zhì)、表皮、毛發(fā)一爪.皮膚腺、感覺(jué)器、末梢神經(jīng)、水晶體等之外胚葉性器官的細(xì)胞、可分化為腎臟、尿管、心臟、血液、生殖腺、腎上腺皮質(zhì)、肌肉、骨架、真皮、結(jié)締組織、中皮等中胚葉性器官的細(xì)胞、可分化為肝臟、胰腺、腸道、肺、甲狀腺、副甲狀腺、尿路等之內(nèi)胚葉性器官的細(xì)胞等。何種細(xì)胞是可分化為外胚葉性器官、中胚葉性器官或內(nèi)胚葉性器官的細(xì)胞可通過(guò)研究成為標(biāo)志物的蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)確認(rèn)(表達(dá)標(biāo)志物蛋白質(zhì)中的任何一種或多種，則可判斷為可分化為內(nèi)胚葉性器官的細(xì)胞。)。例如，可分化為肝臟的細(xì)胞中，HHEX、S0X2、HNF4A、AFP、ALB等成為標(biāo)志物，可分化為胰腺的細(xì)胞中，PDXl、S0X17、S0X9等成為標(biāo)志物，可分化為腸道的細(xì)胞中，⑶X2、S0X9等成為標(biāo)志物，可分化為腎臟的細(xì)胞中，SIX2、SALL1、可分化為心臟的細(xì)胞中，NKX2-5MYH6、ACTN2、MYL7、HPPA、可分化為血液的細(xì)胞中，C-KIT、SCAU TER119、H0XB4、可分化為腦或脊髓的細(xì)胞中，HNKU AP2、NESTIN等成為標(biāo)志物。本領(lǐng)域技術(shù)人員間使用的用語(yǔ)之中，成肝細(xì)胞、肝祖細(xì)胞、成胰腺細(xì)胞、肝前體細(xì)胞、成胰腺細(xì)胞、胰腺祖細(xì)胞、胰腺祖細(xì)胞、胰腺前體細(xì)胞、內(nèi)分泌前體細(xì)胞、腸祖細(xì)胞、腸前體細(xì)胞、中胚層、后腎間葉前體細(xì)胞、多能性腎單位祖細(xì)胞、腎祖細(xì)胞、心臟中胚層、心血管祖細(xì)胞、心臟祖細(xì)胞、(JR.Spence，et al.Nature.；470 (7332):105-9.(2011)、Self，et al.EMBOJ.；25 (21):5214-5228.(2006)、J.Zhang, et al.Circulation Research.;104:e30_e41(2009)、G.Lee，et al.Nature Biotechnology25,1468-1475 (2007))等包括在本發(fā)明中的未分化的器官細(xì)胞中。未分化的器官細(xì)胞可從人工多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)、胚性干細(xì)胞(ES細(xì)胞)等的多能性干細(xì)胞根據(jù)公知的方法制作。例如，可分化為肝臟的器官細(xì)胞可根據(jù)K.S1-Taiyeb,et al.Hepatology,51(1):297-305(2010)>T.Touboul，et al.Hepatology.51
(5):1754-65.(2010)制作，可分化為胰腺的器官細(xì)胞可根據(jù)D.Zhang，et al.Cell Res.；19 (4):429-38.(2009)制作，可分化為腸道的器官細(xì)胞可根據(jù)J.Cai，et al.J Mol CellBiol.；2 (1):50-60 (2010)、R.Spence，et al.Nature.；470 (7332):105-9.(2011)制作，可分化為心臟的器官細(xì)胞可根據(jù) J.Zhang, et al.Circulation Research.；104:e30-e41(2009)制作，可分化為腦或脊髓的細(xì)胞可根據(jù)G.Lee, et al.Nature Biotechnology25,1468-1475 (2007)制作。作為“分化的器官細(xì)胞”，可例示胰腺的內(nèi)分泌細(xì)胞、胰腺的胰腺管上皮細(xì)胞、肝臟的肝細(xì)胞、腸·道之上皮細(xì)胞、腎臟的尿細(xì)管上皮細(xì)胞、腎臟的腎小球上皮細(xì)胞、心臟的心肌細(xì)胞、血液的淋巴細(xì)胞或粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、腦的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脊髓的神經(jīng)細(xì)胞或許旺細(xì)胞等。器官細(xì)胞主要使用人來(lái)源的，但也可使用人以外的動(dòng)物、例如，小鼠、大鼠、狗、豬、猴等的動(dòng)物來(lái)源的器官細(xì)胞。
[0084]本發(fā)明中，“血管內(nèi)皮細(xì)胞”是指構(gòu)成血管內(nèi)皮的細(xì)胞、或者可分化為那樣的細(xì)胞的細(xì)胞。何種細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)研究是否表達(dá)標(biāo)志物蛋白質(zhì)、例如，TIE2、VEGFR-U VEGFR-2、VEGFR-3、CD41來(lái)確認(rèn)(表達(dá)上述標(biāo)志物蛋白質(zhì)中的任何一種或多種，則可判斷為血管內(nèi)皮細(xì)胞。)。本發(fā)明中，使用的血管內(nèi)皮細(xì)胞可為分化的，也可為未分化的。血管內(nèi)皮細(xì)胞是否為分化的細(xì)胞可由CD31、CD 144確認(rèn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的用語(yǔ)之中，內(nèi)皮細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞、血管性祖細(xì)胞、成血管細(xì)胞(HJ.joo，et al.Blood.25 ；118 (8):2094-104.(2011))等包括在本發(fā)明中的血管內(nèi)皮細(xì)胞中。血管內(nèi)皮細(xì)胞主要使用人來(lái)源的，但也可使用人以外的動(dòng)物、例如，小鼠、大鼠、狗、豬、猴等的動(dòng)物來(lái)源的血管內(nèi)皮細(xì)胞。[0085]本發(fā)明中，“間葉系細(xì)胞”的概念是指，主要存在于從中胚葉來(lái)源的結(jié)締組織中，形成以組織發(fā)揮功能的細(xì)胞的支持結(jié)構(gòu)的結(jié)締組織細(xì)胞，也包括被決定向間葉系細(xì)胞的分化運(yùn)命，但尚未向間葉系細(xì)胞分化的細(xì)胞。本發(fā)明中，使用的間葉系細(xì)胞可為分化的，也可為未分化的。何種細(xì)胞是未分化間葉系細(xì)胞可通過(guò)研究是否表達(dá)標(biāo)志物蛋白質(zhì)、例如，Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestin 來(lái)確認(rèn)(表達(dá)上述標(biāo)志物蛋白質(zhì)中的任何一種或多種，則可判斷為未分化間葉系細(xì)胞。)。另外，可判斷不表達(dá)前項(xiàng)的標(biāo)志物中的任何一種的間葉系細(xì)胞為分化間葉系細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的用語(yǔ)之中，間葉干細(xì)胞、間葉祖細(xì)胞、間葉細(xì)胞(R.Peters，et al.PLoS One.30 ；5 (12):el5689.(2010))等包括在本發(fā)明中之間葉系細(xì)胞中。間葉系細(xì)胞主要使用人來(lái)源的，但也可使用人以外的動(dòng)物、例如，小鼠、大鼠、狗、豬、猴等的動(dòng)物來(lái)源的未分化間葉系細(xì)胞。
[0086]共培養(yǎng)中的三種細(xì)胞的培養(yǎng)比只要在可形成器官芽的范圍內(nèi)，就不特別限定，適宜的細(xì)胞數(shù)比是器官細(xì)胞:血管內(nèi)皮細(xì)胞:未分化間葉系細(xì)胞=10:10~5:2~I。
[0087]另外，血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞中的任何一方或兩方可用由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的因子，由間葉系細(xì)胞分泌的因子，由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞這二者存在而分泌的因子等的物質(zhì)代替。
[0088]作為由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的因子、由間葉系細(xì)胞分泌的因子、及由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞這二者存在而分泌的因子等的物質(zhì)的例，可例示FGF2、FGF5、BMF4、BMP6、CTGF等，但不限于這些。
[0089]作為這些物質(zhì)的添加量，對(duì)于FGF2，每I X 10~6個(gè)細(xì)胞，10~100ng/ml是適當(dāng)?shù)模?0ng/ml左右是優(yōu)選的，對(duì)于BMF4而言，每I X 10~6個(gè)細(xì)胞，10~100ng/ml是適當(dāng)?shù)模?0ng/ml左右是優(yōu)選的。
[0090]培養(yǎng)時(shí)使用的培養(yǎng)基只要是形成器官芽的就可，但優(yōu)選使用血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基、器官細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基、將上述2種培養(yǎng)基`混合的等。血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基可使用任何培養(yǎng)基，優(yōu)選使用含hEGF (重組人上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、VEGF (血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、氫化可的松、bFGF、抗壞血酸、IGF1、FBS、抗生素(例如，慶大霉素、兩性霉素B等)、肝素、L-谷氨酰胺、酚紅、BBE的至少I種的培養(yǎng)基。作為血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，可使用 EGM_2BulIetKit (Lonza 公司制)、EGM BulletKit (Lonza 公司制)、VascuLifeEnGS Comp Kit(LCT公司制)、人內(nèi)皮-SFM基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)、人微小血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖培養(yǎng)基(TOYOBO公司制)等。器官細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基可使用任何培養(yǎng)基，但當(dāng)器官細(xì)胞是肝細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選使用含抗壞血酸、BSA-FAF、胰島素、氫化可的松、GA-1OOO的至少I種的培養(yǎng)基。作為肝細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，從HCM BulletKit (Lonza公司制)除去hEGF (重組人上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)的培養(yǎng)基，可向RPMI1640 (Sigma-Aldrich公司制)使用1%B27補(bǔ)充物(GIBC0公司制)和10ng/mL hHGF (Sigma-Aldrich公司制)等。關(guān)于人肝芽的形成，向?qū)M BulletKit (Lonza公司制)和從HCM BulletKit (Lonza公司制)除去hEGF(重組人上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)的培養(yǎng)基以1:1混合的培養(yǎng)基，添加地塞米松、抑瘤素M、HGF,確證對(duì)肝芽的成熟有效果。
[0091]器官細(xì)胞優(yōu)選接種于凝膠上進(jìn)行培養(yǎng)。此時(shí)、使用的凝膠不特別限定，可使用BDMatrigel (BD pharmingen 公司制)等。
[0092]培養(yǎng)時(shí)的溫度不特別限定，優(yōu)選30~40°C，再優(yōu)選37°C。[0093]培養(yǎng)期間不特別限定，優(yōu)選3~10天，再優(yōu)選6天。
[0094]將如上所述制作的器官芽移植到非人動(dòng)物，通過(guò)使其在非人動(dòng)物內(nèi)成熟，可制作組織或器官。作為使用的非人動(dòng)物，可舉出小鼠、兔、豬、狗、猴等。另外，使用的非人動(dòng)物，為了回避免疫排斥反應(yīng)，優(yōu)選免疫缺陷動(dòng)物。
[0095]從而，本發(fā)明提供包括將由上述的方法制作的器官芽移植進(jìn)人或非人動(dòng)物的器官芽的移植方法。器官芽的移植部位是只要可移植，任何部位都可，可例示顱內(nèi)、腸系膜、肝臟、脾臟、腎臟、腎被膜下、門靜脈上等。在移植到顱內(nèi)時(shí)，移植在體外制作的I~3個(gè)左右的5mm大的器官芽就可,在移植到腸系膜時(shí)，移植在體外制作的I~6個(gè)左右的5mm大的器官芽就可，在移植到門靜脈上時(shí)，移植在體外制作的I~20個(gè)左右的5mm大的器官芽就可。在移植到腎皮膜時(shí)，移植在體外制作的I~5個(gè)左右的5mm大的器官芽就可，在移植到肝臟一脾臟一腎臟時(shí)，移植在體外制作的100~200個(gè)左右的100μπι大的器官芽就可。
[0096]如上所述制作的組織及器官可在創(chuàng)藥篩選或再生醫(yī)療等中使用。
[0097]從而，本發(fā)明提供組織或器官的再生或功能恢復(fù)方法，包括將由上述的方法制作的器官芽移植到人或非人動(dòng)物，分化為組織或器官。作為非人動(dòng)物，可舉出小鼠、兔、豬、狗、猴等。
[0098]另外，本發(fā)明提供非人嵌合體動(dòng)物的制作方法，包括將由上述的方法制作的器官芽移植到非人動(dòng)物，分化為組織或器官。移植器官芽的非人動(dòng)物(例如，小鼠)可模仿器官芽的制作中使用的器官細(xì)胞的來(lái)源生物種(例如，人)的生理功能。在后述的實(shí)施例中，移植從人來(lái)源的iPS細(xì)胞制作的器官芽的小鼠確認(rèn)模仿人的肝功能，所以認(rèn)為，使用此小鼠可預(yù)測(cè)人的藥物代謝表征。
[0099]再者，本發(fā)明提供評(píng)價(jià)藥劑的方法，其使用選自由上述的方法制作的器官芽、組織及器官、及非人嵌合體動(dòng)物的·至少一種。作為藥劑的評(píng)價(jià)，可舉出例如，藥的候選化合物的藥物代謝表征的預(yù)測(cè)、藥效評(píng)價(jià)、毒性評(píng)價(jià)、藥物相互作用評(píng)價(jià)等。
[0100]另外，從由本發(fā)明的方法制作的組織及器官制造組織干細(xì)胞也可能，本發(fā)明在人組織細(xì)胞或器官細(xì)胞的大量制造的向細(xì)胞操作技術(shù)的應(yīng)用是可能的。
[0101]【實(shí)施例】
[0102]以下，通過(guò)實(shí)施例再詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
[0103]〔實(shí)施例1〕使用未分化的器官細(xì)胞的器官的制作
[0104]〔實(shí)驗(yàn)方法〕
[0105]【(I)人肝臟內(nèi)胚葉細(xì)胞的制作】
[0106]通過(guò)將人iPS細(xì)胞(人皮膚來(lái)源TkDA3hiPSC克隆(由Koji Eto氏及HiromitsuNakauchi氏獲贈(zèng)))向無(wú)血清培養(yǎng)基添加激活素來(lái)培養(yǎng)，誘導(dǎo)CXCR4及E-鈣粘素兩陽(yáng)性的內(nèi)胚葉系細(xì)胞。通過(guò)將得到的內(nèi)胚葉系細(xì)胞添加BMP4、FGF2培養(yǎng)2天，得到CXCR4陰性HNF4 α陽(yáng)性的肝臟內(nèi)胚葉集團(tuán)。CXCR4及HNF4a的表達(dá)，根據(jù)H印atology，51 (I )，297-305，2010的記載，由免疫染色及基因表達(dá)解析確認(rèn)。
[0107]【(2)人肝芽的制作】
[0108]將得到的肝臟內(nèi)胚葉細(xì)胞，與血管內(nèi)皮細(xì)胞(人臍帶血來(lái)源靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)(Lonza、Basel、Switzerland)及未分化間葉系細(xì)胞(人間葉系干細(xì)胞)(Lonza、Basel、Switzerland)以各10:5-10:2的比例混合，進(jìn)行共培養(yǎng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞及未分化間葉系細(xì)胞使用進(jìn)行各熒光標(biāo)記的細(xì)胞。共培養(yǎng)時(shí)，向進(jìn)行原液至2倍稀釋的基質(zhì)膠(BDpharmingen)的固相化的培養(yǎng)皿之上接種細(xì)胞懸浮液。培養(yǎng)液使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基試劑盒-2:EGM-2BulIetKit (制品編碼 CC-3162:Lonza)。
[0109]進(jìn)行短期間(3-10天)培養(yǎng)，制作人三維結(jié)構(gòu)體(肝芽)。另外，進(jìn)行形成過(guò)程、及由形成的結(jié)構(gòu)體的共聚焦顯微鏡的觀察，實(shí)施細(xì)胞的形態(tài)、所在位置等的動(dòng)態(tài)/靜態(tài)解析。再者，進(jìn)行形成的人三維結(jié)構(gòu)體的基因表達(dá)解析。
[0110]【(3)人肝組織的制作】
[0111]將形成的人三維結(jié)構(gòu)體，向免疫缺陷小鼠(N0D/SCID小鼠(Sankyo Lab.C0.，Tsukuba, Japan))活體內(nèi)移植。實(shí)施由肉眼及共聚焦顯微鏡的活體觀察，確認(rèn)人細(xì)胞的植入一增殖的同時(shí)，解析移植后的血管成熟化過(guò)程?；厥找浦苍缙诘臉悠?2周)，進(jìn)行其組織學(xué)解析。
[0112]〔實(shí)驗(yàn)結(jié)果〕
[0113](I)從僅人細(xì)胞自律地進(jìn)行組織化，形成可肉眼觀察的立體的結(jié)構(gòu)體(圖1)。
[0114](2)在培養(yǎng)第4天，確認(rèn)血管樣的管腔結(jié)構(gòu)(圖1右上圖的擴(kuò)大像)。
[0115](3)形成的三維結(jié)構(gòu)體減弱作為未分化細(xì)胞的標(biāo)志物的NANOG或CXCR4等的表達(dá)(圖 2)。
[0116](4)與由以往技術(shù)進(jìn)行終末分化誘導(dǎo)的細(xì)胞比較，顯示使作為肝細(xì)胞的分化標(biāo)志物的白蛋白(ALB)的表達(dá)增強(qiáng)100倍以上(圖2)、使其他分化標(biāo)志物(F0XA2、TAT、PCK2)的表達(dá)也達(dá)到數(shù)十倍程度的表達(dá)增強(qiáng)(圖3)。
[0117](5)由移植，人血管與小鼠血管`連接，從早期(移植第2天)開(kāi)始血液灌流(圖4)。
[0118](6)確認(rèn)人iPS細(xì)胞來(lái)源肝臟細(xì)胞的增殖(圖5)。
[0119](7)由移植早期(2周)的樣品的組織學(xué)解析，確認(rèn)白蛋白陽(yáng)性的索狀結(jié)構(gòu)的形成。另外，也確認(rèn)血竇樣結(jié)構(gòu)的形成(圖5)。
[0120](8)共培養(yǎng)時(shí)、不將細(xì)胞懸浮液接種于基質(zhì)膠固相化培養(yǎng)皿上，將細(xì)胞懸浮液包埋于基質(zhì)膠中時(shí)，向非包被的培養(yǎng)皿接種時(shí)，或者向?qū)⑴囵B(yǎng)皿用I型膠原包被的培養(yǎng)皿接種時(shí)不形成立體結(jié)構(gòu)。
[0121](9)共培養(yǎng)時(shí)、在作為培養(yǎng)液不使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，而使用添加IfepatocyteMedium (XenoTech),或者 BMP4 及 FGF2 的肝細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(!fepatology，51 (I),297-305，2010)時(shí)，在肝芽確認(rèn)不到特征性的表達(dá)基因的增強(qiáng)(Alb、TTR等)。
[0122]〔實(shí)施例2〕使用分化的器官細(xì)胞的器官的制作
[0123]〔實(shí)驗(yàn)方法〕
[0124]將胰腺β細(xì)胞株(ΜΙΝ6)與血管內(nèi)皮細(xì)胞(人臍帶血來(lái)源靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)及未分化間葉系細(xì)胞(人間葉系干細(xì)胞)以各5:5-10:2的比例混合，進(jìn)行共培養(yǎng)。胰腺β細(xì)胞株(KO)及血管內(nèi)皮細(xì)胞(EGFP)使用進(jìn)行各熒光標(biāo)記的細(xì)胞。共培養(yǎng)時(shí)，向進(jìn)行原液至2倍稀釋的基質(zhì)膠(BD pharmingen)的固相化的培養(yǎng)皿之上接種細(xì)胞懸浮液。再有，向基質(zhì)膠內(nèi)部包埋時(shí)，或者，在非包被、I型膠原包被的培養(yǎng)皿中，不形成立體結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)液使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基試劑盒-2:EGM-2BulIetKit (制品編碼CC-3162:Lonza)。
[0125]進(jìn)行短期間(3-10天)培養(yǎng)，制作三維結(jié)構(gòu)體。進(jìn)行形成過(guò)程、及由形成的結(jié)構(gòu)體的共聚焦顯微鏡的觀察，實(shí)施細(xì)胞的形態(tài)、所在位置等的動(dòng)態(tài)/靜態(tài)解析。[0126]將形成的三維結(jié)構(gòu)體向免疫缺陷小鼠(N0D/SCID小鼠(Sankyo Lab.C0.，Tsukuba，Japan))活體內(nèi)移植。實(shí)施由肉眼及共聚焦顯微鏡的活體觀察，確認(rèn)細(xì)胞的植入一增殖的同時(shí)，解析移植后的成熟化過(guò)程?；厥找浦矘悠?4周)，進(jìn)行其組織學(xué)解析。
[0127]〔實(shí)驗(yàn)結(jié)果〕
[0128](I)從僅細(xì)胞自律地進(jìn)行組織化，在次日形成可肉眼觀察的立體的結(jié)構(gòu)體(圖6)。
[0129](2)在培養(yǎng)第2天，胰腺β細(xì)胞株形成集塊，確認(rèn)人血管樣的管腔結(jié)構(gòu)包圍其周圍(圖 7)。
[0130](3)由移植，人血管與小鼠血管連接，從移植早期開(kāi)始血液灌流(圖8)。
[0131](4)胰腺β細(xì)胞株形成集塊地增殖，形成胰島樣的結(jié)構(gòu)體(圖9)。
[0132](5)在形成的胰島樣結(jié)構(gòu)體之中確認(rèn)包含人細(xì)胞的血管結(jié)構(gòu)的形成(圖10)。
[0133](6)由血流的可視化確認(rèn)，胰腺島樣結(jié)構(gòu)體之內(nèi)部再開(kāi)始充分地血液灌流(圖11)。
[0134](7)由移植樣品的組織學(xué)解析，確認(rèn)胰島素陽(yáng)性的島狀結(jié)構(gòu)的形成。形成的結(jié)構(gòu)體內(nèi)部有復(fù)雜的血管結(jié)構(gòu)，有與正常小鼠胰腺島類似的結(jié)構(gòu)(圖12)。
[0135]〔實(shí)施例3〕由人工多能性干細(xì)胞來(lái)源的器官芽移植的功能性的血管化人肝臟的制造
[0136]用于治療末期器官功能衰竭的供體器官顯著地不足，使用患者來(lái)源的人工多能性干細(xì)胞(hiPSCs) u制成器官的必要性越發(fā)升高。盡管多個(gè)論文報(bào)告了功能性的細(xì)胞分化”，尚無(wú)在肝臟這樣的有3維的血管網(wǎng)的器官的制成中成功的例。我們通過(guò)在體外制備的hiPSC來(lái)源的肝芽(hiPSC·-LBs)的移植，在有血管結(jié)構(gòu)的功能性的人肝臟組織的制成中成功。除了內(nèi)皮細(xì)胞和間葉細(xì)胞8之外，當(dāng)促進(jìn)器官形成時(shí)，iPS細(xì)胞來(lái)源肝內(nèi)胚葉細(xì)胞與3維的hiPSC-LBs發(fā)生自身組織化。免疫染色及表達(dá)基因的解析的結(jié)果，在體外生長(zhǎng)的hiPSC-LBs和體內(nèi)的肝芽間確認(rèn)類似性。hiPSC-LBs移植片內(nèi)的人血管網(wǎng)在48小時(shí)以內(nèi)與宿主血管連結(jié)，開(kāi)始血液灌流。通過(guò)形成功能性的血管結(jié)構(gòu),得知hiPSC-LBs向與成體肝臟類似的組織成熟。再者，有高的代謝能力的hiPSC來(lái)源的移植組織不要求受者的肝臟的取代9’1(1，發(fā)揮人型的蛋白質(zhì)產(chǎn)生或人特異性的藥物代謝這樣的肝臟特異性的功能。再者，當(dāng)將hiPSC-LBs移植到腸系膜時(shí)，使藥物誘導(dǎo)的致死的肝功能衰竭模型的生存率升高。據(jù)我們所知，本報(bào)告是從多能性干細(xì)胞制成功能性的人器官的最初的例。雖然想將本方法臨床應(yīng)用，進(jìn)一步的探討是必要的，我們實(shí)驗(yàn)證實(shí)的器官芽移植提供在再生醫(yī)療中有可能性的新的方法。
[0137]自1981年發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞以來(lái)，數(shù)次嘗試了從多能性干細(xì)胞制成具有如肝臟一樣的復(fù)雜的結(jié)構(gòu)的器官，但尚無(wú)成功的例。這被認(rèn)為是因?yàn)樵隗w外再現(xiàn)器官形成過(guò)程中發(fā)生的在細(xì)胞或組織間的復(fù)雜的相互作用是困難的2’n。我們關(guān)注于器官形成中的最初的過(guò)程、即，器官芽發(fā)生時(shí)的細(xì)胞間相互作用，研究了本課題。
[0138]在肝臟形成初期，由片狀的前腸內(nèi)胚葉層釋放細(xì)胞，形成三維的肝芽(LB)12。這樣的形態(tài)學(xué)的大的變化依賴于血液灌流前發(fā)生的在內(nèi)胚葉細(xì)胞、間葉系及內(nèi)皮系前體細(xì)胞間的精密編成的信號(hào)8?；谶@些見(jiàn)解，我們假定，將肝內(nèi)胚葉細(xì)胞與內(nèi)皮系及間葉系細(xì)胞一同培養(yǎng)，可在體外再現(xiàn)3維的(3D)的LB形成(圖13a)。為了證實(shí)本假說(shuō)，首先最初，通過(guò)階段性的誘導(dǎo)因子的添加將人iPSCs向肝內(nèi)胚葉細(xì)胞(hiPSC-Hep)分化誘導(dǎo)。結(jié)果，所述細(xì)胞的約80%中確認(rèn)與細(xì)胞運(yùn)命決定相關(guān)的肝性標(biāo)志物HNF4A的表達(dá)(圖17及13b)。[0139]接下來(lái)，以再現(xiàn)初期肝臟形成作為目的，將hiPSC-Η印細(xì)胞與間葉細(xì)胞組共培養(yǎng)。對(duì)于內(nèi)皮及間葉細(xì)胞而言，只要無(wú)特別說(shuō)明，使用有未分化性的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)及人間葉干細(xì)胞(hMSCs)。需要特別說(shuō)明的是，僅管在2D培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)，在特定的基質(zhì)蛋白質(zhì)上生長(zhǎng)的hiPSC-Hep細(xì)胞由于內(nèi)在性的組織化能力而在培養(yǎng)后24小時(shí)以內(nèi)形成可肉眼確認(rèn)的程度的大小的3D細(xì)胞群集(圖13c、d、e)。被推定為hiPSC-Hep來(lái)源的肝芽(hiPSC-LBs)的群集有適度的力學(xué)強(qiáng)度，可耐受隨后的移植操作等。使用用熒光蛋白質(zhì)標(biāo)記的細(xì)胞將在hiPSC-LBs內(nèi)的伴隨精密的內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)芽的血管網(wǎng)的發(fā)達(dá)可視化(圖13c)。另外，通過(guò)使用從相同的供體得到的臍帶來(lái)源的MSCs及HUVECs，hiPSC-LB的形成均一地保持(圖18a、右)。qPCR解析的結(jié)果，hiPSC-LBs內(nèi)的細(xì)胞以高的水平轉(zhuǎn)錄作為肝臟的初期分化標(biāo)志物的α胎蛋白(AFP)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP4)、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)及白蛋白(ALB)5 (圖18d)。令人感興趣的是，間葉細(xì)胞依賴性的hiPSC-Η印細(xì)胞的肝成熟在使用轉(zhuǎn)孔的共培養(yǎng)系統(tǒng)中也以一定程度維持(圖13f)。以研究誘導(dǎo)肝成熟的介導(dǎo)因子作為目的，進(jìn)行微陣列及qPCR解析。在間葉細(xì)胞特異性的基因組之中，BMP4及FGF2在與內(nèi)皮及間葉細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)中顯著地升高(圖19)。作為BMP-及FGF-特異性的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑的頭蛋白及SU-5402抑制由與間葉細(xì)胞的共培養(yǎng)的分化促進(jìn)效果。另一方面，將BMP4及FGF2添加于hiPSC-Η印培養(yǎng)基，則觀察到同樣的肝分化誘導(dǎo)效果(圖13g、h)。這些結(jié)果提示，如在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)13中也確認(rèn)，除了直接的細(xì)胞間的相互作用之外，經(jīng)BMP及FGF途徑的活化，通過(guò)由間葉細(xì)胞的液性因子的旁分泌支持支持一部分肝臟初期成熟。
[0140]hiPSC-LB與如在妊娠后期及生產(chǎn)后小鼠的發(fā)達(dá)的肝臟不同，與E10.5小鼠的LBs(mLBs)非常類似(圖14a)。hiPSC-LB及E10.5mLBs與間葉系及內(nèi)皮系前體細(xì)胞同樣地表達(dá)AFP14’15，由有二分化能力的增殖性肝芽細(xì)胞構(gòu)建。在hiPSC-LB及E10.5mLBs中，90%以上的推定肝細(xì)胞表達(dá)AFP，但在E15.5及E17.5mLBs中確認(rèn)不到(圖14b)。hiPSC-LB內(nèi)的肝細(xì)胞與E10.5mLBs有同程度的增殖能力(圖14c)。再者，hiPSC-LB由與E10.5mLBs同樣的比例的間葉系及內(nèi)皮系前體細(xì)胞構(gòu)成(圖14d、e)。為了研究表達(dá)基因的特征，選擇肝臟發(fā)生時(shí)連續(xù)地表達(dá)升高的83種基因，將其表達(dá)用微陣列RNA表征探討。由先前研究確認(rèn)，E10.5mLBs顯示與妊娠3-4周(3-4GW)的·人胎兒肝臟對(duì)應(yīng)16’17、與這一致的是，與妊娠22-40GW的胎兒及成體來(lái)源的發(fā)達(dá)的肝臟組織比較，hiPSC-LB中的83種基因表達(dá)模式處于適宜的分化階段(圖14f及圖20)。
[0141]血流動(dòng)力學(xué)的促進(jìn)在LB成熟中是必須的18。為了探討hiPSC-LBs是否重構(gòu)有完全的功能的肝臟組織，進(jìn)行可經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)行重復(fù)成像19的向顱觀察窗的移植。首先，通過(guò)在移植實(shí)驗(yàn)中使用小鼠肝芽來(lái)源的細(xì)胞(mLB)，確認(rèn)本模型可再現(xiàn)LB的成熟過(guò)程(補(bǔ)充考察、圖21及22)。再者，以同樣地有LB (hFLC-LBs)形成能力的胎兒肝細(xì)胞作為對(duì)照，在培養(yǎng)時(shí)使用(圖18a)。為了觀察移植的人細(xì)胞的在體內(nèi)的經(jīng)過(guò)，將在體內(nèi)的hiPSC-LBs來(lái)源的組織在各種各樣的時(shí)間點(diǎn)重復(fù)成像。需要特別說(shuō)明的是，體外來(lái)源的hiPSC-LBs在移植后48小時(shí)以內(nèi)與宿主的血管結(jié)構(gòu)快速連結(jié)(圖15a、b及圖23)。注入熒光素一葡聚糖接合體及或Alexa647標(biāo)記的小鼠特異性⑶31抗體的結(jié)果，得知移植的hiPSC-LBs內(nèi)的人血管在移植片的末端與宿主血管連結(jié)。結(jié)果也在將摘出組織片由全標(biāo)本包埋的免疫染色中確認(rèn)(圖15c、d及圖24、25a、b)。再者顯示，不含內(nèi)皮細(xì)胞而進(jìn)行移植的hiPSC-Η印s不發(fā)生血管形成，由于無(wú)法植入，功能性的血管形成對(duì)于hiPSC-LB的移植及增大是必要不可或缺的(圖15f及圖25)。由hMSC來(lái)源的血管周圍細(xì)胞穩(wěn)定化的人血管殘留至少180天(圖15e及g)。令人感興趣的是，hiPSC-LB移植片的血管網(wǎng)有與具有類似的形態(tài)的成體肝臟同程度的密度。另一方面，僅由HUVECs及hMSCs構(gòu)建的移植片內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)與hiPSC-LB移植片比較，雖然血管徑是相同程度(約12 μ m)，但密度更低(圖15h、i及圖26、27)。另外發(fā)現(xiàn)，由活體內(nèi)成像，基于肝細(xì)胞的形態(tài)可推定分化狀態(tài)(圖27c及補(bǔ)充考察)。近年，從以基因改變動(dòng)物作為對(duì)象的詳細(xì)的研究的結(jié)果推測(cè)，內(nèi)皮細(xì)胞不僅形成輸送營(yíng)養(yǎng)素或氧的途徑，還由旁分泌TROPHOGEN(卜口 7 * y >)產(chǎn)生確立促進(jìn)肝臟的器官形成及再生8’2°’21的血管微小環(huán)境。通過(guò)使用這樣的移植模型，以人組織作為對(duì)象，確立了可評(píng)價(jià)器官形成時(shí)的成熟及分化過(guò)程的獨(dú)特的活體內(nèi)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。由進(jìn)一步研究得知，期待被知更精密再現(xiàn)生理性的肝形成的人間葉細(xì)胞株的器官發(fā)生時(shí)的作用。
[0142]將LB移植片在60天后，組織學(xué)地進(jìn)行解析。與hFLC-LB同樣地，hiPSC-LB移植片也有在成體肝臟中特征性的肝細(xì)胞索樣的結(jié)構(gòu)(圖16a及圖28a)、本結(jié)構(gòu)由表達(dá)緊密連接蛋白一閉鎖小帶I (Z0-1)、ALB、細(xì)胞角蛋白8及18 (CK8.18)(圖16b)的細(xì)胞、及通常含沿洞樣血管22的全長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)的膠原IV的基底膜(圖29a)構(gòu)成。再者顯示，表達(dá)作為成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物的無(wú)唾液酸糖蛋白受體I (ASGR1)，不表達(dá)未成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP (圖29b、14a)。移植4個(gè)月后，在形成肝組織的幾乎全部細(xì)胞中，由作為增殖標(biāo)志物的K1-67的表達(dá)確認(rèn)與通常的肝臟內(nèi)的肝細(xì)胞同樣地增殖停止(圖28b)。移植片來(lái)源的細(xì)胞有:良好發(fā)達(dá)的卵形的線粒體、緊密連接的形成、糖原及脂肪的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蓄積、毛細(xì)膽管這樣的成熟肝細(xì)胞中特征性的超微細(xì)結(jié)構(gòu)(圖30b、c、d、e)。
[0143]解析進(jìn)行hiPSC-LB移植的小鼠的血清的結(jié)果確認(rèn)作為人蛋白質(zhì)的人型ALB及Al抗胰蛋白酶(AAT)的生產(chǎn)及分泌(圖16e)。移植60天后，將外植的hiPSC-LBs用qPCR解析的結(jié)果確認(rèn)，與體外來(lái)源的hiPSC-LBs比較，有明顯的肝成熟(圖31)。為了研究糖質(zhì)、氨基酸及核苷酸代謝這樣的低分子量代謝物的表征，將hiPSC-LB移植片代謝產(chǎn)物組解析時(shí)，檢測(cè)到含?；悄懰徇@樣的肝臟特異性的物質(zhì)的222種代謝物(圖16f)。這些代謝性高的表征，相比原來(lái)的hiPSCs更近似于人成體肝臟的表征(圖32)。再者，為了研究作為肝臟的重要的功能之一的藥物代謝活性，將已知在人和小鼠以不同的樣式代謝的酮洛芬23或異喹胍24’25施用于小鼠。藥物施用之后，由`移植hiPSC-LB的小鼠的尿及血清樣品確認(rèn)人中特異性的代謝物的形成(圖16f、g、h及補(bǔ)充考察)。這顯示，通過(guò)使用本小鼠模仿人的在體內(nèi)的生理功能，可預(yù)測(cè)人的藥物代謝表征。特別是，以往方法有以具有重度受損傷的肝臟的小鼠26'27作為宿主，移植高品質(zhì)的成體肝細(xì)胞的必要，在今后可使用人iPS細(xì)胞精密驗(yàn)證人型的藥物應(yīng)答的點(diǎn)上意義深遠(yuǎn)。
[0144]以將來(lái)的向臨床的應(yīng)用作為目的，對(duì)于作為相比顱更現(xiàn)實(shí)的目標(biāo)部位，侵襲性極其低的腸系膜移植模型進(jìn)行探討。將hiPSC-LB向用纖維蛋白糊密封的腸系膜移植的結(jié)果，在第I個(gè)月人血管與宿主血管連結(jié)，由肉眼確認(rèn)移植LB的植入(圖33a、b)。進(jìn)行向腸系膜移植的hiPSC-LB與顱移植的情況比較，在蛋白質(zhì)產(chǎn)生及藥物代謝的方面有更高的功能，如在先的研究28也顯示，證實(shí)門靜脈循環(huán)的重要性。再者，與模擬處置小鼠比較，由hiPSC-LB的移植，用更昔洛韋引起肝功能衰竭的TK-NOG小鼠29的生存率升高(圖16i及補(bǔ)充考察)。從以上事實(shí)可說(shuō)，通過(guò)移植體外hiPSCs來(lái)源的LB，我們?cè)谡T導(dǎo)有血管網(wǎng)的功能性的人肝臟組織中成功。[0145]使用自身的多能性干細(xì)胞的再生醫(yī)療集合了極其大的期待。但是，作為使用干細(xì)胞的方法，使用作為現(xiàn)在主要的課題的細(xì)胞移植的臨床試驗(yàn)至今尚無(wú)令人滿足的結(jié)果3°'31。作為在體內(nèi)制成3維血管新生的器官的新的方法，由本研究證明器官芽的移植是有效的。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)，作為器官功能衰竭的治療，在體外生長(zhǎng)的器官芽的移植具有大的治療的有效性。
[0146]【方法摘要】
[0147]hiPSCs的肝初期分化誘導(dǎo)根據(jù)前述的方法5進(jìn)行。將HUVECs和hMSCs (Lonza、Basel、Switzerland),使用內(nèi)皮增殖培養(yǎng)基(EGM) (Lonza)或MSC增殖培養(yǎng)基(Lonza),在加濕溫育器內(nèi)，于37度、5%的CO2存在下維持。在體外制成人LB時(shí)，向EGM和肝細(xì)胞用培養(yǎng)基(HCM) (Cambrex、Baltimore、MD)(含地塞米松(0.1 μ M、Sigma-Aldrich、St Louis、MO)、抑瘤素 M (10ng/ml、R&D System、Minneapolis、MN)、HGF (20ng/ml、PromoKine)及SingleQuots (Lonza))懸浮 IXlO6 的 hiPSC 來(lái)源肝細(xì)胞、0.8-1 X IO6 的 HUVECs、及 2X IO5的hMSCs,涂布于基質(zhì)膠(BD Biosciences、Bedford、MA、USA)上。培養(yǎng)4-6天后，剝下生成的hiPSC-LBs，采集之后，移植到免疫缺陷小鼠的顱窗19。
[0148]【方法】
[0149]細(xì)胞培養(yǎng)及分化TkDA3hiPSC克隆購(gòu)自Koji Eto氏及Hiromitsu Nakauchi氏。對(duì)于未分化hiPSC細(xì)胞，將小鼠胚成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用，在其上生長(zhǎng)。內(nèi)胚葉性分化時(shí)，將hiPSCs接種于用基質(zhì)膠包被的皿上之后，移到含1%的B27 (不含胰島素)和(IOOng/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)5~6天。通過(guò)將hiPSC來(lái)源的內(nèi)胚葉細(xì)胞用含hbFGF( IOng/ml)、hBMP4 (20ng/ml)及1%B27的PRMI1640再處理3_4天來(lái)進(jìn)行向肝臟的特化。人重組體激活素 A/EDF 購(gòu)自 Yuzuru Eto 氏(Ajinomoto C0.1nc.)。將 hFLCs(CS_ABI_3716 ；AppliedCell Biology Research Institute)接種于用膠原 IV 包被的 6_ 孔板(BD Biosciences)上之后，使用該研究室的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基[含10%FBS (Lot.7219F ；ICN Biochemical、USA)、50mmoI / I HEPES (ffa·ko Pure Chemical Industries、Japan)、2mmol/L L-谷氨酉先胺(LifeTechnologies Corporation、USA)、50mmol/L2_ 疏基乙醇(Sigma)、I X 青霉素 / 鏈霉素(Life Technologies)、lOmmol/L 煙酰胺(Sigma)、I X ICT4M 地塞米松(Sigma)及 I μ g/ml 胰島素(Wako)的F-12 (Sigma Aldrich、Japan)和DMEM的1:1混液]維持。在培養(yǎng)前添加人重組體HGF (50ng/ml)及EGF (20ng/ml) (Sigma)0使用上皮增殖培養(yǎng)基或MSC增殖培養(yǎng)基(Lonza)，在加濕溫育器內(nèi)，于37度、5%的CO2存在下維持HUVECs及hMSCs (Lonza)。
[0150]為了由反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)活體成像，用表達(dá)EGFP或kusabira orange (KOFP)的反轉(zhuǎn)錄病毒，如文獻(xiàn)記載19感染細(xì)胞。即，將反轉(zhuǎn)錄病毒載體PG⑶Nsam IRES-EGFP或KOFP轉(zhuǎn)染到293gp及293gpg包裝細(xì)胞(由Masafumi Onodera氏提供)中，使用四環(huán)素誘導(dǎo)性的系統(tǒng)誘導(dǎo)病毒粒子產(chǎn)生。將感染反轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞的培養(yǎng)上清用0.45-μ m濾器(Whatman，GE Healthcare, Japan)過(guò)濾,立即用于感染。KOFP是將在515nm處有小的峰的主要吸收極大波長(zhǎng)在548nm處顯示，然后發(fā)在561nm處有峰的亮橙色熒光32。
[0151]【移植】
[0152]剝離在體外生成的LB，采集之后，移植到實(shí)施重度免疫缺陷的N0D/SCID小鼠(Sankyo Lab.C0., Tsukuba, Japan)的盧頁(yè)窗內(nèi)。移植的細(xì)胞的在體內(nèi)的經(jīng)過(guò)通過(guò)使用突光顯微鏡(model BZ-9000 ;Keyence、Osaka、Japan)或 Leica TCS SP5 共聚焦顯微鏡(LeicaMicrosystems、Germany)的活體內(nèi)成像觀察。對(duì)于生存曲線而言，使用TK-NOG小鼠(體重<20-30g)(提供方 Central Institute for Experimental Animals、Kanagawa> Japan) 29進(jìn)行解析。將I打的hiPSC-LBs移植到腸系膜后，在第7及10天，在人及小鼠組織中，通過(guò)向小鼠施用無(wú)毒的更昔洛韋(GCV、50mg/kg、腹腔內(nèi)注入)，組織特異性地消去基因?qū)氲母闻K的實(shí)質(zhì)細(xì)胞。小鼠根據(jù)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)利用的當(dāng)研究設(shè)施指南進(jìn)行交配及維持。
[0153]由植入血管的灌流的數(shù)量化，由1%四甲基若丹明結(jié)合葡聚糖(麗2，000，000)、異硫氰酸熒光素結(jié)合葡聚糖(MW2，000，000)及德克薩斯紅結(jié)合葡聚糖(70，000MW,中性)的尾靜脈注入鑒定血管腔(全部Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。對(duì)于移植的血管及葡聚糖得到多個(gè)共聚焦像。使用 MetaMorph Angiogenesis Module 軟件(Molecular Devices, UnionCity, CA, USA),處理像的投影。接下來(lái)，向Excel電子數(shù)據(jù)表自動(dòng)地記錄全細(xì)管長(zhǎng)、每視場(chǎng)細(xì)管％及管直徑。
[0154]如前所述33實(shí)施表達(dá)基因的分析qPCR分析。人胎兒肝臟(Lot N0.:A601605)及人成體肝臟(Lot N0.:B308121)的全 RNA 從 Biochain Institute (Hayward, CA, USA)得到。
[0155]【表達(dá)基因的微陣列及數(shù)據(jù)分析】
[0156]使用RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA),由 hiPSC 來(lái)源細(xì)胞 / 組織(hiPSC,hiPSC-Def, hiPSC-Hep, hiPSC-1H，hiPSC-MH，hiPSC-LB，hiPSC-LB-Tx)制備全 RNA。人胎兒肝臟(Lot N0.:A601605)及人成體肝臟(Lot N0.:B308121)的全 RNA 從 BiochainInstitute (Hayward, CA, USA)得到。擴(kuò)增 cRNA,使用 Low Input Quick Amp Labeling Kit(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)標(biāo)記，與 44K 的 60 寡聚體微陣列(Human GeneExpression4X44K v2Microarray Kit ；Agilent Technologies),根據(jù)生產(chǎn)商的指不雜交。將雜交的微陣列載玻片使用Agilent高解析度微陣列掃描儀掃描。使用特征提取軟件版本10.7.3.1 (Agilent Technologies),計(jì)算相對(duì)雜交強(qiáng)度及背景雜交值。根據(jù)AgilentTechnologies推薦的順序,使用GeneSpringll.5.1軟件中的標(biāo)志基準(zhǔn)，由雜交強(qiáng)度及斑信息計(jì)算原始信號(hào)強(qiáng)度及各探針的標(biāo)志。再者，對(duì)樣品的原始信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行l(wèi)og2變換，由變位值算法標(biāo)準(zhǔn)化。我們對(duì)全部的樣品，除“`妥協(xié)的”(compromised)標(biāo)志之外,選擇探針,作為檢測(cè)的基因得到34，183個(gè)的探針。再者，我們把焦點(diǎn)放在基因水平中的26，153個(gè)的表達(dá)數(shù)據(jù)。由GeneSpring制作熱圖譜。加載標(biāo)準(zhǔn)化的強(qiáng)度值，由從各探針的中位值的距離進(jìn)行標(biāo)度調(diào)節(jié)。我們由使用歐幾里得測(cè)定基準(zhǔn)的序列的聚類法將樣品及基因分類。為了評(píng)價(jià)各階段的hiPSCs中的基因表達(dá)模式的差異，我們分析選擇的83種基因的表達(dá)變化。這些基因在由在各不同的發(fā)生階段的小鼠肝細(xì)胞及2個(gè)在不同階段的人肝組織的微陣列分析的我們的以前的研究中鑒定。從全部的基因?qū)?3種基因作為肝臟特性基因選擇。這是因?yàn)椋鼈兊幕蛟谌思靶∈髢烧叩母闻K發(fā)生時(shí)繼續(xù)增加。
[0157]使ELISA血液樣品于室溫在離心管內(nèi)凝固(約5分鐘)、從管的側(cè)面分離，保持于40C (熔化中的冰)20分鐘。將凝固的血液以10-15分鐘400g，于4°C離心，一邊注意排除紅細(xì)胞或凝固的物質(zhì)，一邊除去血清級(jí)分。將小鼠血清樣品中的人ALB及AAT，使用人白蛋白ELISA 定量試劑盒(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA)及人 α 1-抗膜蛋白酶ELISA定量試劑盒(GenWay Biotech, Inc., San Diego, CA, USA),根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定。[0158]使用溶解于全標(biāo)本包埋免疫染色PBS的4%多聚甲醛(PFA)由心穿刺給小鼠灌流。除去形成顱窗的蓋玻片，摘出移植片(厚度約300 μ m)，在溶解于PBS的4%PFA中在冰上放置1.5小時(shí)。為了免疫染色，將固定膠原凝膠用PBS清洗3次(各10分鐘)、使用3%BSA/0.l%Triton X-1OO阻斷I小時(shí)，與第一抗體一同于4°C溫育一晚。接下來(lái)，實(shí)施3次使用PBS/0.l%Triton X-100的10分鐘清洗。與第二抗體一同將樣品于4°C溫育一晚，接下來(lái)，實(shí)施3次使用PBS/0.l%Triton X-100的10分鐘清洗。使用DAPI對(duì)組織樣品進(jìn)行對(duì)比染色，包埋于封入劑(Vector Laboratories，USA)中的玻璃載玻片上，加蓋蓋玻片。使用以下的第一抗體:小鼠抗人Z01、小鼠抗人⑶31、及大鼠抗小鼠⑶31 (BD Biosciences)、兔抗小鼠膠原 IV (Millipore, USA)及結(jié)蛋白(Dako Corporation, Carpinteria, CA)。免疫染色使用Leica TCS SP5共聚焦顯微鏡進(jìn)行分析。
[0159]將組織處理及免疫染色組織在4%PFA中于4°C固定一晚，處理，然后在石蠟中包埋。為了使用蘇木精/伊紅(HE)的免疫染色或標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)染色，將橫斷切片(4μπι)加載到MAS包被載玻片(Matsunami, Osaka, Japan)上。免疫染色之前,實(shí)施使用檸檬酸緩沖液(pH6.0)的滅菌鍋抗原回收。使用的第一抗體是，抗人:⑶31 ;平滑肌肌動(dòng)蛋白；AFP ；CK8.18(全部 Dako Corporation)及 ALB(BD Biosciences)。將組織切片與第二抗體 Alexa Fluor(Life Technologies) —同于室溫溫育I小時(shí),接下來(lái)進(jìn)行DAPI (Sigma)核染色。使用LSM510激光掃描顯微鏡(Carl Zeiss C0., Germany)得到像。
[0160]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)表示從3或6次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)得到的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。將3或4組間的比較，依次(依順序)使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行分析,然后將Mann-Whitney的U檢驗(yàn)與邦弗朗尼補(bǔ)正一同使用而進(jìn)行事后比較。作為〈0.05的兩側(cè)P值被認(rèn)為是顯著的。
[0161]參考文獻(xiàn)
[0162]1.Klein, A.S.et al.0rgan donation and utilization in the UnitedStates, 1999-2008.Am J TransplantlO, 973-986, (2010).[0163]2.Sanal,M.G.Future of liver transplantation:non-hu·man primates forpatient-specific organs from induced pluripotent stem cells.World J Gastroenteroll7, 3684-3690, (2011).[0164]3.Kriks, S.et al.Dopamine neurons derived from human EScells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.Nature480, 547-551，(2011).[0165]4.Kroon, E.et al.Pancreatic endoderm derived from human embryonicstem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in viv0.NatBiotechnol26, 443-452，(2008).[0166]5.S1-Tayeb, K.et a 1.Highly efficient generation of humanhepatocyte-1ike cells from induced pluripotent stem cells.Hepatology51, 297-305, (2010).[0167]6.Jiang, H.et al.Parkin controls dopamine utilization in humanmidbrain dopaminergic neurons derived from induced pluripotent stem cells.NatCommun3, 668, (2012).[0168]7.Cai, J.et al.Directed differentiation of human 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perichondrium.Proc Natl Acad Sci U SA108， 14479-14484， (2011).[0195]【補(bǔ)充方法】
[0196]【HUVECMSC `分離】
[0197]我們根據(jù)由橫浜市立大學(xué)倫理委員會(huì)制定，承認(rèn)的指南得到臍帶樣品(承認(rèn)編號(hào):13120510008)。HUVECs及MSCs，如文獻(xiàn)中記述2、從臍帶同時(shí)分離。
[0198]【mFLC分離】
[0199]將從C57BL/6-Tg CAG::EGFP (SLC,日本)分離的 E13.5mFLCs，在 Dulbecco 改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM ;含10%牛胎兒血清(FBS)) (JRH Bioscience，USA)中通過(guò)移液器吸吐機(jī)械分離。通過(guò)實(shí)施數(shù)次低速離心分離(690rpm/于4°C I分鐘)，將肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分離。使分離的細(xì)胞2次通過(guò)70 μ m細(xì)胞濾器(Falcon，USA)，得到單細(xì)胞。
[0200]【植入的肝細(xì)胞形態(tài)的定量】
[0201]使用IN Cell Investigator 軟件(GE Healthcare,Fairfield,CT,USA)處理活體內(nèi)共聚焦像，使用“形狀因子”(將周長(zhǎng)與面積關(guān)聯(lián)的，圓形度的標(biāo)準(zhǔn)的推定)對(duì)肝細(xì)胞分化的狀態(tài)進(jìn)行分類。此測(cè)定值是，以I作為完全的圓，在O~I之間變動(dòng)。
[0202]【代謝產(chǎn)物組表征的獲得】
[0203]移植60天后，回收hiPSC-LB移植片(n=3)，分析。使用具備Agilent6210小時(shí)飛行型質(zhì)譜分析計(jì)，AgilentllOO均一濃度HPLC泵，Agilent G1603A CE-MS適配體試劑盒及Agilent G1607A CE-ES1-MS噴霧器套件的Agilent CE毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(AgilentTechnologies, ffaldbronn, Germany),實(shí)施 CE-TOFMS? 此系統(tǒng)由 CE 用 Agilent G2201AAChemStation 軟件版本 B.03.01 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)控制。陽(yáng)離子性代謝物使用作為電解質(zhì)使用陽(yáng)離子緩沖溶液(Human Metabolome Technologies)的融合氧化娃毛細(xì)管(內(nèi)徑50 μ m X全長(zhǎng)80cm)進(jìn)行分析。用50mbar的壓力注入樣品10秒鐘(約10nl)。將施加電壓設(shè)定為27kV。以陽(yáng)性離子模式實(shí)施電子噴霧離子化質(zhì)譜分析(ES1-MS)，將毛細(xì)管電壓設(shè)定為4，000V。從m/z50至1，000掃描質(zhì)譜分析計(jì)。其他條件與在陽(yáng)離子分析3中同樣。
[0204]陰離子性代謝物使用作為電解質(zhì)使用陰離子緩沖溶液(Human MetabolomeTechnologies)的融合氧化娃毛細(xì)管(內(nèi)徑50 μ m x全長(zhǎng)80cm)進(jìn)行分析。用50mbar的壓力注入樣品25秒鐘(約25nl)。將施加電壓設(shè)定為30kV。以陰性離子模式實(shí)施ES1-MS，將毛細(xì)管電壓設(shè)定為3，500V。從m/z50至1，000掃描質(zhì)譜分析計(jì)。其他條件與在陰離子分析4中同樣。
[0205]將從CE-TOFMS得到的原始數(shù)據(jù)由作為自動(dòng)積分軟件的MasterHands5處理。得到含m/z、移動(dòng)時(shí)間(MT)及面積的峰信息。峰面積根據(jù)下述的等式變換為相對(duì)峰面積。各峰根據(jù)CE中的類似的移動(dòng)時(shí)間及由TOFMS確定的m/z值合并。
[0206]相對(duì)峰面積=代謝物峰面積/ (內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)峰面積X樣品量)`[0207]代謝途徑圖譜使用作為公有的軟件的VANTED !Visualisation and Analysis ofNetworks containing Experimental Data6 提供。
[0208]【藥物代謝活性】
[0209]向在顱窗內(nèi)移植hiPSC-LB的N0D/SCID小鼠(n=3)靜脈內(nèi)施用酮洛芬(15mg/kg)。作為對(duì)照，使用偽手術(shù)的N0D/SCID小鼠。將尿(0-2小時(shí))在0.5M醋酸緩沖液(pH5.0)中集合。向尿樣品添加IN Κ0Η，于80°C溫育3小時(shí)，其后，使用等容量的IN HCL進(jìn)行中和。添加含1%醋酸的乙腈，經(jīng)離心(15000rpm,4°C,5分鐘)。使上清經(jīng)歷液相層析-串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC/MS/MS)。在液相層析實(shí)驗(yàn)中，使用具備Intersil 0DS-3柱(GL Science株式會(huì)社、東京、日本)的LC-20A系列(島津、京都、日本)。由層析的分離使用Intersil 0DS-3柱(5μπι，4.6x150mm 1.D.；GL Science株式會(huì)社、東京、日本)實(shí)現(xiàn)。柱溫度維持在40°C。將包含含有0.1%醋酸(溶劑A)及0.1%醋酸的乙腈(溶劑B)的移動(dòng)相，根據(jù)以下的梯度進(jìn)度表，以流速0.5mL/分注入:25-80%溶劑B的直線梯度(0-15分鐘)、80%溶劑B( 15-25分鐘)、80_25%溶劑B的直線梯度(25-26分鐘)、及25%溶劑B (26-35分鐘)。將液相層析與4000Q Trap系統(tǒng)(AB SCIEX, Foster City，CA)連結(jié)，以陰性電子噴霧離子化模式操作。渦輪氣體維持在600°C。親及/或片段離子用第一四極子過(guò)濾，然后作為沖突氣體使用氮而在沖突池內(nèi)解離。離子噴霧電壓是-4500V，酮洛芬及1-羥基酮洛芬分析的m/z遷移(Q1/Q3)分別是253.1/209.3 及 269.1/209.3。[0210]向在顱窗內(nèi)(n=3)及腸系膜內(nèi)(n=3)移植hiPSC-LB的N0D/SCID小鼠經(jīng)口施用異喹胍(2mg/kg)。作為對(duì)照，使用偽手術(shù)的N0D/SCID小鼠。施用的0.5、1，2及8小時(shí)后，將血液樣品集合，添加肝素鈉。從血液由離心分離血漿。將內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(尼氟酸I μ m)及甲醇溶液(100 μ L)添加到5μ L的血漿，經(jīng)離心(15000rpm，4°C，5分鐘)。使上清經(jīng)歷LC/MS/MS。在 LC 實(shí)驗(yàn)中，使用具備 Aquity UPLC BEH C18 柱(Waters, Milford, MA, USA)的 AcquityUltraPerformance LC 系統(tǒng)(Waters, Milford, MA, USA)。由層析的分離使用 Acquity UPLCBEH C18 (1.7μπι,2.1x50mm 1.D.;Waters，Milford，MA，USA)實(shí)現(xiàn)。柱溫度維持在 40°C。將含有IOmM醋酸銨(溶劑A)及乙腈(溶劑B)的移動(dòng)相，根據(jù)％以下的梯度進(jìn)度表，以流速0.8mL/分注入:0%溶劑B (0-0.2分鐘)、0_30%溶劑B的直線梯度(0.2-0.3分鐘)、30_60%溶劑B的直線梯度(0.3-0.85分鐘)、60%溶劑B (0.85-1.15分鐘)、60_100%溶劑B的直線梯度(1.15-1.16分鐘)、及100%溶劑B (1.16-1.5分鐘)。將液相層析與API4000系統(tǒng)(ABSCIEX，F(xiàn)oster City, CA)連結(jié)，以陽(yáng)性電子噴霧離子化模式操作。渦輪氣體維持在450°C。親及/或片段離子用第一四極子過(guò)濾，然后作為沖突氣體使用氮在沖突池內(nèi)解離。離子噴霧電壓是5000V，4-羥基異喹胍及內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)分析的m/z遷移(Q1/Q3)分別是192.6/132.1及283.2/245.4。
[0211]【肝損傷模型】
[0212]為了評(píng)價(jià)我們的移植戰(zhàn)略的治療的可能性，使用Alb-TRECK/SCID小鼠進(jìn)行肝損傷研究。Alb-TRECK/SCID 小鼠由 Hiromichi Yonekawa 及 Kunie Matsuoka (東京都臨床醫(yī)學(xué)綜合研究所)提供。此轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)從ALB增強(qiáng)子/啟動(dòng)子表達(dá)HBEGF，然后施用少量的白喉毒素(DT)的則引發(fā)劇癥肝炎7。向用纖維蛋白糊覆蓋的腸系膜中移植hFLCs-LBs。LB移植后，在第2天由尾靜脈注入1.5 μ g/kg DT，引起重度的肝損傷。比較受移植的小鼠和未受移植的小鼠之間的生存。
[0213]補(bǔ)充考察
[0214]功能性肝臟組織制·造中的顱窗模型的可能性
[0215]用于顱窗制備的詳細(xì)的順序如前所述8。我們?cè)u(píng)價(jià)了在使用表達(dá)EGFP的E13.5小鼠胎兒肝細(xì)胞(mFLCs)的移植片來(lái)研究肝細(xì)胞的成熟上的顱窗的可能性。切出包埋于膠原/纖連蛋白凝膠的mFLCs的一片，置于顱窗之中心部。接下來(lái)，使用組織適合性的氰基丙烯酸酯糊使8_的蓋玻片粘接于骨，將此窗密封?；铙w內(nèi)熒光顯微鏡成像顯示移植的mFLCs良好地植入，及在移植片內(nèi)形成功能性血管網(wǎng)(圖21a)。移植的組織廣范分化為類似于肝細(xì)胞索、血竇及膽管的組織。這些組織是成體肝臟中特征性的，不是供體E13.5LBs中特征性的(圖21b)。由mFLCs的肝組織再構(gòu)成隨HGF及EGF (這些已知刺激肝干細(xì)胞/前體細(xì)胞的增殖)的添加增強(qiáng)(圖22) 9’1(1。從而提示，此移植方法是對(duì)于評(píng)價(jià)LB細(xì)胞的成熟及分化有益的活體內(nèi)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。
[0216]人肝細(xì)胞成熟的活體內(nèi)評(píng)價(jià)
[0217]在正常肝發(fā)生過(guò)程中，肝細(xì)胞的形態(tài)從圓形變化為鋪路石狀的細(xì)胞n。此變化可由細(xì)胞角蛋白免疫染色容易地可視化(圖16a、左)。使用IN Cell Investigator軟件,我們發(fā)現(xiàn)小鼠肝細(xì)胞的圓形度(形狀因子)從E13.5時(shí)的0.833±0.18降低至生產(chǎn)后8周的
0.568±0.16。同樣地，單細(xì)胞形態(tài)的活體內(nèi)成像顯示，移植的EGFP標(biāo)記hFLCs的圓形度從第O天的0.93±0.07變化為30天后的0.512±0.13 (圖27c、右)。與這些考察一致，酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)顯示從移植30天后起的人白蛋白產(chǎn)生的出現(xiàn)(圖16c及d)。從而，細(xì)胞形態(tài)的活體內(nèi)監(jiān)測(cè)可成為用于預(yù)測(cè)在體內(nèi)的肝細(xì)胞分化的狀態(tài)的一種指標(biāo)。
[0218]人特異性藥物代謝的檢測(cè)
[0219]我們使用酮洛芬(KTP)評(píng)價(jià)了人特異性藥物代謝功能。KTP在小鼠中被細(xì)胞染料P450第一代謝，形成1-羥基酮洛芬(OH-KTP) 12。另一方面，在人中，KTP主要被UDP-葡萄糖醛?；D(zhuǎn)移酶(UGT)代謝，形成酮洛芬葡萄糖醛酸苷(KTP-G) 13。
[0220]肝臟人化小鼠是在研究人特異性藥物代謝上有用的工具。使用高品質(zhì)的成體肝細(xì)胞及有嚴(yán)重?fù)p傷的肝臟的免疫缺陷小鼠，以前報(bào)告了肝臟人化小鼠中的人特異性藥物代謝功能。KTP的施用后觀察到，UGT使KTP葡萄糖醛酸苷化變得容易14、及由水解而KTP代謝為KTP-G。計(jì)算ΚΤΡ/0Η-ΚΤΡ峰面積比，在水解樣品和非水解樣品之間比較此面積比。KTP/OH-KTP峰面積比的倍增提示樣品中的KTP-G的形成。有移植的hiPSC-LBs的N0D/SCID小鼠及對(duì)照小鼠中的尿中的倍增分別是11.8±5.2及2.3±0.7，提示在移植hiPSC-LBs的NOD/SCID小鼠中觀察到KTP葡萄糖醛酸苷化(人特異性藥物代謝功能)。
[0221]作為對(duì)人CYP2D6的一般表現(xiàn)型檢查劑發(fā)揮作用的異喹胍在人中被代謝為4_羥基異喹胍(4-0HDB)，但在小鼠中可忽略。重要的是，人CYP2D6與公知藥物的25%的代謝相關(guān)，由此，通過(guò)多型多數(shù)存在，恭獻(xiàn)于顯著的個(gè)體差異。異喹胍的經(jīng)口施用后，在腸系膜或顱接受移植的組中的4-0HDB的血漿濃度相比偽手術(shù)組中的濃度更高，這反映人特異性藥物代謝物的產(chǎn)生。
[0222]面向臨床應(yīng)用的hFLC-或hiPSC-LB的腸系膜移植模型的確立
[0223]由于顱窗模型是高度侵襲性的，對(duì)于器官芽移植而言說(shuō)不上是非常地有效的方法。從而，在推定臨床應(yīng)用時(shí)，更低侵襲性的移植法的開(kāi)發(fā)是必要的。再者，移植可能的量對(duì)于逆轉(zhuǎn)肝功能衰竭而言是不足·夠的。從而，我們?cè)囍接懥饲忠u性最少、有臨床適宜性的、腸系膜移植模型的可能性。這是因?yàn)椋瑢?duì)于肝功能的改善而言，門靜脈血流被認(rèn)為是重要的。與我們的期待一致，最近的報(bào)告顯示，恐怕由來(lái)自腸系膜血流的宿主血管補(bǔ)充而腹腔部位可支持人成體肝細(xì)胞的植入及肝功能的維持15。將在體外增殖的hFLC-LBs或hiPSC-LBs移植到腸系膜上(圖33a)。
[0224]【由2/3份分肝切除的刺激】
[0225]為了確定hiPSC-LB移植片中的肝細(xì)胞成熟是否可被HGF等的再生因子促進(jìn)，在腸系膜移植后第7天實(shí)施2/3部分肝切除(PH)。2/3PH實(shí)施后，在第30天，人白蛋白的產(chǎn)生從偽手術(shù)組的82.lng/ml升高至2/3PH組的121ng/ml (圖33c)。這些的結(jié)果提示，恐怕由于hiPSC-LB移植片內(nèi)的廣范的肝細(xì)胞增殖及成熟，hiPSC-Heps可應(yīng)答于2/3PH后的再生刺激。
[0226]【使用hFLC-LB腸系膜移植的肝功能衰竭的逆轉(zhuǎn)】
[0227]為了評(píng)價(jià)使用我們的移植法的治療可能性，將在體外增殖的hFLC-LBs移植到用纖維蛋白糊密封的腸系膜上。作為肝損傷模型，使用在肝細(xì)胞特異性白蛋白啟動(dòng)子的控制下表達(dá)人HB-EGF前體的轉(zhuǎn)基因免疫缺陷小鼠。一旦向被稱為毒素受體媒介細(xì)胞敲除/重癥復(fù)合免疫缺陷(TRECK/SCID)小鼠的這些小鼠施用少量的白喉毒素(DT)，則會(huì)引發(fā)劇癥肝炎7。在移植后第2天，以1.5 μ g/kg的用量由尾靜脈注入DT劑。生存曲線顯示，未受移植的TRECK/SCID小鼠的全部在10天以內(nèi)死亡。作為對(duì)照，移植hFLC-LB的TRECK/SCID小鼠的28%生存經(jīng)40天以上，顯示我們的概念證實(shí)的治療上的可能性(圖32d)。但是，此移植模型雖在某種程度良好，但救助率卻不高。這是因?yàn)?，DT對(duì)人細(xì)胞有毒性。從而，我們采用免疫缺陷肝損傷模型作為TK-NOG小鼠。這是因?yàn)?，GCV (對(duì)人組織是非毒性的)的施用在適宜的時(shí)機(jī)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的組織特異性除去。使用此模型，我們?cè)诮?jīng)功能性人血管網(wǎng)的形成而移植片被預(yù)測(cè)良好地植入的移植后第7天及第10天除去宿主肝細(xì)胞。
[0228]補(bǔ)充參考文獻(xiàn)
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[0245]工業(yè)實(shí)用性
[0246]由本發(fā)明的方法制作的組織及器官可在藥物開(kāi)發(fā)篩選等中使用，從而本發(fā)明可在制藥產(chǎn)業(yè)等利用?！?br> 【權(quán)利要求】
1.器官芽的制作方法，其包括將器官細(xì)胞和選自下述的至少I種細(xì)胞和/或因子一起培養(yǎng)，所述細(xì)胞和/或因子為:由血管內(nèi)皮細(xì)胞、間葉系細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的因子；由間葉系細(xì)胞分泌的因子；由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞這二者的存在而分泌的因子。
2.權(quán)利要求1所述的器官芽的制作方法，其中器官細(xì)胞是分化的細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1所述的器官芽的制作方法，其中器官細(xì)胞是未分化的細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中器官細(xì)胞是:內(nèi)胚葉性器官的細(xì)胞或可能分化為內(nèi)胚葉性器官的細(xì)胞的細(xì)胞、中胚葉性器官的細(xì)胞或可能分化為中胚葉性器官的細(xì)胞的細(xì)胞、或者外胚葉性器官的細(xì)胞或可能分化為外胚葉性器官的細(xì)胞的細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4所述的器官芽的制作方法，其中器官細(xì)胞是內(nèi)胚葉性器官的細(xì)胞或可能分化為內(nèi)胚葉性器官的細(xì)胞的細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5所述的器官芽的制作方法，其中內(nèi)胚葉性器官是肝臟或胰腺。
7.權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中器官細(xì)胞是人工多能性干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7所述的器官芽的制作方法，其中人工多能性干細(xì)胞是人來(lái)源的。
9.權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其將器官細(xì)胞和選自下述的至少I種細(xì)胞和/或因子一起在血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述細(xì)胞和/或因子為:由血管內(nèi)皮細(xì)胞、間葉系細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的因子；由間葉系細(xì)胞分泌的因子；由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞這二者存在而分泌的因子。
10.權(quán)利要求1~9中·任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其將器官細(xì)胞和選自下述的至少I種細(xì)胞和/或因子一起接種于凝膠上進(jìn)行培養(yǎng)，所述的細(xì)胞和/或因子選自由血管內(nèi)皮細(xì)胞、間葉系細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的因子；由間葉系細(xì)胞分泌的因子；由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和間葉系細(xì)胞這二者存在而分泌的因子。
11.權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞是分化的細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞是未分化的細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1~12中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中間葉系細(xì)胞是分化的細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1~12中任一項(xiàng)所述的器官芽的制作方法，其中間葉系細(xì)胞是未分化的細(xì)胞。
15.組織或器官的制作方法，其包括將由權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的方法制作的器官芽移植進(jìn)非人動(dòng)物而分化為組織或器官。
16.器官芽的移植方法,其包括將由權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的方法制作的器官芽移植進(jìn)人或非人動(dòng)物。
17.權(quán)利要求16所述的器官芽的移植方法，其中器官芽的移植部位選自:顱內(nèi)、腸系膜、肝臟、脾臟、腎臟、腎被膜下、門靜脈上。
18.組織或器官的再生或功能恢復(fù)方法，其包括將由權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的方法制作的器官芽移植到人或非人動(dòng)物，分化為組織或器官。
19.非人嵌合體動(dòng)物的制作方法，其包括將由權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的方法制作的器官芽移植進(jìn)非人動(dòng)物而分化為組織或器官。
20.評(píng)價(jià)藥劑的方法，其使用選自由權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的方法制作的器官芽、由權(quán)利要求15所述的方法制作的組織及器官、以及由權(quán)利要求19所述的方法制作的非人嵌合體動(dòng)物 的至少一種。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103857787SQ201280047078
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月27日
【發(fā)明者】谷口英樹(shù), 武部貴則 申請(qǐng)人:公立大學(xué)法人橫濱市立大學(xué)