來自患者的誘導性多能干細胞的心肌細胞及其使用方法
【專利摘要】使獲自患遺傳性心臟疾病個體的人體細胞重編程成為誘導性多能干細胞(iPS細胞)，并且分化為用于分析、篩選程序等應(yīng)用的心肌細胞。
【專利說明】來自患者的誘導性多能干細胞的心肌細胞及其使用方法
[0001]聯(lián)邦資助研究與開發(fā)
[0002]本發(fā)明是在國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)授予的合同HL099776下于政府資助下完成。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0003]多種心臟病具有潛在的遺傳病因。例如，擴張型心肌病(DCM)是一種特征為心室擴張和心臟收縮障礙的心臟病。DCM是排在冠狀動脈疾病和高血壓之后最常見的心力衰竭的病因，并且是心臟移植的主要指示。僅在美國，控制DCM的花費已被估計為40億-100億美元。治療的另一種重要病癥是肥大型心肌病(HCM)，其中肌節(jié)復制導致心肌細胞在尺寸上增加。另外，心肌細胞的正常排列被打亂，這種現(xiàn)象稱為心肌混亂(myocardial disarray)。由于9個肌芐基因中有I個突變，因而HCM是最常見的。
[0004]編碼肌節(jié)蛋白、細胞骨架蛋白、線粒體蛋白和核膜蛋白以及鈣代謝相關(guān)蛋白質(zhì)的基因中的突變與大約三分之一到一半的DCM病例相關(guān)聯(lián)。心臟肌鈣蛋白T(cTnT)是肌鈣蛋白復合物(肌鈣蛋白T、C和I)的3個亞基之一，該肌鈣蛋白復合物調(diào)節(jié)心肌細胞(CM)中肌節(jié)細肌絲的活性以及肌肉收縮。CTnT對于肌節(jié)組裝、收縮和力量產(chǎn)生是必需的。心臟肌鈣蛋白T基因(TNNT2)中的突變常導致DCM，并且常常表達為關(guān)于在幼年時心臟性猝死和心力衰竭的惡性表型。體外生物化學研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)導致力量產(chǎn)生受損的Ca2+敏感性和/或ATP酶活性降低可能是某些TNNT2-突變誘導的DCM的潛在機制。
[0005]TNNT2 突變的小鼠模型涵蓋了人DCM表型并且提供對于該疾病的可能機制的更廣泛認識。然而，在小鼠模型和人模型之間存在幾種差異。例如，小鼠靜息心率比人快約10倍。小鼠CM的電特性、離子通道貢獻和心臟發(fā)育也與人不同。體外生化試驗中的心肌細胞內(nèi)復雜細胞內(nèi)互相作用的缺乏和小鼠模型的物種差異，削減了這些方法對于理解DCM的細胞和生理學過程以及藥物篩選的價值。
[0006]另外，很難得到來自DCM患者的心臟組織并且該組織不能在長期培養(yǎng)中存活。人們對將擴張型心肌病和其它遺傳心臟病癥的有效細胞模型用于篩選和開發(fā)有效的治療方法有很大興趣。
[0007]藥品發(fā)現(xiàn)是一個數(shù)十億美元的產(chǎn)業(yè)，其包括治療靶標的鑒定和驗證，以及先導化合物的鑒定和優(yōu)化。在最近幾年中，由基因組學和組合化學方法產(chǎn)生的潛在新靶標和化學實體數(shù)量激增對篩選程序施加了很大的壓力。雖然對有用藥物鑒定的回報是巨大的，但是從任何篩選程序命中的百分比一般都很低。理想的化合物篩選方法同時通過如下方式解決這一問題:允許高通量，從而能夠測試很多個體化合物；以及提供生物學相關(guān)的信息，使得篩選試驗產(chǎn)生的信息與化合物的藥效良好關(guān)聯(lián)。
[0008]對于藥效而言，一些更重要的特征是針對靶向細胞或疾病的特異性、在相關(guān)劑量下無毒，以及所述化合物對于其分子靶標的特定活性。本發(fā)明解決了這一問題。
[0009]出版物。使靈長類的分化的體細胞重編程成多能狀態(tài)的方法包括分化體細胞的核轉(zhuǎn)移、分化體細胞與多能干細胞的融合以及直接重編程，來產(chǎn)生誘導性多能干細胞 QPS 細胞)(Takahashi K 等，(2007)Celll31: 861-872 ；Park IH 等，(2008)Nature451: 141-146 ；Yu J 等，(2007) Science318: 1917-1920 ；Kim D 等，(2009) CellStem Cell4: 472-476 ；Soldner F 等，(2009) Cell.136: 964-977 ；Huangfu D 等，(2008)Nature Biotechnology26: 1269-1275 ；Li W 等，(2009)Cell Stem Cell4: 16-19)。
[0010]感興趣的其它出版物包括Stadtfeld 等，Science322,945-949 (2008) ;0kita 等，Science322,949-953(2008) ；Kaji 等，Nature458,771-775 (2009) ；Soldner 等，Celll36,964-977 (2009) ；ffoltjen 等，Nature458, 766-770 (2009) ；Yu 等，Science (2009)。
[0011]發(fā)明概述
[0012]提供用于心肌細胞的疾病相關(guān)篩選的組合物和方法，供于治療性藥物和治療方案，其中該方法采用體外細胞培養(yǎng)或其衍生的動物模型。特別感興趣的疾病包括擴張型心肌病(DCM)、肥大型心肌病(HCM)、蒽環(huán)類抗生素誘導的心臟中毒、心律失常性右心室發(fā)育不良(ARVD)、左心室致密化不全(LVNC)、左心室雙入口(DILV)以及長QT(1型)綜合征(LQT-1)，其中該疾病存在遺傳基礎(chǔ)。該方法采用誘導性人多能干細胞(iPS細胞)，所述iPS細胞可獲自患者或載體細胞樣品(例如脂肪細胞、成纖維細胞等)。
[0013]在本發(fā)明的一些實施方式中，提供了疾病相關(guān)心肌細胞的體外細胞培養(yǎng)，其中從誘導性人多能干細胞(iPS細胞)分化心肌細胞，所述iPS細胞包含編碼心臟病相關(guān)突變的至少一種等位基因。感興趣的突變包括以下基因中的突變:心臟肌鈣蛋白T(TNNT2);肌球蛋白重鏈(MYH7);原肌球蛋白I(TPMl);肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MYBPC3) ;5' -AMP-活化的蛋白激酶亞基Y_2(PRKAG2) ;3型肌鈣蛋白I (TNNI3);肌聯(lián)蛋白(TTN);肌球蛋白，輕鏈2 (MYL2);肌動蛋白，α心肌I (ACTCl);電壓門控性鉀通道，KQT-樣亞家族，成員I(KCNQl)；斑菲素蛋白2(plakophilin2) (PKP2);以及心臟UM蛋白(CSRP3)。感興趣的特定突變包括但不限于 MYH7R663H 突變、TNNT2R173W、PKP22013delC 突變、PKP2Q617X 突變和 KCNQ1G269S錯義突變。
[0014]在一些實施方式中，提供一組這樣的心肌細胞，其中該組包含兩種或更多種不同的疾病相關(guān)心肌細胞。在一些實施方式中，提供一組這樣的心肌細胞，其中使所述心肌細胞接觸多種候選試劑，或候選試劑的多個劑量。候選試劑包括小分子，即，增加或減少感興趣的RNA的表達、電學變化等的藥物、基因構(gòu)建體。在一些實施方式中，疾病相關(guān)心肌細胞被引導或誘導在體內(nèi)環(huán)境中從iPS細胞分化，例如作為動物模型中的外植體。在一些實施方式中，一組是指采用患者特異性心肌細胞的系統(tǒng)或方法，所述心肌細胞來自兩種或更多種不同的心臟病癥，并且可以是三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種不同的病癥，其中所述病癥選自:擴張型心肌病(DCM)、肥大型心肌病(HCM)、蒽環(huán)類抗生素誘導的心臟中毒、心律失常性右心室發(fā)育不良(ARVD)、左心室致密化不全(LVNC)、左心室雙入口 (DILV)以及長QT(1型)綜合征(LQT-1) ?
[0015] 在本發(fā)明的一些實施方式中，提供用于測定候選試劑對疾病相關(guān)心肌細胞的活性的方法，該方法包括:將所述候選試劑與一種或一組分化自誘導性人多能干細胞(iPS細胞)的心肌細胞接觸，所述多能干細胞包含編碼心臟病相關(guān)突變的至少一種等位基因；和，測定該試劑對于形態(tài)、遺傳或功能參數(shù)的影響，所述參數(shù)包括但不限于鈣瞬變幅度、細胞內(nèi)Ca2+水平、細胞尺寸收縮力產(chǎn)生、搏動速率、肌節(jié)α-輔肌動蛋白分布和基因表達譜。人們對單細胞水平的分析方法特別感興趣，例如原子力顯微鏡、微電極陣列記錄、膜片鉗、單細胞PCR和鈣成像等。
[0016]在所述疾病是DCM的情況中，可以在與候選試劑接觸前、中或后通過正性肌力壓力(positive inotropic stress)(如β -腎上腺素激動劑)來刺激心肌細胞。在一些實施方式中，所述β_腎上腺素激動劑是去甲腎上腺素。本文顯示DMC心肌細胞具有響應(yīng)正性肌力壓力的初始正性變時作用，其之后變成以衰竭為特征的負性作用，所述衰竭特征如搏動速率減小，收縮減弱和具有異常肌節(jié)α-輔肌動蛋白分布的細胞顯著增多。β-腎上腺素阻斷劑處理和肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶(Serca2a)的過表達改善所述功能。DCM心肌細胞也可以用通路中的遺傳物質(zhì)來測試，所述遺傳因子包括促進心臟發(fā)生的因子、整聯(lián)蛋白和細胞骨架信號傳導以及泛素化通路，如表8所示。相比相同家族組群中的對照健康個體，DCM心肌細胞展現(xiàn)出減小的鈣瞬變幅度、減弱的收縮和異常肌節(jié)α -輔肌動蛋白分布。
[0017]在所述疾病是HCM的情況中，可以在與候選試劑接觸前、中或后通過正性肌力壓力(如腎上腺素激動劑)來刺激心肌細胞。在這種情況下，HCM心肌細胞展現(xiàn)出較高的肥大反應(yīng)，這能夠通過腎上腺素阻斷劑來逆轉(zhuǎn)。相比健康個體，HCM心肌細胞展現(xiàn)出細胞大小增大和HCM相關(guān)基因的上調(diào)，以及較不規(guī)律的收縮(以不完全搏動為特征)，包括較高頻率的異常Ca2+瞬變(以次級不完全瞬變(secondary immature transient)為特征)。這些心肌細胞的細胞內(nèi)Ca2+水平升高，并且在一些實施方式中，靶向鈣依賴磷酸酶或其它鈣粘附相關(guān)靶標的候選試劑。
[0018]同時提供包含編碼心臟病相關(guān)突變的至少一種等位基因的多能干細胞群。感興趣的突變包括以下基因中的突變:心臟肌鈣蛋白T(TNNT2);肌球蛋白重鏈(MYH7);原肌球蛋白I(TPMl);肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MYBPC3) ;5' -AMP-活化的蛋白激酶亞基Y-2 (PRKAG2)；3型肌鈣蛋白I(TNNI3);肌聯(lián)蛋白(TTN);肌球蛋白，輕鏈2 (MYL2);肌動蛋白，α心肌I (ACTCl);電壓門控性鉀通道，KQT-樣亞家族，成員I (KCNQl);斑菲素蛋白2 (ΡΚΡ2);以及心臟LM蛋白(CSRP3)。感 興趣的特定突變包括但不限于:MYH7R663H突變、TNNT2R173W、PKP22013delC突變、PKP2Q617X突變和KCNQ1G269S錯義突變。所述多能干細胞群可以細胞培養(yǎng)物形式提供，可任選地以無飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)物形式提供。不同體細胞都可用作iPS細胞的來源；特別感興趣的是脂肪源性的干細胞、成纖維細胞等。由此衍生的多能細胞和心肌細胞可用于移植，用于實驗性評估，作為譜系或細胞特異性產(chǎn)物的來源等。閱讀以下更完整描述的主題方法和組合物細節(jié)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本發(fā)明的這些和其他目的、優(yōu)點和特征。
[0019]附圖簡要說明
[0020]圖1.患者特異性DCM iPSC的產(chǎn)生。(a)在該研究中募集的7名DCM家族成員的譜系示意圖。實心方塊(男性)和圓圈(女性)代表1號染色體上的兩個等位基因之一中攜帶特定TNNT2R173W突變的個體。(b)通過PCR和DNA測序確定R173W點突變存在于DCM患者的TNNT2基因的外顯子12上。C0N，對照。(c)從皮膚活檢擴增的源自患者的皮膚成纖維細胞的代表性圖像。(d)ESC-樣和(e)用Yamanaka因子使源自患者的皮膚成纖維細胞重編程獲得的TRA-1-60陽性集落的代表性圖像。(f)患者皮膚成纖維細胞衍生的iPSC的免疫熒光染色和堿性磷酸酶染色。(g)針對患者特異性iPSC中的0ct4和Nanog的啟動子區(qū)域上的甲基化狀態(tài)的定量亞硫酸氫鹽焦磷酸測序分析。在患者特異性iPSC中，Nanog和0ct4啟動子區(qū)域都是高度去甲基化的。(h)由注射進入免疫缺陷小鼠的腎小囊的患者特異性iPSC衍生的畸胎瘤顯示全部3種胚層的組織。標尺，200 μ m。
[0021]圖2.在NE處理之后，DCM iPSC_CM展現(xiàn)出具有異常肌節(jié)α-輔肌動蛋白分布和早期衰竭的細胞數(shù)目明顯較高。(a)在分化后30天對肌節(jié)α-輔肌動蛋白和cTnT進行免疫染色。單個DCM iPSC-CM展現(xiàn)出點狀肌節(jié)α-輔肌動蛋白分布圖案，這表明混亂的肌絲結(jié)構(gòu)。合并的顯微照片的方框區(qū)的放大圖顯示細胞中α-輔肌動蛋白和cTnT的詳細染色圖案。標尺，20 μ m。(b)與對照iPSC-CM (η = 368)相比，明顯較高百分比的DCM iPSC-CM (η = 391)在超過總細胞面積的四分之一中顯示點狀肌節(jié)α-輔肌動蛋白染色圖案(**p=0.008)。(c)在對照(η = 36)和DCM iPSC-CM (η = 39)之間沒有觀察到細胞尺寸的顯著差異。(d)追蹤隨時間變化的收縮性質(zhì)的代表性的MEA試驗，所述收縮性質(zhì)是用NE處理或不用NE處理的對照(η = 14)和DCM(η = 14)搏動ΕΒ。在雙室MEA探針中接種ΕΒ，一側(cè)用NE處理，另一側(cè)不用NE處理。在實驗中同時記錄電信號。使搏動頻率針對不用NE處理的EB的搏動頻率進行標準化。(e)通過視頻成像的，在NE處理之后隨時間變化的經(jīng)標準化的CM簇的搏動頻率(η = 10)。(f)在NE處理7天之后，對單個對照和DCM iPSC-CM進行肌節(jié)α -輔肌動蛋白免疫染色的代表性圖片。與對照相比，長期的NE處理顯著惡化了 DCM細胞的肌節(jié)組織。標尺，20 μ m。(g)用NE處理(對照，η = 210 ；DCM, η = 255)或不用NE處理(對照，η = 261 ；DCM, η = 277)的，具有混亂肌節(jié)染色圖案的CM的百分比。NE處理顯著增加了在DCM組中混亂CM的數(shù)量(**p < 0.001)，并且對于對照iPSC-CM(*p=0.05)的效果不太顯著。(h)追蹤在NE處理之后iPSC-CM隨時間的形態(tài)變化和收縮性變化。標尺，200 μ m。數(shù)據(jù)以平均值土標準誤表不。
[0022]圖3.DCM iPSC-CM展現(xiàn)出較小的[Ca2Ii瞬變。(a)在對照(左)和DCMiPSC-CM(右)中的代表性線性掃描圖像和(b)自發(fā)鈣瞬變。(c)在對照和DCMiPSC-CM中自發(fā)鈣瞬變的頻率。(d)在對照和DCM iPSC-CM中[Ca2+] 變的整合顯示相對于對照細胞，在DCM中每次 瞬變釋放的Ca2+較少(對照，η = 87細胞；DCM，η = 40, **P=0.002)。在對照和DCM細胞之間，(e)節(jié)律的不規(guī)則性(標準偏差/平均值)或⑴自發(fā)鈣瞬變的幅度沒有顯著的差異。
[0023]圖4.Serca2a的過表達恢復了 DCM iPSC-CM的收縮性。(a)在腺病毒轉(zhuǎn)導DCMiPSC-CM之后Serca2a表達的Western印跡。在用Ad.Serca2a轉(zhuǎn)導的細胞中Serca2a蛋白水平上調(diào)，但在用Ad.GFP轉(zhuǎn)導的細胞中Serca2a蛋白水平?jīng)]有上調(diào)。(b)顯示AFM懸臂靠近GFP陽性的單個搏動CM的代表性圖像。標尺，50 μ m。(c)通過AFM測量的超過100-400次搏動的所有單個iPSC-CM的收縮力的直方圖。Serca2a的過表達明顯將DCM iPSC-CM的收縮力恢復至接近對照的水平。(d)由AFM測量的單個CM的平均收縮力的點圖。單向ANOVA分析表明在所有組的平均值之間存在顯著差異(#p=0.002)。徒吉(Tukey)多重比較檢驗表明相比用 Ad.GFP(η=17)的轉(zhuǎn)導，對照 iPSC-CM(η=13) (P=0.001)和 Ad.Serca2a(n=12)(P=0.005)轉(zhuǎn)導的DCM iPSC-CM展現(xiàn)出顯著更強的收縮力。Ad.Serca2a轉(zhuǎn)導的DCM iPSC-CM顯示與對照iPSC-CM相當?shù)氖湛s力(ρ=0.578)。(e)在分別用Ad.GFP和Ad.Serca2a轉(zhuǎn)導的單個DCM iPSC-CM中的代表性自發(fā)鈣瞬變。(f)與用Ad.GFP轉(zhuǎn)導的細胞(n=14)相比，用Ad.Serca2a轉(zhuǎn)導的DCM iPSC-CM (n=22)展現(xiàn)出增加的全鈣瞬變(*ρ=0.04)(雙尾斯氏t檢驗)。(g)在 Ad.Serca2a (n=40)或 Ad.GFP (n=40)過表達的 DCM iPSC-CM 中，具有混亂肌節(jié)染色圖案的CM的百分比。在兩組之間沒有觀察到顯著的差異(雙尾斯氏t檢驗)。數(shù)據(jù)表示為平均值土標準誤。
[0024]圖5.在源自家族中DCM患者的iPSC中的R173W突變。TNNT2的基因座的基因組PCR和DNA測序表明來自所有DCM患者的iPSC攜帶R173W(C到T)突變。
[0025]圖6.通過微陣列比較人ESC (H7)、皮膚成纖維細胞和患者特異性iPSC的全mRNA表達模式。皮爾森相關(guān)和散點圖都表明患者特異性iPSC的全基因表達圖案與人ESC的全基因表達圖案高度相似。
[0026]圖7.在擴展培養(yǎng)(extended culture)之后，患者特異性iPSC保持正常的核型。顯示培養(yǎng)20代之后的來自兩種DCM iPSC細胞系的代表性圖像。
[0027]圖8.總量相對內(nèi)源性Yamanaka重編程因子的相對表達水平的定量PCR。通過比較各重編程因子的總基因表達水平與內(nèi)源性基因表達水平，在大多數(shù)已建立的患者特異性iPSC中，外源性轉(zhuǎn)基因0ct4、Sox2、Klf4和c_MYC被沉默。在所有患者特異性iPSC中，內(nèi)源性Nanog表達被上調(diào)，這表明各細胞系的多能性狀態(tài)。注:使Nanog表達水平針對H7人ESC的Nanog表達水平進行標準化(未顯示)。用于定量PCR的引物信息列于補充表6中。
[0028]圖9.患者特異性iPSC在體外能夠分化為來自3種胚層的細胞。從所有患者特異性iPSC的自發(fā)分化中檢測到不同的細胞類型，如神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、血紅細胞，和表達中胚層標記物平滑肌肌動蛋白(SMA)的細胞、表達內(nèi)胚層標記物甲胎蛋白(AFP)的細胞以及表達外胚層標記物(Tuj-1)的細胞。標尺，100 μ m。
[0029]圖10.患者特異性iPSC的相對心臟分化效率。心臟分化效率表示為搏動EB的百分比(就細胞系而言n=3，數(shù)據(jù)以平均值土標準誤表示)。
[0030]圖11.在衍生自對照和DCM iPSC的搏動EB中cTnT陽性CM的百分比的FACS分析。在搏動EB中約50-60%的細胞是cTnT陽性心肌細胞。
[0031]圖12.DCM和對照iPSC-CM中野生型(Wt)和突變體(R173W)TNNT2表達的等位基因特異性PCR。確定了患者IIa、IIb和IIIa在他們各自的iPSC-衍生的CM中表達突變體TNNT2。用于等位基因PCR的引物列于補充表6中。
[0032]圖13.檢測iPSC-衍生的搏動EB的電生理性質(zhì)的多重電極陣列(MEA)。(a)MEA探針和接種的4種搏動EB的代表性圖像。(b)通過(a)中所示的4種搏動EB的MEA反射場電位記錄的電信號。(c)顯示場電位時程(FPD)、最大正幅度(MPA)、最大負幅度(MNA)和峰電位間隔(ISI)的提取的MEA場電位照片。
[0033]圖14.分析在分化后30天時24個對照和24個DCM iPSC-CM中基因表達水平的單細胞PCR。分析了相對于α-微管蛋白的基因表達水平的(a)心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子，(b)鈣操作相關(guān)蛋白，(C)離子通道，(d)肌節(jié)蛋白和(e)骨骼肌特異性蛋白的基因表達。在對照和DCM CM之間沒有觀察到顯著的差異。數(shù)據(jù)以平均值土標準誤表示。使用雙尾斯氏t檢驗檢驗統(tǒng)計學差異。
[0034] 圖15.1PSC-CM表達的心臟特異性蛋白。對照和DCM iPSC_CM都表達心臟特異性蛋白肌節(jié)α-輔肌動蛋白、cTnT、連接蛋白43和MLC2a。箭頭表示在細胞-細胞接觸處的連接蛋白43的陽性染色。標尺，20μπι。
[0035]圖16.圖2a中所示的單個CM中肌節(jié)α -輔肌動蛋白和cTnT的免疫染色的放大圖。標尺,20 μ m。
[0036]圖17.圖2f中所示的在單個CM中肌節(jié)α -輔肌動蛋白和cTnT的雙免疫染色。標尺，20 μ m。
[0037]圖18.圖2f中所示的各細胞的合并照片的放大圖。應(yīng)注意的是在NE處理之后，一些單個DCM iPSC-CM顯示肌絲的完全變性，這在對照CM中未觀察到。標尺，20 μ m。
[0038]圖19A-C.單個DCM iPSC-CM對比對照iPSC-CM的實時PCR顯示在NE處理一周后的基因表達變化。在分化后19天時對照和DCM iPSC-CM接種在培養(yǎng)盤上，并且在48小時后用或不用10 μ M NE處理，持續(xù)7天。挑取來自對照(用NE處理，η = 8 ;不用NE處理，η=8)和DCM (用NE處理，η = 8 ;不用NE處理，η = 8) iPSC的單個CM，并且如方法部分所述來實施PCR。第一次計算在用NE處理和不用NE處理的細胞之間的凈循環(huán)閾值(CT)。然后數(shù)據(jù)表示為相對于對照組凈CT值的DCM組的凈CT值。在NE處理之后，基因被分為上調(diào)基因(CT中> I的循環(huán)差異)，下調(diào)基因(CT中> I的循環(huán)差異)和沒有表達變化的基因(CT中< I的循環(huán)差異)。
[0039]圖20.通過膜片鉗測量的iPSC-CM的電生理特征。(a)在對照和DCMiPSC-CM中都觀察到3種類型的自發(fā)AP (左:心室樣；中:心房樣；右:節(jié)點樣)。估計70-80%的細胞是心室樣CM，而其它是心房樣細胞和/或節(jié)點樣細胞。對照和DCM iPSC之間的心臟命運沒有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。(b)通過電流鉗記錄對照和DCM心室肌細胞的自發(fā)AP。與對照細胞相比，DCM心室細胞具有稍短的AP(P=0.112) (c)。在測量的時點上(分化后19天-25天)，對照和DCM細胞之間在頻率(d)，AP的峰幅度(e)或靜息膜電位(f)上沒有顯著差異(對照，n=18 ；DCM, n=17)。使用雙尾斯氏t檢驗檢驗統(tǒng)計學差異。
[0040]圖21.1PSC-CM的收縮力的原子力顯微鏡(AFM)測量。(a)在單個心肌細胞水平上，AFM的力測量的方法示意圖。(b)顯示AFM懸臂探測單個心肌細胞的代表性圖像。標尺，20μπι。(c)顯示通過AFM得到的信號和檢測的參數(shù)(力、頻率和搏動時程)的代表性照片。
[0041]圖22.通過AFM測量的，單個iPSC_CM的搏動頻率和時程。(a)通過AFM測量的平均搏動頻率的點圖。在對照iPSC-CM (η = 13)、Ad.Serca2a (n=12)和Ad.GFP (n=17)轉(zhuǎn)導的DCM iPSC-CM之間沒有觀察到搏動頻率和節(jié)奏中的顯著差異。(b)通過AFM測量的平均搏動時程的點圖。Serca2a的過表達顯著縮短了搏動時程(*p=0.029)。使用單向ANOVA然后使用徒吉多重比較檢驗來檢驗統(tǒng)計學差異。通過AFM所測量的，所有單個iPSC-CM的超過100-400次搏動的(c)搏動頻率和(d)搏動時程的直方圖。
[0042]圖23.通過AFM所測量的，各個單細胞的相對細胞大小對比收縮力的點圖。在(a)對照(R2=0.006)、(b)DCM/DCM-Ad.GFP (R2=0.105)和(c)DCM-Ad.Serca2a(R2=0.061)組中細胞大小和收縮力之間沒有明顯的線性關(guān)系。
[0043]圖24.在Serca2a和GFP過表達之后，在培養(yǎng)盤中搏動點(beating focus)的經(jīng)標準化的百分比。數(shù)據(jù)表示實驗的3次獨立重復的平均數(shù)(平均值土標準誤)。
[0044]圖25.對于用Ad.Serca2a或Ad.GFP腺病毒轉(zhuǎn)導的iPSC_CM，使用紅色熒光Ca2+指示物Rhod-2AM進行Ca2+成像。(a)合并的共焦圖像顯示GFP陽性CM攝入Rhod_2染料。(b)對于(a)中的相同細胞沿圖中所示的箭頭線掃描。(C)記錄在(a)和(b)中所示的特定CM的線掃描圖像。標尺，20 μ m。
[0045]圖26.通過AFM測量的，用Ad.Serca2a或Ad.GFP轉(zhuǎn)導的對照iPSC-CM的收縮性。Ad.Serca2a(n=10)或Ad.GFP(n=10)轉(zhuǎn)導的對照iPSC-CM的(a)收縮力、(b)搏動頻率和(C)搏動時程的點圖。在每組的平均值之間沒有觀察到統(tǒng)計學顯著差異。使用雙尾斯氏t檢驗檢驗統(tǒng)計學差異。通過AFM測量的所有單個對照iPSC-CM的100-400次搏動的(d)收縮力、(e)搏動頻率和(f)搏動時程的直方圖。
[0046]圖27.具有Serca2a過表達特征的富集通路的DCM iPSC-CM的基因表達譜，所述富集通路可能在拯救DCM表型中發(fā)揮作用。(a)與沒有用Serca2a處理的DCM iPSC_CM相t匕，在對照iPSC-CM和用Serca2a-處理的DCM iPSC-CM的生物學重復中，表達水平上超過1.5倍差異的191個基因的熱圖。(b)可能涉及通過Serca2a過表達來拯救DCM表型的富集通路的熱圖。
[0047]圖28.美托洛爾處理改善了 DCM iPSC-CM的肌節(jié)組織并且減輕NE處理的惡化效果。(a) 10 μ M美托洛爾處理增加了具有完好的肌節(jié)完整性的DCM iPSC-CM的數(shù)量(未處理的，n=100 ;處理的，n=86, *p=0.023)。(b)美托洛爾處理防止由NE處理誘導的DCMiPSC-CM的惡化。與沒有美托洛爾處理的細胞(n=108)相比，I μ Μ(η=107，**ρ=0.008)和10 μ Μ(η=101，**ρ=0.001)美托洛爾都能顯著減少混亂細胞的數(shù)量。(c) 10 μ M美托洛爾處理對于對照iPSC-CM的肌節(jié)完整性沒有顯著的效果(未處理的，n=88 ;處理的，n=75)。數(shù)據(jù)以平均值土標準誤表示。使用雙尾斯氏t檢驗檢驗統(tǒng)計學差異。
[0048]圖29.DCM iPSC-EC和對照iPSC_EC的相似功能性質(zhì)。(a) FACS分析表明DCM和對照iPSC向⑶31+EC的分化的效率是相似的。(b)來自分化的DCM和對照iPSC的FACS分離的⑶31+細胞都表達內(nèi)皮細胞標記物⑶31和⑶144。(c)DCM和對照iPSC-衍生的EC展現(xiàn)出低密度脂蛋白(LDL)的攝入能力(紅色熒光)。(d)對照和DCM iPSC-衍生的EC都能夠在基質(zhì)膠表面上形成網(wǎng)狀管。標尺，100 μ m。
[0049]圖30.在DCM iPSC_CM中通過Serca2a基因治療的潛在機制的示意圖。在心臟肌鈣蛋白T中的突變負面影響收縮性、肌節(jié)形成和鈣信號傳導，這造成該鈣相關(guān)基因(如肌集鈣蛋白、NFAT和TRIC通道)中的變化。然而，在TNNT2R173W DCM iPSC-CM中，電激發(fā)是正常的。Serca2a、SR/ER膜鈣泵的遞送恢復了鈣操作分子的水平，逆轉(zhuǎn)了減小的鈣瞬變和收縮性，從而改善DCM iPSC-CM的整體功能。cTnT，心臟肌鈣蛋白T ；LTC, L-型鈣通道；RyR，雷諾定(Ryanodine)受體韓釋放通道；CSQ,肌集韓蛋白；PM,質(zhì)膜。
[0050]圖31A-M.患者特異性HCM iPSC_CM的產(chǎn)生和表征。(A)先征者和對照匹配家族成員在收縮末期和舒張末期的代表性長軸MRI圖像，證明下壁的不對稱肥大。(B)通過PCR和序列分析對HCM患者(11-1、111-1、111-2、II1-3和II1-8)中MYH7基因的外顯子18上的Arg663His錯義突變進行確證。(C)本研究募集的在MYH7中攜帶Arg663His突變的先征者(I1-1)及其丈夫(I1-2)以及8個孩子(II1-1到II1-8)的譜系示意圖。圓圈代表女性家族成員而方塊代表男性。實心標志表示HCM表型的臨床表現(xiàn)，而空心標志代表沒有表現(xiàn)。在家族成員之下的“ + ”和符號分別表示Arg663His突變的存在和不存在。發(fā)現(xiàn)2個個體(II1-3和II1-8)攜帶Arg663His突變，但是由于年齡年輕，所以還沒有表現(xiàn)出HCM表型。(D)心臟肌鈣蛋白T和F-肌動蛋白的代表性免疫染色證明與對照iPSC-CM相比，在HCM iPSC-CM中增加的細胞大小和多核化現(xiàn)象。(E)在心臟分化誘導之后40天，對4種對照iPSC-CM 細胞系(11-2，111-4，111-6，II1-7)(每名患者細胞系 n=55)和 4 種 HCM iPSC-CM細胞系(11-1，111-1，111-2，II1-8)(每名患者細胞系n=59)的的細胞大小定量。(F)對對照(n=55，4名患者細胞系)和HCM iPSC_CM(n=59，4名患者細胞系)中多核化的定量。(G)代表性的免疫熒光染色揭示了與對照相比，HCM iPSC-CM中ANF的表達升高。(H)在心臟分化誘導之后20天、30天和40天時，由單細胞定量PCR所測量的，對照和HCM iPSC-CM中ANF基因表達的變化(每個時間點n=32，5名患者細胞系)。(I)在HCM iPSC-CM和對照中MYH7/MYH6表達比率的定量(每個時間點n=32，5名患者細胞系)。(J)代表性的免疫熒光染色圖像揭示了 HCM iPSC-CM中的NFATC4的核移位。(K)在對照(n=187，5名患者細胞系)和HCM iPSC-CM(n=169，5名患者細胞系)中展現(xiàn)出陽性NFATC4染色的心肌細胞的百分比。(L)在用鈣依賴磷酸酶抑制劑Cs-A和FK506的連續(xù)5天處理之后，對對照和HCM iPSC-CM的細胞大小的定量(n=50，每組5名患者細胞系)。(M)在心臟分化誘導后20天、30天和40天，對單個對照和HCM iPSC-CM中與心臟肥大相關(guān)基因的基因表達的代表性熱圖。*表示HCM對比對照，P < 0.05 表示HCM對比對照，P < 0.0OOl0
[0051]圖32A-N.對HCM iPSC_CM中心律失常和不規(guī)則Ca2+調(diào)節(jié)的評估。(A)由電流鉗模式中的膜片鉗所測量的，對對照和HCM iPSC-CM中的自發(fā)動作電位的電生理測量。方框中表示在延長的時間尺度下HCM iPSC-CM波形的劃線部分，顯示有DAD-樣心律失常。(B)對對照(n=144，5名患者細胞系)和HCM iPSC_CM(n=131，5名患者細胞系)中DAD出現(xiàn)的定量。DAD比率被定義為總DAD/總搏動。(C)展現(xiàn)出有推定DAD的對照(n=144，5名患者細胞系)和HCM iPSC-CM(n=131，5名患者細胞系)的百分比的定量。⑶在對照和HCMiPSC-CM中的代表性線掃描圖像和自發(fā)Ca2+瞬變。紅色箭頭表明在HCM細胞中而不是在對照中觀察到的快速心律失常樣的波形。(E)在心臟分化誘導后20天、30天和40天時，展現(xiàn)出不規(guī)則Ca2+瞬變的對照和HCM iPSC-CM的百分比的定量(n=50，每個時間點5名患者細胞系)。(F)用驅(qū)動表達野生型MYH7或攜帶Arg663His的突變體MYH7的慢病毒進行穩(wěn)定誘導的H9hESC_CM和hESC-CM的代表性線掃描圖像和自發(fā)Ca2+瞬變。紅色箭頭表示不規(guī)則的Ca2+波形。(G)在WA09hESC-CM、過表達野生型MYH7的hESC-CM和過表達攜帶Arg663His突變的MYH7的hESC-CM中，展現(xiàn)出不規(guī)則Ca2+瞬變的細胞的定量(n=40，每組5名患者細胞系)。⑶對于hESC-CM、過表達野生型MYH7的hESC-CM和過表達攜帶Arg663His突變的MYH7的hESC-CM，由電流鉗模式記錄的自發(fā)動作電位。紅色箭頭表示DAD-樣波形。(I)在hESC-CM、由驅(qū)動表達野生型MYH7或攜帶Arg663His突變的突變體MYH7的慢病毒進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)導的hESC-CM中，展現(xiàn)出DAD-樣波形的細胞的定量(n=20,每組5名患者細胞系)。(J)對于對照(n=122,4名患者細胞系)和HCM iPSC-CM(n=105，4名患者細胞系)，基線Fluo-4Ca2+染料強度的定量。⑷使用Indo-1比率計的Ca2+染料的、對照和HCM iPSC-CM的代表性Ca2+瞬變。(L)通過對對照(n=17，4名患者細胞系)和HCM iPSC-CM(n=26，4名患者細胞系)中Indo-1比率的測量進行靜息Ca2+水平的定量。(M)來自對照和HCM iPSC-CM然后通過咖啡因暴露的代表性Ca2+瞬變蹤跡。(N)在給予咖啡因之后，AF/FO比率的平均峰幅度，代表了對照(n=23，3個細胞系)和HCM iPSC-CM (n=35, 3個細胞系)的SR Ca2+負荷的釋放。*表示HCM對比對照，P < 0.05 表示HCM對比對照，P < 0.01。
[0052] 圖33A-E.由正性肌力壓力所致的HCM表型的惡化。㈧通過β _激動劑異丙基腎上腺素對對照(η=50，5名患者細胞系)和HCM iPSC-CM(η=50，5名患者細胞系)進行肌力刺激，與對照對應(yīng)物相比，這加速了 HCM iPSC-CM中的細胞肥大的出現(xiàn)。共同給予β-阻斷劑普萘洛爾防止了在HCM iPSC-CM中由20鄰苯二酚胺誘導的肥大。(B)在通過異丙基腎上腺素的正性肌力刺激之后，在對照和HCM iPSC-CM中的代表性Ca2+線掃描和波形。黑色箭頭表示異常的Ca2+波形。(C)對于通過異丙基腎上腺素處理和普萘洛爾共同給藥的處理展現(xiàn)出不規(guī)則Ca2+瞬變的對照(n=50，5名患者細胞系)和HCM iPSC-CM(n=50, 5名患者細胞系)的定量。(D)在對照和HCM iPSC-CM中在基線上的自發(fā)動作電位和心律失常的電生理測量，然后是通過異丙基腎上腺素的正性肌力刺激。紅色箭頭表示DAD-樣波形。(E)在給予異丙基腎上腺素之后，對照和HCM iPSC-CM中DAD比率的定量(總DAD/總搏動)。*表示HCM對比對照，P < 0.05 表示HCM對比對照，P < 0.001 ；##表示異丙基腎上腺素+普萘洛爾對比異丙基腎上腺素，P < 0.01。
[0053]圖34.通過維拉帕米處里HCM iPSC-CM顯著減輕了 HCM表型的發(fā)展。(A)從心臟分化誘導后25天開始，用0nM、50nM和IOOnM的L-型Ca2+通道阻斷劑維拉帕米連續(xù)5天處理的HCM iPSC-CM的代表性免疫染色圖像。用維拉帕米處理的HCM iPSC-CM的相對細胞大小的定量(n=50，每個處理組5名患者細胞系)。(B)用0nM、50nM和IOOnM的維拉帕米連續(xù)5天處理的HCM iPSC-CM的代表性Ca2+線掃描圖像和波形。HCM iPSC-CM的百分比的定量展現(xiàn)出在用維拉帕米處理之后，Ca2+瞬變不規(guī)則(n=40，每個處理組5名患者細胞系)。(C)用0nM、50nM和IOOnM的維拉帕米連續(xù)5天處理的HCM iPSC-CM中，自發(fā)動作電位的代表性電生理記錄。在用維拉帕米處理之后，對HCM iPSC-CM21中DAD頻率的定量(n=25，每個處理組5名患者細胞系)。(D)由MYH7中HCM突變引起的HCM表型的發(fā)展的示意圖。紅色框表示減輕疾病發(fā)展的潛在方法。*表示未處理對比50nM維拉帕米處理對比IOOnM維拉帕米處理，P < 0.01。
[0054]結(jié)合附圖，通過以下詳述更好地理解本發(fā)明。
【具體實施方式】
[0055]在描述本發(fā)明組合物和方法之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于所述的具體組合物和方法，因為它們當然可能變 化。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語的目的僅是描述【具體實施方式】，不用來構(gòu)成限制，因為本發(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。
[0056]提供數(shù)值范圍時，也應(yīng)視作具體公開了該范圍的上限和下限之間以下限單位十分之一為間隔的各中間數(shù)值，除非上下文另有明確說明。本發(fā)明還包括設(shè)定范圍內(nèi)任何設(shè)定數(shù)值或中間數(shù)值和該設(shè)定范圍內(nèi)任何其它設(shè)定數(shù)值或中間數(shù)值之間的較小范圍。取決于設(shè)定范圍內(nèi)任何明確排除的限值，所述范圍可獨立地包含或排除這些較小范圍的上下限，本發(fā)明也包括這些較小范圍不包含限值、包含任一或兩個限值的各范圍。設(shè)定范圍包含一個或兩個限值時，本發(fā)明也包括排除所述限值之一個或兩個的范圍。
[0057]除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的通常含義相同。雖然也可采用與本文所述類似或等同的任何方法和材料實施或測試本發(fā)明，但在此描述一些潛在和優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物均通過引用納入本文，以公開和描述與所引用出版物相關(guān)的方法和/或材料。應(yīng)理解，出現(xiàn)抵觸時，用本發(fā)明公開內(nèi)容代替任何本文所納出版物的公開內(nèi)容。
[0058]必須注意到，本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括復數(shù)含義，除非上下文另有明確說明。因此，例如，提到“重編程因子多肽”包括多種這類多肽，提到“誘導的多能干細胞”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種多能干細胞及其等同物，等等。[0059]提供本文討論的出版物僅針對其在本申請?zhí)峤蝗罩暗墓_。本文中所有內(nèi)容均不應(yīng)解釋為承認本發(fā)明不能憑借在先發(fā)明而先于這些出版物。此外，所提供的出版日期可能與實際
【公開日】期不同，這可能需要單獨確認。
[0060]定義
[0061]擴張型心肌病(DCM)是心肌癥的一種，心肌癥是主要影響心肌膜的一組疾病。在DCM中，心肌膜的部分擴張，通常沒有任何明顯的病因。心臟的左心室或右心室收縮泵功能被破壞，導致進行性心臟擴大和肥大，這一過程稱為重塑。雖然在很多情況中沒有明顯病因，但是擴張型心肌病能夠由多種毒性試劑、代謝試劑或感染試劑引起。大約25-35%的患者以家族形式患有疾病，其中大多數(shù)的突變影響編碼細胞骨架蛋白的基因，同時一些突變影響參與收縮的其它蛋白質(zhì)。該疾病具有遺傳異質(zhì)性，但是其傳遞的最常見形式是常染色體顯性模式。涉及DCM的細胞骨架蛋白包括心臟肌鈣蛋白Τ(ΤΝΝΤ2)、α -心臟肌動蛋白、結(jié)蛋白以及核纖層蛋白A和C和各種其它收縮蛋白。
[0062]肥大型心肌病(HCM)是這樣一種病癥，其中肌節(jié)復制造成心肌細胞的大小增加，這導致心肌細胞的增厚。另外，肌肉細胞的正常排列被打亂，這種現(xiàn)象稱為心肌混亂(myocardial disarray)。HCM也造成心臟電學功能的破壞。HCM最常見地歸因于9個肌芐基因之一發(fā)生突變，該突變導致肌節(jié)中的蛋白質(zhì)突變。肌球蛋白重鏈突變與家族性肥大型心肌病的發(fā)展相關(guān)聯(lián)。肥大型心肌病通常以常染色體顯性特征遺傳，有關(guān)于其在以下基因中突變的報道:心臟肌鈣蛋白T(TNNT2);肌球蛋白重鏈(MYH7);原肌球蛋白I(TPMl);肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MYBPC3) ;5' -AMP-活化的蛋白激酶亞基Y-2 (PRKAG2) ;3型肌鈣蛋白I (TNNI3);肌聯(lián)蛋白(TTN);肌球蛋白，輕鏈2(MYL2);肌動蛋白，α心肌I (ACTCl);以及心臟LM蛋白(CSRP3)。在編碼血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的基因中的插入/缺失多態(tài)性改變了該疾病的臨床表型。 ACE的D/D (缺失/缺失)基因型與更顯著的左心室肥大相關(guān)聯(lián)，并且可能與不良結(jié)果的較高風險相關(guān)聯(lián)。
[0063]蒽環(huán)類抗生素誘導的心臟中毒(和對蒽環(huán)類抗生素誘導的毒性的耐受性)。蒽環(huán)類抗生素(如多柔比星)是用于治療白血病、霍奇金淋巴瘤以及乳腺、膀胱、胃、肺、卵巢、甲狀腺和肌肉以及其它器官的實體瘤的一線化療劑。蒽環(huán)類抗生素的主要副作用是心臟中毒，對于很多接受采用這種化療劑的方案的受者而言，其導致嚴重的心力衰竭。
[0064]心律失常性右心室發(fā)育不良(ARVD)。ARVD是心臟橋粒的常染色體顯性疾病，其會導致右心室心律失常以及心臟性猝死。這是僅僅排在肥大型心肌病之后的造成年輕人心臟性猝死的第二大主要原因。
[0065]左心室致密化不全(LVNC，又名非致密化心肌病)。LVNC是遺傳性心臟病，其由在胚胎發(fā)生期間心肌膜(心肌)發(fā)育損傷引起。帶有導致LVNC的突變的患者在生命的早期發(fā)生心力衰竭和有不正常的心臟電生理特性。
[0066]左心室雙入口(DILV)。DILV是先天性心臟缺陷，其中左右心房都輸送進入左心室。結(jié)果是，天生帶有這種缺陷的兒童僅僅有一個有功能的心室，并且難于將氧合的血泵送進入全身循環(huán)。
[0067]長QT(1型)綜合征(LQT-1，KCNQl突變)。長QT綜合征(LQT)是遺傳性心律失常疾病，其中心電圖的QT階段被延長，導致對心律失常和心臟性猝死的易感性增加。有13種已知的基因與LQT相關(guān)。[0068]“多能性”和多能干細胞表示這樣的細胞具有分化成生物體中所有類型細胞的能力。術(shù)語“誘導的多能干細胞”包括多能細胞，像胚胎干細胞(ES)，所述多能細胞能夠長時間培養(yǎng)，并且同時保持分化成生物體中所有類型細胞的能力，但是與ES細胞(ES細胞衍生自胚泡的內(nèi)細胞群)不同的是，所述多能細胞衍生自經(jīng)分化的體細胞，即所述多能細胞具有更縮小、更限定的潛力，并且在沒有實驗操作的情況下不能產(chǎn)生生物體中所有類型的細胞。iPS細胞具有hESC-樣的形態(tài)，以具有更高細胞核-胞質(zhì)比、確定的邊界和顯著細胞核的平板群落生長。另外，iPS細胞能夠表達本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的一種或多種關(guān)鍵的多能性標記物，包括但不限于堿性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、0ct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGFl、Dnmt3b、FoxD3、ffl)F3、Cyp26al、TERI^P zfp42。另外，iPS 細胞能夠形成畸胎瘤。另外，它們能夠形成活生物體中的外胚層、中胚層或內(nèi)胚層組織，或?qū)τ谛纬苫钌矬w中的外胚層、中胚層或內(nèi)胚層組織起作用。
[0069]本文使用“ 重編程因子”是指一種或多種生物活性因子(例如生物活性因子混合物)，其作用在細胞上以改變轉(zhuǎn)錄，從而使細胞重編程為多潛能性(multipotency)或多能性(pluripotency)細胞?？梢韵蚣毎峁┲鼐幊桃蜃樱黾毎鐏碜跃哂懈信d趣心臟病的家族史或遺傳組成的個體的細胞，例如成纖維細胞、脂肪細胞等，該因子能夠單獨提供或以重編程因子的單一組合物(即預先混合的組合物)來提供?？梢韵嗤哪柋然虿煌哪柋葋硖峁┰撘蜃??？梢栽谂囵B(yǎng)本發(fā)明的細胞的過程中一次或多次提供該因子。在一些實施方式中，重編程因子是轉(zhuǎn)錄因子，包括但不限于0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin-28o
[0070]如上所述使體細胞與重編程因子接觸，所述重編程因子以組合形式提供，并且其量足以使所述細胞重編程為多能性細胞。可向體細胞提供單獨的或單一組合物(即重編程因子的預混組合物)形式的重編程因子。在一些實施方式中，以載體上的多種編碼序列的形式提供重編程因子。
[0071]可以為了多種目的向體細胞或體細胞衍生的iPS細胞中導入基因，例如為了取代具有功能缺失突變的基因、提供標記基因等?；蛘?，可引入表達反義mRNA或核酶的載體，從而阻斷不需要的基因的表達?；蛑委煹钠渌椒ㄊ且胨幬锟剐曰蛞允拐Ｗ婕毎哂袃?yōu)勢并經(jīng)受選擇壓力，所述藥物抗性基因例如多重耐藥基因(MDR)或抗凋亡基因如bcl-2。本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)可用于將核酸引入靶細胞，所述技術(shù)例如上述的電穿孔、鈣沉淀DNA、融合、轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、感染等。DNA引入的具體方法對實施本發(fā)明不重要。
[0072]iPS細胞分化為心肌細胞。對骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號傳導的抑制可能導致心臟肌細胞(或心肌細胞)的產(chǎn)生，例如，參見Yuasa等，(2005), Nat.Biotechnol.,23(5): 607-11。因此，在一個示例性實施方式中，在允許形成胚體之前，在頭蛋白存在的情況下培養(yǎng)誘導的細胞約2天-約6天，例如約2天、約3天、約4天、約5天或約6天，并且培養(yǎng)胚體約I周-約4周，例如，約I周、約2周、約3周或約4周。
[0073]能夠通過在培養(yǎng)基中包含心性劑(cardiotropic agent)來促進心肌細胞分化，所述心性劑如活化素A和/或骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(參見本文實施例，Xu等，RegenMed.2011 年 I 月；6 (I): 53-66 ;Mignone 等，Circ J.201074(12): 2517-26 ;Takei 等，Am J Physiol Heart Circ Physiol.2009296(6): H1793-803，所述各文獻皆通過引用明確納入本文)。此類方案的例子還包括，例如可任選地在細胞因子(如BMP4、VEGF和活化素A)存在的情況下加入Wnt激動劑，如Wnt3A ;然后在Wnt拮抗劑(如可溶的卷曲蛋白)存在的情況下培養(yǎng)。然而，可以使用任意合適的誘導心肌細胞分化的方法，例如Fujiwara等，PLoS One.20116(2): el6734 ;Dambrot 等，Biochem J.2011434(1): 25-35 所述的環(huán)孢菌素A ;Foldes等，J Mol Cell Cardiol.201150(2): 367-76所述的等軸周期性拉伸(equiaxial cyclic stretch)、血管緊張素 II 和苯腎上腺素(PE) ;Wang 等，Sci ChinaLife Sc1.201053(5): 581-9所述的抗壞血酸、二甲亞砜和5-氮雜-2'-脫氧胞苷，Chen等，J Cell Biochem.2010111(1): 29-39所述的內(nèi)皮細胞等，所述各文獻皆通過引用明確納入本文。
[0074]在合適的發(fā)育階段收獲細胞，這可以根據(jù)標記物的表達和需要的細胞類型的表型特征來確定，例如約1-4周?？梢酝ㄟ^對感興趣的標志物的存在進行染色、通過形態(tài)學測定來實驗性地測試培養(yǎng)物。可任選地在通過藥物選擇、淘選、密度梯度離心等的正選擇步驟之前或之后富集細胞。在另一個實施方式中，實施負選擇，其中所述選擇基于ES細胞、成纖維細胞、表皮細胞等上發(fā)現(xiàn)的一種或多種標志物的表達。選擇可以采用淘選方法、磁性顆粒選擇、顆粒分選選擇等。
[0075]心肌細胞。在哺乳動物心臟發(fā)育中出現(xiàn)的心肌細胞的表型能夠分為:原代心肌細胞、節(jié)點心肌細胞(nodal cardiomyocyte)、傳導心肌細胞(conducting cardiomyocyte)和工作心肌細胞。使所有具有肌節(jié)和肌漿網(wǎng)(SR)的心肌細胞通過間隙連接偶聯(lián)并且展現(xiàn)出自律性。原始心管(heart tube)的細胞的特征為高度自律性、低傳導速度、低收縮性和低SR活性。這種表型主要在節(jié)點細胞中持續(xù)存在。相反，心房和心室的工作心肌細胞實際上沒有展現(xiàn)出自律性，并且在細胞間良好偶聯(lián)，具有良好發(fā)育的肌節(jié)并且具有高SR活性。來自房室束、束支和外周心室傳導系統(tǒng)的傳導細胞具有發(fā)育不良的肌節(jié)、低SR活性，但是細胞良好偶聯(lián)并且展現(xiàn)出高自律性。
[0076]對于a -Mhc, β -Mhc和心臟肌鈣蛋白I以及慢骨骼肌肌鈣蛋白I，在分化的ES細胞培養(yǎng)中已經(jīng)觀察到發(fā)育轉(zhuǎn)變。通常使用Mlc2v和Anf的表達來分別劃分ES細胞培養(yǎng)中的心室樣細胞和心房樣細胞，雖然在ESDC中，Anf表達并不能排他性地鑒定心房心肌細胞，并且可以用作工作心肌細胞的通用標記物。
[0077]“心肌細胞前體”被定義為能夠產(chǎn)生后代的細胞，所述后代包含心肌細胞。
[0078]除了用作在體外培養(yǎng)的細胞的各種用途以外，可以在合適的動物模型中測試心肌細胞。在一個水平上，評估細胞在體內(nèi)存活和維持它們的表型的能力。向免疫缺陷的動物(如裸小鼠，或化學產(chǎn)生或通過輻射產(chǎn)生的免疫缺陷動物)給予細胞組合物。在一段時間的再生長之后收獲組織，并且評估經(jīng)給予的細胞或其后代是否還存在，并且可以根據(jù)對于感興趣處理的反應(yīng)來進行表型分析。也能夠通過評估用本發(fā)明分化細胞處理之后的心臟恢復程度來確定在動物模型中的適宜性。能夠得到多種動物模型以用于此類測試。例如，能夠通過將預先冷卻的鋁棒與前左心室壁的表面接觸來冷凍損傷心臟(Murry等，J.Clin.1nvest.98: 2209，1996 ;Reinecke 等，CirculationlOO: 193，1999 ;美國專利號6，099，832)。在大型動物中，能夠通過將液體N2中冷卻的30_50mm銅盤探針放置在左心室前壁上約20分鐘來施加冷凍損傷(Chiu等,Ann.Thorac.Surg.60: 12,1995)。能夠通過綁扎左冠狀動脈主干來誘導梗塞(Li等，J.Clin.1nvest.100: 1991,1997)。用本發(fā)明的細胞制劑來處理受傷處，并且通過在損傷區(qū)域中細胞的存在的組織學分析來檢測心臟組織。能夠通過測定參數(shù)(如左心室末端舒張壓、發(fā)展壓、壓力升高速率、壓力降低速率等)來監(jiān)測心臟功能。
[0079]本文所用術(shù)語“療法”、“治療”、“處理”等通常指獲得所需的藥理學和/或生理學作用。從完全或部分防止疾病或其癥狀方面來說，這種作用可以是預防性的，和/或從部分或完全穩(wěn)定或治愈疾病和/或由該疾病產(chǎn)生的不良影響來說，這種作用可以是治療性的。本文所用術(shù)語“治療”包括在哺乳動物(特別是人)中進行的任何疾病治療，包括:(a)在可能易患該疾病或癥狀但尚未診斷患有的對象中防止該疾病或癥狀的發(fā)生；(b)抑制所述疾病癥狀，即阻滯其發(fā)展；或(C)緩解所述疾病癥狀，即引起該疾病或癥狀消退。
[0080]術(shù)語“個體”、“對象”、“宿主”和“患者”在本文中互換使用，指任何需要診斷、處理或治療的哺乳動物對象，尤其是人。
[0081]發(fā)明方法
[0082]提供了獲得和應(yīng)用疾病相關(guān)心肌細胞的體外細胞培養(yǎng)物的方法，其中如上所述，從包含編碼心臟病相關(guān)突變的至少一種等位基因的誘導性人多能干細胞(iPS細胞)分化心肌細胞。感興趣的特定突變包括但不限于:MYH7R663H突變，TNNT2R173W ；PKP22013delC突變；PKP2Q617X突變JPKCNQ1G269S錯義突變。在一些實施方式中，提供了一組這樣的心肌細胞，其中該組包括兩種或更多種不同的疾病相關(guān)性心肌細胞。在一些實施方式中，提供了一組這樣的心肌細胞，其中該心肌細胞經(jīng)受多種候選試劑，或候選試劑的多個劑量。候選試劑包括小分子，例如增加或減少感興趣的RNA表達、電學變化等的藥物、基因構(gòu)建體。
[0083]提供了用于測定候選試劑對疾病相關(guān)心肌細胞的活性的方法，該方法包括:使候選試劑與一種或一組分化自誘導性人多能干細胞(iPS細胞)的心肌細胞接觸，所述多能干細胞包含編碼心臟病相關(guān)突變的至少一種等位基因；和測定該試劑對于形態(tài)學參數(shù)、遺傳參數(shù)或功能參數(shù)的影響，所述參數(shù)包括但不限于:鈣瞬變幅度、細胞內(nèi)Ca2+水平、細胞尺寸收縮力的產(chǎn)生、搏動速率、肌節(jié)α -輔肌動蛋白分布和基因表達譜。
[0084]在所述疾病是DCM的情況中，可以在與候選試劑接觸之前、之中或之后通過正性肌力壓力(如β_腎上腺素激動劑)來刺激心肌細胞。在一些實施方式中，所述β_腎上腺素激動劑是去甲腎上腺素。本文顯示DMC心肌細胞具有響應(yīng)正性肌力壓力的初始正性變時作用，其之后變成以衰竭為特征的負性作用，所述衰竭特征如搏動速率減小，收縮減弱和具有異常肌節(jié)α-輔肌動蛋白分布的細胞顯著增多。β_腎上腺素阻斷劑處理和肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶(Serca2a)的過表達改善所述功能。DCM心肌細胞也可以用通路中的遺傳物質(zhì)來測試，所述遺傳物質(zhì)包括促進心臟發(fā)生的因子、整聯(lián)蛋白和細胞骨架信號傳導以及泛素化通路，如表8所示。相比相同家族組群中的對照健康個體，DCM心肌細胞展現(xiàn)出減小的鈣瞬變幅度、減弱的收縮和異常肌節(jié)α-輔肌動蛋白分布。
[0085]在所述疾病是HCM的情況中，可以在與候選試劑接觸前、中或后通過正性肌力壓力(如腎上 腺素激動劑)來刺激心肌細胞。在種情況下，HCM心肌細胞展現(xiàn)出較高的肥大反應(yīng)，這能夠通過腎上腺素阻斷劑來逆轉(zhuǎn)。相比健康個體，HCM心肌細胞展現(xiàn)出細胞大小增大和HCM相關(guān)基因的上調(diào)，以及較不規(guī)律的收縮(以不完全搏動為特征)，包括較高頻率的異常Ca2+瞬變(以次級不完全瞬變(secondary immature transient)為特征)。這些心肌細胞的細胞內(nèi)Ca2+水平升高，并且在一些實施方式中，靶向鈣依賴磷酸酶或其它與鈣粘附相關(guān)靶標的候選試劑。[0086]在用于小分子的篩選試驗中，用一組細胞和細胞環(huán)境來測試向培養(yǎng)中的細胞添加候選試劑的效果，其中所述細胞環(huán)境包括以下的一種或多種:包括電離度改變的電刺激、藥物刺激等，并且其中細胞組可以在基因型方面、在預先暴露于感興趣環(huán)境方面、在提供的試劑劑量方面不同，其中通常包含至少一個對照，例如陰性對照和陽性對照。通常在無菌環(huán)境中實施細胞的培養(yǎng)，例如，在37°C下在含有92-95%濕潤空氣/5-8% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中?？梢栽诤蟹窍薅ㄉ镆后w(如胎牛血清)的營養(yǎng)混合物中，或在完全限定且不含血清的培養(yǎng)基中進行細胞培養(yǎng)。環(huán)境變化的影響通過監(jiān)測多個輸出參數(shù)(包括形態(tài)學變化、功能變化和遺傳變化)來評估。
[0087]在遺傳物質(zhì)的篩選試驗中，向組中的一種或多種細胞添加多核苷酸來改變所述細胞的遺傳組成。監(jiān)測輸出參數(shù)來確定表型是否變化。通過這種方式，鑒定編碼感興趣通路中的蛋白質(zhì)或影響所述蛋白質(zhì)表達的遺傳序列。可將所得結(jié)果輸入數(shù)據(jù)處理器中一得到篩選結(jié)果數(shù)據(jù)庫。使用算法來比較和分析在不同條件下得到的篩選結(jié)果。
[0088]用于分析的方法包括鈣成像法，其中用合適染料處理細胞，并且在感興趣的條件下使細胞暴露于鈣，并用例如共焦顯微鏡來成像?？梢詫a2+反應(yīng)定量，并且然后針對連續(xù)Ca2+瞬變節(jié)律的不規(guī)則性和每次瞬變中總Ca2+流入來分析時間依賴性的Ca2+反應(yīng)。通過對各波之下相對于基線的面積進行積分來測定每次瞬變中的總Ca2+釋放。
[0089]能夠使用原子力顯微鏡(AFM)來測量收縮力。通過AFM使用懸臂來研究搏動細胞。為了測量力，用懸臂尖端輕觸細胞，然后使懸臂尖端保持在位置上供于間隔，同時收集偏離數(shù)據(jù)。能夠計算力、搏動之間的間隔和各細胞每次收縮的時程的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
[0090]還能夠通過微電極陣列(MEA)來分析細胞，其中將搏動心肌細胞置于MEA探針上，并且測量和確定場電位 時程(FPD)來提供電生理參數(shù)。
[0091]人們對單細胞水平的分析方法特別感興趣，例如上述的:原子力顯微鏡、微電極陣列記錄、膜片鉗、單細胞PCR、鈣成像和流式細胞術(shù)等。
[0092]參數(shù)是高通量系統(tǒng)中細胞的可理想地定量的組分，尤其是可精確測量的組分。參數(shù)也能夠是任何細胞組分或細胞產(chǎn)物，包括細胞表面決定簇、受體、蛋白質(zhì)或者其構(gòu)象或翻譯后修飾、脂質(zhì)、碳水化合物、有機或無機分子、核酸(如mRNA、DNA等)、或源自此類細胞組分的部分或其組合。雖然大多數(shù)參數(shù)會提供定量讀數(shù)，在一些情況中可接受半定量或定性結(jié)果。讀數(shù)可包括單一確定值，或可包括均值、中值或方差等。預期會有差異，因而使用用于提供單一值的常見統(tǒng)計方法的標準統(tǒng)計方法獲得各組測試參數(shù)的數(shù)值范圍。
[0093]感興趣的參數(shù)包括胞質(zhì)、細胞表面或分泌的生物分子、常見生物聚合物例如多肽、多糖、多核苷酸、脂質(zhì)等的檢測。細胞表面和分泌的分子是優(yōu)選的參數(shù)類型，這是因為這些分子介導細胞通訊和細胞效應(yīng)物反應(yīng)并且能夠更易于測定。在一個實施方式中，參數(shù)包括特定表位。通常使用特異性單克隆抗體或受體探針來鑒定表位。在一些情況下，包含表位的分子實體來自兩種或更多種物質(zhì)并且包含確定的結(jié)構(gòu)；例子包括與異二聚體整聯(lián)蛋白相關(guān)的組合決定表位。參數(shù)可以是對特定修飾的蛋白質(zhì)或寡糖的檢測。可以通過特異性單克隆抗體或配體或受體結(jié)合決定簇來限定參數(shù)。
[0094]感興趣的候選試劑是生物活性試劑，其涵蓋許多化學種類，主要是有機分子，其可包括有機金屬分子、無機分子、遺傳序列等。本發(fā)明的一個重要方面是以優(yōu)選的生物反應(yīng)功能來評價候選藥物、選擇治療性抗體和基于蛋白質(zhì)的療法。候選試劑包含與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)相互作用(特別是形成氫鍵)的必要官能團，且通常至少包含至少一個胺、羰基、羥基或羧基基團，常常包含至少兩種化學官能團。所述候選試劑常包含環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，和/或用一個或多個上述官能團取代的芳香結(jié)構(gòu)或多芳香結(jié)構(gòu)。候選試劑也可以選自生物分子，包括肽、多核苷酸、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶，其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合。
[0095]包括藥學上的活性藥物、遺傳活性分子等。感興趣的化合物包括化療劑、消炎劑、激素或激素拮抗劑、離子通道改性劑和神經(jīng)活性劑。適于本發(fā)明的藥劑示例是在“《治療的藥理學基礎(chǔ)》(The Pharmacological Basis ofTherapeutics) ”(Goodman 和 Gilman,麥格勞希爾公司(McGraw-Hill),紐約州紐約，(1996)第9版)中，以下章節(jié)中所述的那些:在突觸和神經(jīng)效應(yīng)器連接位點的藥物作用；心血管藥物；維生素，皮膚病學；以及毒理學，其全文通過引用納入本文。
[0096]測試的化合物包括上述分子的所述類型，并且可能還包含未知含量的樣品。感興趣的是源自天然來源(如植物)的天然產(chǎn)生的化合物的復雜混合物。雖然很多樣品會包含溶液中的化合物，但是也可以測試能夠在合適溶劑中溶解的固體樣品。感興趣的樣品包括環(huán)境樣品，例如地下水、海水、采礦廢水等；生物樣品，例如來自作物、組織樣品的裂解物等；制造樣品，例如在藥品制備中的時程；以及制備以供分析的化合物文庫等。感興趣的樣品包括評估潛在治療價值的化合物，例如藥物候選物。
[0097]術(shù)語樣品也包括上述的已經(jīng)添加額外組分的流體，所述組分例如影響離子強度、pH、總蛋白濃度等的組分。另外，可以處理樣品來實現(xiàn)至少部分分餾或濃縮。如果要減少(如在氮氣下、冷凍或其組合條件下)的化合物降解，可以保存生物樣品。使用的樣品的體積足夠允許進行可測量的檢測，通常約0.1: 1-1ml的生物樣品是足夠的。
[0098]可從多種來源(包括合成或天然化合物文庫)來獲得化合物，包括候選試劑。例如，可用許多方法隨機和 定向合成包括生物分子在內(nèi)的各種有機化合物，所述方法包括表達隨機寡核苷酸和寡肽?；蛘?，在氮氣下、冷凍或其組合條件下細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫。此外，天然或合成產(chǎn)生的文庫和化合物容易通過常規(guī)的化學、物理和生化方法修飾，且可用于生產(chǎn)組合文庫。已知的藥劑可進行定向或隨機的化學修飾如?；?、烷化、酯化、胺化等以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
[0099]本文使用的術(shù)語“遺傳物質(zhì)”是指多核苷酸或其類似物，通過向細胞加入遺傳物質(zhì)以在本發(fā)明的篩選試驗中測試該試劑。遺傳物質(zhì)的引入導致細胞的總遺傳組成的變化。遺傳物質(zhì)(諸如DNA)可導致在細胞的基因組中實驗性引入變化，所述變化通常通過將序列整合進入染色體中而發(fā)生。遺傳變化也可以是暫時的，其中外源序列未被整合而是保持為附加體。遺傳物質(zhì)(如反義寡核苷酸)也能夠通過mRNA的轉(zhuǎn)錄或反義來干擾蛋白質(zhì)的表達而不改變細胞的基因型。遺傳物質(zhì)的影響是增加或減少細胞中一種或多種基因產(chǎn)物的表達。
[0100]能夠采用引入編碼多肽的表達載體以在缺少該序列的細胞中表達編碼的產(chǎn)物，或過表達該產(chǎn)物。能夠使用組成型或受外部調(diào)節(jié)的各種啟動子，在受外部調(diào)節(jié)的情況中，能夠打開或關(guān)閉基因的轉(zhuǎn)錄。這些編碼序列可以全長的CDNA或基因組克隆、其衍生的片段或使天然產(chǎn)生序列與其它編碼序列的功能性或結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的嵌合體。另外，引入的序列可以編碼反義序列；可以是反義寡核苷酸；RNAi，編碼天然序列的顯性陰性突變，或顯性或組成性活性突變；改變的調(diào)節(jié)序列等。
[0101]能夠通過本領(lǐng)域已知的方法化學合成反義和RNAi寡核苷酸。優(yōu)選的寡核苷酸從天然磷酸二酯結(jié)構(gòu)中化學修飾，從而增加其細胞內(nèi)穩(wěn)定性和結(jié)合親和性。已在文獻中描述了一些此類修飾，所述修飾改變主鏈、糖或雜環(huán)堿基的化學性質(zhì)。主鏈化學性質(zhì)中的有用改變?yōu)榱虼姿狨ィ粌蓚€非橋連氧都用硫取代的二硫代磷酸酯；亞磷酰胺；烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。非手性磷酸酯衍生物包括3' -O' -5' -S-硫代磷酸酯、3' -S-5, -O-硫代磷酸酯、3^ -CH2-5' -O-膦酸酯和3' -NH-5' -O-氨基磷酸酯。肽核酸用肽鍵替代完整核糖磷酸二酯主鏈。還使用糖修飾來增強穩(wěn)定性和親和性，例如嗎啉代寡核苷酸類似物?？墒褂妹撗鹾缩钡?端基異構(gòu)體，其中堿基相對天然的-端基異構(gòu)體倒轉(zhuǎn)?？筛淖兒颂堑?，-OH以形成2' -O-甲基或2' -O-烯丙基糖，其提供對降解的抗性而不影響親和性。
[0102]在一種或多種環(huán)境條件下，通過向至少一種細胞并且通常向多種細胞中添加試劑，從而根據(jù)生物活性來篩選試劑，所述條件例如在用β-腎上腺素激動劑刺激之后、在電學刺激或機械刺激之后等。對響應(yīng)試劑的參數(shù)讀出值的變化進行測量，依照所需進行標準化，并且然后通過與參比篩選結(jié)果比較來評估所得的篩選結(jié)果，所述參比篩選結(jié)果例如具有感興趣的其它突變的細胞、正常心肌細胞、源自其它家族成員的心肌細胞等。所述參比篩選結(jié)果可以包括在不同環(huán)境變化存在或不存在下的讀出值、用其它試劑得到的篩選結(jié)果，其可以包括或不包括已知的藥物等。
[0103]所述試劑可在溶液中或以易溶解的形式方便地添加到培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)基中。所述試劑可作為間歇或連續(xù)的流加入到流通式系統(tǒng)中，或者將一團化合物單一或遞增地加入靜態(tài)溶液中。在流通式系統(tǒng)中，使用兩種流體，其中一種是生理中性溶液，另一種是與添加測試化合物相同的溶液。第一種流體通過細胞，然后是第二種。在單一溶液方法中，向細胞周圍的培養(yǎng)基體積中添加測試化合物團。所述團塊添加后或流通式方法中的兩種溶液之間，培養(yǎng)基組分的總濃度不應(yīng)發(fā) 生顯著變化。
[0104]優(yōu)選的試劑制劑不包含可能對整體制劑有顯著影響的其他組分，如防腐劑。因此優(yōu)選的制劑基本由生物活性化合物和生理學上可接受的運載體(如水、乙醇、DMSO等)組成。然而，如果化合物是不含溶劑的液體，制劑可以基本由化合物本身組成。
[0105]用不同的試劑濃度平行進行多種試驗，以獲得對不同濃度的差異反應(yīng)。如本領(lǐng)域所知，測定試劑的有效濃度通常使用的濃度范圍來自1: 10或其它對數(shù)級別的稀釋液。如需要，所述濃度還可用第二稀釋系列來細化。通常，這些濃度之一用作陰性對照，如零濃度或低于試劑檢測水平或者處于或低于不產(chǎn)生可檢測的表型變化的試劑濃度。
[0106]能夠采用各種方法來對除上述功能性參數(shù)以外的所選的參數(shù)的存在定量。對于存在的分子的量的檢測而言，方便的方法是用可檢測部分來標記分子，所述可檢測部分可以是熒光的、發(fā)光的、放射性的、酶活性的部分等，尤其是以高親和力結(jié)合所述參數(shù)的特異性分子。熒光部分易于標記幾乎任意的生物分子、結(jié)構(gòu)或細胞類型。免疫熒光部分不僅能導向性地結(jié)合特定蛋白質(zhì)，還能導向性地結(jié)合特定構(gòu)象、切割產(chǎn)物或位點修飾(諸如磷酸化)?？蓪为毜碾暮偷鞍踪|(zhì)工程改造為自發(fā)熒光，例如通過在細胞內(nèi)將它們表達為綠色熒光蛋白嵌合體(綜述可參見 Jones 等，(1999) Trends Biotechnol.17 (12): 477-81)。因此,能夠遺傳修飾抗體來提供作為其結(jié)構(gòu)的部分的熒光染料。
[0107]根據(jù)選擇的標簽，可以使用除了熒光標簽以外的方式來測量參數(shù)，所述方式例如免疫試驗技術(shù)如放射性免疫試驗(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、均相酶免疫試驗和相關(guān)的非酶技術(shù)。這些技術(shù)采用特異性抗體作為報告分子，由于其與單個分子靶標連接的高度特異性，它們特別有用。美國專利號4，568，649描述了采用閃爍計數(shù)的配體檢測系統(tǒng)。這些技術(shù)對蛋白質(zhì)或修飾的蛋白質(zhì)參數(shù)或表位或糖決定簇特別有用。能夠使用熒光或另外加標簽的報告分子來得到蛋白質(zhì)和其它細胞決定子的細胞讀出值?；诩毎腅LISA或相關(guān)的非酶促方法或基于熒光的方法使得能夠測量細胞表面參數(shù)和分泌參數(shù)。捕獲ELISA和相關(guān)非酶促方法通常采用兩種特異性抗體或報告分子，并且可用于測量溶液中的參數(shù)。流式細胞術(shù)方法可用于測量細胞表面和細胞內(nèi)的參數(shù)，以及形狀變化和粒度，并且可用于分析用作抗體連接試劑或探針連接試劑的珠。來自此類試驗的讀出值可以是與單一熒光抗體檢測的細胞表面分子或細胞因子相關(guān)的平均熒光，或平均熒光強度、中值熒光強度、熒光強度的方差或其之間的一些關(guān)系。
[0108]在本領(lǐng)域中使用單細胞多參數(shù)和多細胞多參數(shù)的多重試驗，其中通過對定量的成像、熒光和共聚焦顯微鏡來鑒定輸入的細胞類型并讀取參數(shù)，見《共聚焦顯微鏡方法和方案》(Confocal Microscopy Methods and Protocols),(分子生物學方法第 122 卷)，Paddock編，胡馬納(Humana)出版公司，1998。這些方法在1999年11月23日授予的美國專利號5，989，833中描述。
[0109]核酸(尤其是信使RNA)的定量也是人們感興趣的參數(shù)。這些可以通過根據(jù)核酸核苷酸的序列的雜交技術(shù)來測量。技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)方法和基因陣列技術(shù)。參見例如，Ausubel等編的《分子生物學試驗指南》(Current Protocols in MolecularBiology),約翰韋利森公司(John Wiley&Sons),紐約州紐約，2000 ;Freeman 等，(1999)Biotechniques26(l): 112-225 ;Kawamoto 等，(1999)Genome Res9(12): 1305-12 ;和Chen 等，(1998)Genomics51(3): 313-24。
[0110]通過使用合適的推斷方法(deduction protocol)、Al系統(tǒng)、統(tǒng)計學比較等完成從測試化合物得到的篩選結(jié)果與參比篩選結(jié)果的比較。優(yōu)選地，使篩選結(jié)果與參比篩選結(jié)果的數(shù)據(jù)庫作比較。能夠匯編參比篩選結(jié)果的數(shù)據(jù)庫。這些數(shù)據(jù)庫可以包括來自含有已知試劑或試劑組合的組的參比結(jié)果，以及來自對在環(huán)境條件下處理的細胞進行分析的參比，在該環(huán)境條件下，去除或特定改變了單一或多重環(huán)境條件或參數(shù)。參比結(jié)果也可以產(chǎn)生自含有基因構(gòu)建物的細胞的組，所述基因構(gòu)建物特異性靶向或調(diào)控特定細胞通路。
[0111]讀出值可以是平均、均值、中值或方差或其他與測量相關(guān)的統(tǒng)計學或數(shù)學數(shù)值。參數(shù)讀出值信息還可以通過與相應(yīng)的參比讀出值的直接比較來改善。在相同條件下得帶的各參數(shù)的絕對值會展現(xiàn)出活生物系統(tǒng)中固有的差異并且也反映了個體細胞差異和個體之間的固有差異。
[0112]方便起見，本發(fā)明的系統(tǒng)可以試劑盒形式提供。該試劑盒可以包括待使用的細胞，用于測量參數(shù)的試劑和用于制得篩選結(jié)果的軟件，所述細胞可以經(jīng)冷凍、經(jīng)冷藏或以一些其它方式處理以維持活性。所述軟件會接收結(jié)果并進行分析，并且能夠包括參比數(shù)據(jù)。所述軟件還能使結(jié)果針對來自對照培養(yǎng)物的結(jié)果進行標準化。所述組合物可任選地被包裝在合適容器中，所述容器具有針對所需目的(如篩選方法等)的書面說明書。
[0113]為了進一步詳述本發(fā)明的實踐中有用的一般技術(shù)，操作人員能夠參考標準教科書并且回顧細胞生物學、組織培養(yǎng)、胚胎學和心血管生理學。對于組織培養(yǎng)和胚胎干細胞，讀者可以希望參考《畸胎癌和胚胎干細胞:實踐方法》(Teratocarcinomas and embryonicstem cells:A practical approach) (E.J.Robertson 編,IRL 出版有限公司，1987);《小鼠發(fā)育技術(shù)指南》(Guide to Techniques in Mouse Development) (P.M.Wasserman 等編，學術(shù)出版社，1993);胚胎干細胞體外分化(Embryonic Stem Cell Differentiation inVitro) (Μ.V.Wiles,Meth.Enzymol.225: 900,1993);胚胎干細胞的性質(zhì)和應(yīng)用:應(yīng)用于人生物學和基因治療的前景(Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospectsfor Application to Human Biology and Gene Therapy) (P.D.Rathjen 等，Reprod.Fertil.Dev.10: 31，1998)。對于心臟細胞培養(yǎng)，標準參考文獻包括《培養(yǎng)中的心臟細胞》(The Heart Cell in Culture) (A.Pinson編，CRC出版社，1987),《分離的成人心肌細胞》(Isolated Adult Cardiomyocytes)(卷 I 和 II,Piper 和 Isenberg 編，CRC 出版社，1989)，《心臟發(fā)育》(Heart Development) (Harvey 和 Rosenthal,學術(shù)出版社，1998)。
[0114]分子和細胞生物化學中的一般方法可在下列標準教科書中找到:如《分子克隆:實驗室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第三版(Sambrook 等，港實驗室出版社，2001);《分子生物學簡明實驗方案》(Short Protocols in MolecularBiology),第4版(Ausubel等編,約翰韋利森公司，1999);《蛋白方法》(Protein Methods)(Bollag等，約翰韋利森公司，1996);《基因治療的非病毒載體》(Nonviral Vectors forGene Therapy) (Wagner 等編，學術(shù)出版社，1999);《病毒載體》(Viral Vectors) (Kaplift和Loewy編，學術(shù)出版社，1995)；《免疫學方法手冊》(Immunology Methods Manual)(1.Lefkovits編，學術(shù)出版社，1997);和《細胞和組織培養(yǎng):生物技術(shù)中的實驗室方法》(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology) (Doyle 和Griffiths，約翰韋利森公司，1998)。本公開中提及的用于遺傳操作的試劑、克隆載體和試劑盒可購自商品供應(yīng)商，如伯樂公司(BioRad)、斯查塔基公司(Stratagene)、英杰公司(Invitrogen)、西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)和克隆泰克公司(Clontech)。
[0115]在說明書中引用的各出版物在此通過引用全文納入本文用于全部目的。
[0116]應(yīng)理解本發(fā)明不限于所述特定方法、方案、細胞系、動物種或?qū)僖约霸噭?，因為這些可能會有變化。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語的目的僅是為了描述【具體實施方式】，不意在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。
[0117]如本文中所用，單數(shù)形式的“一個”、“一種”和“該”包括復數(shù)指代形式，除非文中另有明確說明。因此，例如，提到“一個細胞”包括多個這樣的細胞，提到“培養(yǎng)”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種培養(yǎng)及其等同物，等等。除非另有明確說明，本文所用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的通常含義相同。
[0118]提供以下實施例的目的是向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完整地公開和描述如何制備和使用本發(fā)明，這些實施例不意在限制發(fā)明人認為的發(fā)明范圍，也不代表下述實驗是所進行的所有或僅有的實驗。努力保證所用數(shù)值(如量、溫度等)的準確性，但應(yīng)允許一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是重量均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。
[0119]實施例
[0120]實施例1
[0121] 擴張型心肌病(DCM)是最常見的心肌病，其特征為心室擴張、收縮障礙和進行性心力衰竭。DCM是導致心臟移植的最常見診斷結(jié)論，并且對全世界的健康護理施加大量負擔。在此我們從源自DCM家族患者的iPSC產(chǎn)生心肌細胞(CM)，所述DCM家族患者在編碼肌節(jié)蛋白心臟肌鈣蛋白T的基因中攜帶點突變(R173W)。相比在相同家族組中的對照健康個體，DCM iPSC-CM展現(xiàn)出鈣瞬變幅度減小、收縮減弱和異常肌節(jié)α-輔肌動蛋白分布。當用腎上腺素激動劑刺激時，DCM iPSC-CM顯示出衰竭的特征，如搏動速率減小、收縮減弱和具有異常肌節(jié)α-輔肌動蛋白分布的細胞明顯增多。β_腎上腺素阻斷劑處理和肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶(Serca2a)的過表達改善了 DCM iPSC_CM的功能。我們的研究證明人DCMiPSC-CM概括了疾病的形態(tài)和功能上的表型，因此作為探索分子和細胞機制以及優(yōu)化該特定疾病的治療的有用平臺。
[0122]我們募集了來自DCM先證者的7個個體的組群，所述DCM先證者在TNNT2基因的外顯子12上攜帶常染色體顯性點突變，這導致在蛋白CTnT中氨基酸位置173處的精氨酸(R)突變成色氨酸(W)。通過對17種原發(fā)性DCM相關(guān)基因的組進行遺傳篩選(表1)和遺傳共分離研究(表2)確證該特定點突變的DCM致病作用。據(jù)報道，在完全獨立的比利時家族中也有這個突變。這7個募集的個體涵蓋了 3代人(1、11和III)(圖la)。通過PCR擴增TNNT2的基因組基因座和DNA測序證明了 4名患者(Ia、IIa、IIb和IIIa)在兩個等位基因中的一個上攜帶TNNT2 R173W突變，而確證其他3個個體(lb、IIc和IIIb)為正常個體并且用作后續(xù)研究的對照(圖1b)。所有4名攜帶特定R173W突變的患者顯示左心室擴張和射血分數(shù)降低的臨床DCM癥狀，并且被醫(yī)學治療(表2)。一名14歲的疾病患者(IIIa)由于具有嚴重的臨床癥狀而接受了原位心臟移植。通過對該特定患者IIIa采用32種最新DCM相關(guān)基因的組的外顯子組測序的進一步遺傳篩選沒有發(fā)現(xiàn)與所述疾病相關(guān)聯(lián)的任何其它額外的變體(表3)。
[0123]為了產(chǎn)生所述7個個體的患者特異性iPSC，從取自每個個體的皮膚活檢中擴增皮膚成纖維細胞(圖1c),并且在無飼養(yǎng)層條件下用慢病毒Yamanaka 4因子(0ct4、Sox2、Klf4和c-MYC)使所述細胞重編程。挑取TRA-1-60+染色且具有人胚胎干細胞(hESC)樣形態(tài)的集落(圖1d和Ie)，對其擴增并建立成個體iPSC細胞系。對于每個個體，建立3-4個iPSC細胞系用于后續(xù)分 析。通過基因組PCR和DNA測序確證所有的DCM iPSC細胞系都含有特定的R173W突變(圖5)。所有建立的iPSC細胞系都表達多能性標志物0ct4、Nanog,TRA-1-81和SSEA-4，并且呈堿性磷酸酶陽性(圖1f)。微陣列分析表明這些iPSC細胞系與親本皮膚成纖維細胞不同，其表達與hESC更相似的全基因模式(圖6)。定量亞硫酸氫鹽測序顯示在所有測試的iPSC細胞系中，0ct4和Nanog的啟動子區(qū)域被低甲基化，這表明多能基因的活性轉(zhuǎn)錄(圖1g)。在擴增傳代之后，已經(jīng)建立的iPSC細胞系維持正常的核型(圖7)，并且它們中的大多數(shù)顯示外源轉(zhuǎn)基因的沉默和內(nèi)源Nanog的再表達(圖8)。后續(xù)研究除去了具有不完全轉(zhuǎn)基因沉默的iPSC細胞系。這些患者特異性iPSC能夠在體外分化成所有三種胚層的細胞(圖9)，并且在注射進入免疫缺陷小鼠的腎小囊之后形成畸胎瘤(圖1h)。
[0124]我們之后用成熟建立的3D分化方案使DCM iPSC分化成心血管譜系，該方案由Yang，L.等開發(fā)，發(fā)育自KDR+胚胎干細胞源性群的人心血管祖細胞(Humancardiovascular progenitor cells develop from a KDR+embryonic-stem-cell-derivedpopulation).Nature453，524-528 (2008)。選擇來自每個個體的兩種iPSC細胞系來分化成自發(fā)搏動擬胚體(EB)。早在分化后第8天就觀察到自發(fā)搏動。向心臟譜系分化的效率在不同細胞系之間不同(圖10)。衍生自對照和患者iPSC的搏動EB含有約50-60% cTnT陽性CM(圖11)。衍生自3名DCM患者的3個iPSC克隆的搏動EB的等位基因特異性PCR表明野生型和突變體(R173W)TNNT2基因的雙等位表達(圖12)。將來自對照iPSC和DCM iPSC的搏動EB接種在多重電極陣列(MEA)探針上(圖13a)，并且記錄它們的電生理學性質(zhì)(圖13b)。對照(η = 45)和DCM(n = 57) iPSC-衍生的搏動EB都顯示在基線上搏動頻率、場電位、峰電位間隔和場電位時程(FPD)相當(表4和圖13c)。
[0125]我們之后將搏動EB分離為小搏動簇(beating cluster)以及單個搏動CM，以供進一步分析。對對照(η = 24)和DCM(η = 24) iPSC-CM采用微流體技術(shù)進行的單細胞PCR分析表明所選心臟相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、肌節(jié)蛋白和離子通道的基因表達沒有顯著差異(圖14)。我們下一步通過免疫細胞化學法來評估iPSC-CM中肌原纖維的組織。對照和DCM iPSC-CM都表達肌節(jié)蛋白cTnT、肌節(jié)α -輔肌動蛋白和肌球蛋白輕鏈2a(MLC2a)，以及心臟標志物間隙連接蛋白43 (圖15)。然而，相比在分化后第30天的對照iPSC-CM (η = 368)，明顯較高百分比的DCMiPSC-CM(η = 391)顯示出在多于四分之一的總細胞面積上有肌節(jié)α -輔肌動蛋白的點狀分布(P=0.008)(圖2a、2b和圖16)。在這一階段，對照和DCM iPSC-CM之間沒有顯著的細胞尺寸差異(圖2c)。在各來自4名DCM患者的兩種不同的DCM iPSC細胞系中一致觀察到該現(xiàn)象，表明與疾病致病R173W突變的同質(zhì)相關(guān)性。顯然，具有點狀肌節(jié)α-輔肌動蛋白分布的CM的大多數(shù)是在搏動簇周圍的單個或多個細胞。肌節(jié)α-輔肌動蛋白是肌節(jié)完整性和肌節(jié)變性的極好標志物。這些結(jié)果也表明個體DCM iPSC-CM具有在維持肌節(jié)完整性中發(fā)生故障的較高傾向。
[0126]正性肌力壓力能夠在DCM的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中誘導DCM表型，并且使臨床患者疾病惡化。我們之后檢測采用正性肌力壓力試劑(如β_腎上腺素激動劑)的處理是否能夠加快DCM iPSC-CM的表型反應(yīng)。實際上，如MEA記錄所顯示，采用ΙΟμΜ的去甲腎上腺素(NE)處理誘導了正性變時作用，其之后變?yōu)樨撔宰饔?，最終導致DCM iPSC-衍生的搏動EB(η = 14)中自發(fā)收縮的失敗。相反,對照iPSC-衍生的搏動EB(n = 14)展現(xiàn)出延長的正性變時活性(圖2d)。 一周的NE處理顯著增加了來自DCM iPSC克隆的，具有肌節(jié)α -輔肌動蛋自分布的CM的數(shù)量，并且發(fā)現(xiàn)幾乎90%的DCM iPSC-CM具有混亂的肌節(jié)圖案(圖2f、2g、圖17和圖18)。在延長的NE處理之后，一些單個DCM iPSC-CM顯示肌絲的完全變性，而在對照細胞中沒有觀察到這種情況。追蹤用由NE處理的對照和DCM iPSC-CM的單個搏動簇隨時間的視頻成像顯示出不同的結(jié)果。在DCM iPSC-CM中而不是在對照iPSC-CM中觀察到降低的肌力活性和變時活性(圖2e，圖2h)。單細胞PCR分析也揭示了在NE處理之后，在DCM (η = 16)與對照iPSC-CM (η = 16)中不同的基因表達變化(圖19)。這些結(jié)果表明β -腎上腺素刺激加劇了 DCM iPSC-CM表型。
[0127]如膜動作電位(AP)所顯示，CM收縮從肌細胞的電激發(fā)開始。為了研究DCM的可能的潛在機制，我們評估了在cTnT中DCM-相連的R173W突變是否影響CM的電激發(fā)。我們通過膜片鉗檢測了分離的單個搏動iPSC-CM的電活性。在對照和DCM iPSC-CM中觀察到三種類型的自發(fā)AP(心室樣、心房樣和節(jié)點樣)(圖20a)。DCM心室肌細胞(η = 17)展示出與對照(η = 18)相當?shù)恼P (圖20b)。DCM iPSC-CM的90%復極化(APD90)的平均動作電位持續(xù)時間與對照iPSC-CM中看到的沒有顯著差異(圖20c)。兩組之間的平均AP頻率、峰幅度和靜息電位也非常相似(圖20d、20e和20f)。這些結(jié)果表明對照和DCM iPSC-CM在基線的電激發(fā)活性是正常的。[0128]為了進一步研究潛在的DCM發(fā)病機理，我們通過熒光Ca2+成像檢測了在激發(fā)_收縮偶聯(lián)水平上的Ca2+處理性能。DCM iPSC-CM (η = 40)展示出與對照iPSC-CM (η = 87)相當?shù)娜玔Cali瞬變的節(jié)律性頻率、節(jié)律和幅度(圖3a、3b、3c、3e和3f)。然而，與對照iPSC-CM(p=0.002)相比，DCM iPSC-CM展現(xiàn)出明顯較小的[Ca2Ii瞬變幅度(圖3d)，表明對于DCM iPSC-CM的每次收縮可用的[Cali明顯較低。在所有檢測的衍生自4名DCM患者的DCM iPSC細胞系中，一致觀察到CM的較小的[Ca2+] i瞬變，表明在DCM iPSC-CM中產(chǎn)生較弱的力。
[0129]收縮力產(chǎn)生中的缺陷是誘導DCM和心力衰竭的最重要的機制之一。為了進一步研究，我們下一步使用原子力顯微鏡(AFM)來測量iPSC-CM的收縮力，所述原子力顯微鏡已經(jīng)用于檢測培養(yǎng)的雞胚胎CM。AFM允許我們在單細胞水平上探測收縮性質(zhì)(圖21)。與單一對照iPSC-CM (η = 13)相比，DCM iPSC-CM (η = 17)顯示出相似的搏動頻率和持續(xù)時間，但是收縮力明顯較弱(圖4c、4d、圖22和表5)。經(jīng)AFM檢測，在來自每個單一細胞的細胞尺寸和收縮力之間沒有相關(guān)性(圖23)。
[0130]先前一種在臨床前試驗中研究的治療方法已顯示Serca2a過表達在衰竭的人心臟中移動細胞內(nèi)Ca2+并恢復心肌細胞的收縮性，并且在動物模型中改善衰竭的心臟功能?？紤]到我們的結(jié)果顯示在DCM iPSC-CM中有較低Ca2+瞬變和減弱的收縮性，我們假設(shè)Serca2a的過表達能夠拯救DCM iPSC_CM的表型。以100計的感染復數(shù)(MOI)，用攜帶共表達GFP的Serca2a的腺病毒(Ad.Seca2a)轉(zhuǎn)導DCM iPSC-CM (參見方法部分)，導致在這些細胞中Serca2a的過表達(圖4a)。相比僅僅采用攜帶GFP的腺病毒(Ad.GFP) (M0I100)轉(zhuǎn)導的DCM iPSC-CM，Serca2a的過表達造成隨時間的較大數(shù)量的體外自發(fā)收縮點(圖24)。GFP與Serca2a的共表達使我們能夠識別轉(zhuǎn)導的細胞并且通過AFM檢測收縮力(圖4b)。Serca2a(n = 12)的過表達使單一 DCM iPSC-CM的收縮力恢復至在對照iPSC-CM中觀察到的相似水平(圖4c、4d和 表5)，但是沒有改善肌節(jié)的組織性(圖4g)。使用紅色熒光Ca2+指示劑Rhod-2AM的鈣成像(圖25)顯示相比僅僅用Ad.GFP轉(zhuǎn)導的細胞(η = 14)，用共表達GFP的Ad.Serca2a轉(zhuǎn)導的DCM iPSC-CM (η = 22)具有顯著增加的全[Ca葉]i瞬變(圖4e和圖4f) (p=0.04)，這與恢復的力的產(chǎn)生相一致。相反，在對照iPSC-CM中Serca2a的過表達無法產(chǎn)生收縮性的統(tǒng)計學上的顯著增加(圖26)，表明對照和DCM iPSC-CM之間在鈣處理中的天然差異。總之，這些結(jié)果表明Serca2a的過表達增加了 [Ca2+]i瞬變以及DCM iPSC-CM的收縮力，并且改善了它們的功能。
[0131]雖然Serca2a基因治療現(xiàn)在出于臨床試驗階段，但在Serca2a基因治療之后個體CM細胞反應(yīng)的整體機制在先前還未被廣泛研究。因此，我們開始研究該機制，其中Serca2a遞送恢復了DCM iPSC-CM中的缺陷。在Serca2a過表達之后DCM iPSC-CM的基因表達譜顯示191個基因(65個上調(diào)，126個下調(diào))的表達變化超過1.5倍，并且被拯救至與對照iPSC-CM中相似的表達水平(圖27a)。富集通路分析表明幾種先前已知的通路(如鈣信號傳導、蛋白激酶A信號傳導和G-蛋白偶聯(lián)受體信號傳導)明顯參與了通過Serca2a過表達來拯救DCM表型的過程。有趣的是，發(fā)現(xiàn)幾種先前與DCM沒有聯(lián)系的通路(包括促心臟發(fā)生的因子、整聯(lián)蛋白和細胞骨架信號傳導、以及泛素化通路)也參與拯救DCM CM功能的過程(圖27b和表7)。
[0132]臨床研究已經(jīng)表明美托洛爾，一種β 1-選擇性β -腎上腺素阻斷劑，對于DCM患者的臨床癥狀和血液動力學狀態(tài)具有有益作用。如肌節(jié)α -輔肌動蛋白染色所示(圖28a)，當用10 μ M美托洛爾治療時，DCM iPSC-CM顯示肌節(jié)組織有所改善。美托洛爾治療也防止由于NE處理所誘導的DCM iPSC-CM的惡化(圖28b)。我們在用美托洛爾處理的對照iPSC-CM中沒有觀察到對肌節(jié)α -輔肌動蛋白分布的顯著影響(圖28c)。這些結(jié)果表明β -腎上腺素通路有助于DCMiPSC-CM抵抗機械惡化。
[0133]總之，我們已經(jīng)從肌節(jié)蛋白cTnT中攜帶單點突變的DCM家族產(chǎn)生了患者特異性iPSC，并且從這些iPCS中衍生出CM。這已經(jīng)使我們能夠產(chǎn)生大量的DCM-特異性CM并且分析它們的功能性質(zhì)、探索潛在發(fā)病機理并測試有效的治療方法(表8)。盡管DCM iPSC-CM的基線電生理學活性與對照沒有明顯不同，但DCM iPSC-CM展現(xiàn)出明顯較小的[0&2+\瞬變和降低的收縮力。較弱的抵抗機械刺激的能力也與DCM iPSC-CM相關(guān)。如肌節(jié)α-輔肌動蛋白染色所示，NE刺激誘導它們的自發(fā)收縮的停止，并且顯著惡化肌節(jié)的組織性。這個TNNT2R173W突變看似僅僅影響CM的功能，而不影響來自心血管譜系的其它細胞(圖29)?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明TNNT2R173W突變造成CM的力產(chǎn)生中的破壞，這可能是患者DCM臨床表型的最終表現(xiàn)的主要病因(圖30)。顯示β-阻斷劑美托洛爾能夠拯救DCM iPSC-CM表型。另外，Serca2a的過表達，一種當前在臨床試驗中用于治療心力衰竭的新型基因治療方法，能夠顯著改善DCM iPSC-CM的功能。基因表達概況還鑒定了幾條參與Serca2a拯救的新通路，包括泛素化和整聯(lián)蛋白信號傳導通路?？傊?，我們的發(fā)現(xiàn)證明iPSC平臺打開了研究針對DCM的發(fā)病機理和治療靶標的新的、令人激動的研究領(lǐng)域。
[0134]方法
[0135]患者特異性iPSC衍生、培養(yǎng)和表征。用于該研究的所有方案由斯坦福大學人對象研究機構(gòu)審查委員會(Human Subjects Research Institutional Review Board)批準。如前述實施患者特異性iPSC細胞系的產(chǎn)生、維持和表征。
[0136]免疫熒光和堿性磷酸酶染色。按照生產(chǎn)商的說明書使用定量堿性磷酸酶ES表征試劑盒(開米康公司(Chemicon))實施堿性磷酸酶(AP)染色。如前所述使用合適的一抗以及AlexaFluor偶聯(lián)的二抗(英杰公司(Invitrogen))來實施免疫突光法。在本研究中使用針對0ct3/4(圣克魯茲生物技術(shù)公司(Santa Cruz))、Sox2 (白樂津公司(Biolegend))、SSEA-3(密理博(Millipore))、SSEA-4 (密理博)、Tra-1-60 (密理博)、Tra_l_81(密理博)、Nanog(圣克魯茲生物技術(shù)公司)、AFP(圣克魯茲生物技術(shù)公司)、平滑肌肌動蛋白(SMA)(西格瑪公司(Sigma))、Tuj-1 (科文斯公司(Covance))、cTnT(熱科學公司(ThermoScientific))、肌節(jié)α-輔肌動蛋白(克隆ΕΑ-53，西格瑪公司)、連接蛋白-43 (密理博)和肌球蛋白輕鏈(MLC_2a)(突觸系統(tǒng)公司(Synaptic Systems))的一抗。
[0137]亞硫酸氫鹽焦磷酸測序。按照生產(chǎn)商的說明書使用Zymo DNA甲基化試劑盒(Zymo研究公司)用硫酸氫鹽處理I μ g的樣品DNA。然后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為單鏈DNA模板并且用焦磷酸測序PSQ96HS系統(tǒng)(Biotage)測序。使用QCpG軟件(Biotage)以T/C SNP單獨分析各基因座的甲基化狀態(tài)。
[0138]人ESC和iPSC的心臟分化。使用由Yang等所述的成熟建立的方案使H7ESC和衍生的iPSC細胞系分化成心臟譜系。采用I型膠原酶(西格瑪公司(Sigma))分離搏動EB，并將其接種于明膠被覆的培養(yǎng)皿、腔式載玻片或蓋玻片上供于功能分析。
[0139]鈣成像。將解離的iPSC-CM接種在明膠被覆的4孔LAB-TEK? II腔(耐潔紐恩克國際公司(Nalgene-Nunc International),腔#1.5德國蓋玻片系統(tǒng))供于鈣成像。在37°C下，用內(nèi)含5μΜ Fluo-4AM或Rhod-2AM(針對表達GFP的細胞)和0.02%普流羅尼克(Pluronic) F-127 (皆來自分子探針公司(Molecular Probes))的 Tyrodes 溶液(140mMNaCl, 5.4mM KCl, ImM MgCl2, IOmM 葡萄糖，1.8mM CaCl2 和 IOmM HEPES，在 25°C下用 NaOH調(diào)至PH7.4)處理細胞15分鐘。然后用Tyrodes溶液洗滌細胞3次。用具有63X透鏡(NA=L 4)的共聚焦顯微鏡(卡爾蔡司公司(Carl Zeiss) LSM510Meta)，使用Zen軟件進行鈣成像。采用線掃描模式以1.92ms/線的取樣速率在室溫下獲得自發(fā)Ca2+瞬變。對于19.2s的記錄總共獲得10000條線。
[0140]鈣成像痕跡分析。使用Fi ji，一種使每條線的熒光強度平均化的ImageJ的派生物(國立衛(wèi)生研究院)來定量分析Ca2+反應(yīng)。然后使用MATLAB針對連續(xù)Ca2+瞬變節(jié)律的不規(guī)則性和每次瞬變中總Ca2+流入來分析時間依賴性的Ca2+反應(yīng)。瞬變之間的時間(節(jié)律)被定義為兩個連續(xù)尖峰的峰之間的時間。通過使用MATLAB的信號處理工具箱計算二階倒數(shù)的零交點來確定尖峰。通過對在每個波之下的面積相對于基線進行積分來測定在每次瞬變中的總Ca2+釋放?；€被定義為所有最小值的中值。尖峰周期和幅度的不規(guī)則性被定義為一組測量值的標準偏差(s.d.)與均值的比。
[0141]原子力顯微鏡(AFM)。在各實驗之前，將iPSC-CM接種在玻璃底的皮氏培養(yǎng)皿上，將培養(yǎng)基替換成溫熱Tyrode溶液。使細胞在整個實驗過程中維持在36 °C。通過AFM (MFP-3DBio, Asylum Research公司) 使用氮化娃懸臂(彈簧常數(shù)約0.04N/m, BudgetSensors公司)來研究搏動細胞。為了測量力，由懸臂尖端用IOOpN的力輕觸細胞，具有100-200nm左右的典型細胞缺痕，然后懸臂尖端在沒有Z-壓電反饋的情況下在該位置上保留多個序貫2分鐘間隔，同時以2kHz的取樣速率收集偏移數(shù)據(jù)。在這些檢測中的一般噪音約為20pN。偏移數(shù)據(jù)通過乘以彈簧常數(shù)轉(zhuǎn)化為力。通常各單一細胞收集100-400次搏動，并且計算力、搏動間的間隔和各細胞每次收縮的時程的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。使用雙尾斯氏t檢驗來比較細胞間的力。
[0142]iPSC-CM的腺病毒轉(zhuǎn)導。使用了攜帶巨細胞病毒(CMV)啟動子(驅(qū)動Serca2a)加單獨CMV啟動子(驅(qū)動GFP)的第一代5型重組腺病毒(Ad.SerCa2a)以及僅作為對照的攜帶CMV啟動子(驅(qū)動GFP)的腺病毒(Ad.GFP)。從搏動EB分離的iPSC-CM以M0I100過夜轉(zhuǎn)導，然后更換培養(yǎng)基(補充有10% FBS的DMEM)。細胞在轉(zhuǎn)導后48小時用于后續(xù)實驗。
[0143]統(tǒng)計學分析。使用Excel或R來分析數(shù)據(jù)。使用雙尾斯氏t檢驗來檢驗兩組之間的統(tǒng)計學差異。使用單向ANOVA檢驗和隨后的徒吉(Tukey)多重比較檢驗來分析超過兩組之間的統(tǒng)計學差異。當P值小于0.05時，確定為顯著差異。
[0144]遺傳測試。將來自患者的外周血分入EDTA并且被送至GeneDx實驗室(馬里蘭州蓋瑟斯堡(Gaithersburg，MD))用于基因組DNA分離和商業(yè)遺傳測試。對DNA擴增并且用通過合成方法的“下一代(next generation) ”固態(tài)序列(億明達公司(Illumina))來測序。DCM基因的組包括對以下基因的完全編碼區(qū)域和剪接點的測序:LMNA、MYH7、TNNT2、ACTCl、DES、MYBPC3、TPMl、TNNI3, LDB3、TAZ、PLN、TTR、LAMP2、SGCD、MTTLl、MTTQ, MTTH、MTTK、MTTS1、MTTS2、MTND1、MTND5 和 MTND6。用人參比序列(c DNA NM00108005)與結(jié)果相比較。通過雙脫氧DNA測序來確定可能的疾病相關(guān)序列。還在混合種族的335個假定健康對照中確定候選疾病相關(guān)變體的存在。在TNNT2基因中鑒定變體(p.Argl73Trp)。這是用疏水性、中性的酪氨酸來取代親水性、帶正電的精氨酸的非保守氨基酸取代。在幾種物種之間，該精氨酸在173位上高度保守。計算機分析(PolyPhen)預測該氨基酸取代破壞心臟肌鈣蛋白T2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。在混合祖先335個的對照個體中未發(fā)現(xiàn)該變體。
[0145]外顯子組測序和數(shù)據(jù)分析。對來自個體IIIa的基因組DNA進行使用Nimblegen SeqCap EZ Exome Library ν2.0 (羅氏分子生化制品公司(Roche MolecularBiochemicals)的外顯子組測序。檢測潛在DCM的32個最新常染色體基因(補充表3)的突變。在外顯子組捕獲中靶向所有的這些基因并且總共覆蓋190kb。用HiSeq(億明達公司)的一條通道來測序產(chǎn)生217x的中值覆蓋(四分位距152x至243x)。通過使用由Novoalign、Picard、SAMtools、GATK和ANN0VAR組成的分析管道(analysis pipeline)發(fā)現(xiàn)單核甘酸變體(SNV)。通過比較SNP數(shù)據(jù)庫dbSNP132來確定SNP。通過SIFT算法來鑒定有害的SNV。
[0146]微陣列雜交和數(shù)據(jù)分析。使源自對照和DCM iPSC的未分化iPSC或4周齡CM的(用或不用Serca2a過表達處理)的生物復制品的總RNA樣品與艾菲美特(Affymetrix)基因芯片人基因1.0ST陣列雜交，然后用艾菲美特(Affymetrix)表達控制臺軟件來進行標準化和標注。使用顯示在所有樣品之間標準偏差大于0.2的轉(zhuǎn)錄物的表達水平計算每對樣品的皮爾森相關(guān)系數(shù)。對于分級聚類，我們使用針對平均連鎖聚類的皮爾森相關(guān)。使用新式通路分析(Ingen uity Pathway Analysis) (IPA)工具來鑒定富集的通路。僅選擇基因數(shù)>5的那些通路。
[0147]人ESC和iPSC的心臟分化。在基質(zhì)膠(BD生物科學公司(BD Biosciences))被覆的表面上采用mTESR-1多能干細胞培養(yǎng)基(干細胞技術(shù)有限公司(STEMCELLTechnologies))來培養(yǎng)人ESC和iPSC至80%融合。在第O天,用Accutase (西格瑪公司)將細胞解離成含有10-20個細胞的小簇并且在2ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(StemPix)34，英杰公司，含有2mM谷胺酰胺，英杰公司，0.4mM硫代甘油，西格瑪公司，50μ g/ml抗壞血酸，西格瑪公司，以及0.5ng/ml_BMP4，R&D系統(tǒng)公司(R&D Systems))中重懸以形成擬胚體(EB)。在第1-4天，向用于心臟特定分化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加BMP4(10ng/ml)、人bFGF (5ng/ml)和活化素A(3ng/ml)。在第4-8天，對EB更換含有人DKKl (50ng/ml)和人VEGF(10ng/ml)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后從第8天開始更換含有人bFGF (5ng/ml)和人VEGF (10ng/ml)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所有的因子都獲自R&D系統(tǒng)公司。在5% CO2/空氣環(huán)境中維持培養(yǎng)。
[0148]微電極陣列(MEA)記錄。在分化后第19-47天的實驗之前1_3天，將1_6個搏動iPSC-CM EB置于明膠被覆的MEA探針(α-醫(yī)學科學公司(Alpha Med Scientific))上。用MED64放大器(α醫(yī)學科學公司)在20kHz下獲得信號并且用國家設(shè)備公司Α/D卡和裝有MED64Mobius QT軟件的PC將信號數(shù)碼化。如上所述測量和確定場電位時程(FPD)并且使用IGOR Pro (Lake Oswego)和 MS Excel 進行離線校正。使用 Bazzet 校正公式:CFPD=FPD/ V脈沖間隔使FPD針對搏動頻率進行標準化。使用雙尾斯氏t檢驗來進行比較DCM和對照iPSC-CM電生理學參數(shù)的統(tǒng)計學分析。
[0149]膜片鉗。將分離的iPSC-CM接種在24孔平板中的明膠被覆的15mm的圓蓋玻片上供于實驗。使用EPC-1O膜片鉗放大器(HEKA)和倒置顯微鏡(尼康公司(Nikon) ,TE2000-U)對由蓋玻片上的對照和DCM iPSC產(chǎn)生的CM中的全細胞進行膜片鉗記錄。使用細絲(薩特儀器公司(Sutter Instrument), #BF150-110-10)采用硼娃酸鹽玻璃按照以下參數(shù)(熱，速度，時間):1)740,20,250 ;2) 730，20，250 ;3) 730，20，250 ;4) 710，47，250，使用微量移液管(薩特儀器公司，Model P-87)來制備玻璃吸管。采用以下的吸移溶液執(zhí)行記錄:在Tyrodes溶液(140mM NaCl,5.4mM KCl, ImM MgCl2, IOmM葡萄糖，1.8mM CaCljPlOmM HEPES,在25°C下用 NaOH調(diào)至pH7.4)中的 120mM K D-葡萄糖酸，25mM KCl,4mM MgATP, 2mM NaGTP,4mM Na2-磷酸-肌氨酸，IOmM EGTA, ImM CaCljPlOmM HEPES (在 25°C下用 KCl 調(diào)至pH7.4)。使用雙尾斯氏t檢驗進行統(tǒng)計學分析。
[0150]單細胞微流體PCR。在顯微鏡下人工挑選單個搏動CM。將各細胞引入含有10 μ I反應(yīng)緩沖液(CellsDirect試劑盒,英杰公司)、ΤΕ緩沖液(安碧公司(Ambion))、感興趣的引物(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems))和SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶/白金Taq酶混合物(英杰公司)的混合物的PCR管中。在熱循環(huán)儀(ABI Veriti)上如下實施逆轉(zhuǎn)錄和特定轉(zhuǎn)錄物的擴增:50°C 15分鐘，70°C 2分鐘，94°C 2分鐘，然后94°C 15秒，60°C 30秒，和68°C 45秒，進行18次循環(huán)，然后68°C 7分鐘。使用Nanoflex IFC控制器(福路德姆(Fluidigm))將擴增的cDNA加載至Biomark48.48動態(tài)陣列芯片上。作為相對熒光強度的測量值的閾值循環(huán)(CT)通過BioMark實時PCR分析軟件(Fluidigm)來提取。
[0151]內(nèi)皮細胞分化。使用lmg/ml膠原酶IV(英杰公司)將iPSC分散為含有約500-1000個細胞的細胞聚集體。將細胞聚集體懸浮培養(yǎng)于超低粘附細胞培養(yǎng)皿內(nèi)的含有20%ES-Qualified FBS(英杰公司)并補充有如下誘導細胞因子的敲除DMEM中:0_7天:20ng/ml BMP4 ; 1-4 天:10ng/ml 活化素 A ;2_14 天:8ng/ml FGF-2 ;4_14 天:25ng/ml VEGF-A0 內(nèi)皮祖細胞使用小鼠 抗人CD31抗體(BD生物科學公司)磁力分離，并且在EGM-2內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(龍沙公司(Lonza))中擴增。
[0152]表1.通過下一代測序(億明達公司)遺傳篩選DCM基因的組
[0153]
【權(quán)利要求】
1.一種候選試劑的心臟病相關(guān)篩選的方法,所述方法包括:將所述候選試劑與一種或一組分化自誘導性人多能干細胞(iPS細胞)的心肌細胞接觸，所述iPS細胞包含編碼心臟病相關(guān)突變的至少一種等位基因；和測定所述試劑對于形態(tài)學參數(shù)、遺傳參數(shù)或功能性參數(shù)的影響。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述心臟病選自擴張型心肌病(DCM)、肥大型心肌病(HCM)、蒽環(huán)類抗生素誘導的心臟中毒、心律失常性右心室發(fā)育不良(ARVD)、左心室致密化不全(LVNC)、左心室雙入口(DILV)和長QT(1型)綜合征(LQT-1)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述突變選自:心臟肌鈣蛋白T(TNNT2);肌球蛋白重鏈(MYH7);原肌球蛋白I(TPMl);肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MYBPC3) ;5' -AMP-活化的蛋白激酶亞基Y_2(PRKAG2) ;3型肌鈣蛋白I (TNNI3);肌聯(lián)蛋白(TTN);肌球蛋白，輕鏈2 (MYL2);肌動蛋白，α 心肌I (ACTCl);電壓門控性鉀通道，KQT-樣亞家族，成員I(KCNQl)；斑菲素蛋白2(ΡΚΡ2)和心臟LIM蛋白(CSRP3)。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述心臟病是擴張型心肌病(DCM)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述突變是TNNT2R173W。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，相對于正常心肌細胞，所述DCM心肌細胞具有響應(yīng)正性肌力壓力的初始正性變時作用，之后變?yōu)橐运ソ邽樘卣鞯呢撔宰饔谩?br> 7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述心臟病是肥大型心肌病(HCM)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述突變是MYH7R663H。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，相對于正常心肌細胞，所述HCM心肌細胞展現(xiàn)出細胞大小增大、異常Ca2+瞬變的較高發(fā)生率以及細胞內(nèi)Ca2+水平升高。
10.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述心臟病是心律失常性右心室發(fā)育不良(ARVD)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述突變是PKP22013delC突變或PKP2Q617X 突變之一。
12.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述心臟病是長QT(I型)綜合征(LQT-1)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述突變是KCNQ1G269S錯義突變。
14.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，一組心肌細胞包含具有不同基因型的至少兩種心肌細胞。
15.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，一組心肌細胞包含在不同環(huán)境條件下的心肌細胞。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，一種或多種所述環(huán)境條件包含采用β-腎上腺素激動劑的刺激。
17.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，對所述試劑的影響的測定包括單細胞分析。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述單細胞分析包括原子力顯微鏡、微電極陣列記錄、膜片鉗、單細胞PCR和鈣成像中的一種或多種。
19.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述候選試劑是候選藥物。
20.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述候選試劑是遺傳物質(zhì)。
21.一種分化自誘導性人多能干細胞(iPS細胞)的心肌細胞的經(jīng)分離的群或組，所述iPS細胞包含編碼心臟病相關(guān)突變的至少一種等位基因。
22.如權(quán)利要求20所述的分化自誘導性人多能干細胞(iPS細胞)的心肌細胞的經(jīng)分離的群或組，其特征在于，所述心臟病選自:擴張型心肌病(DCM)、肥大型心肌病(HCM)、蒽環(huán)類抗生素誘導的心臟中毒、心律失常性右心室發(fā)育不良(ARVD)、左心室致密化不全(LVNC)、左心室雙入口(DILV)和長QT(1型)綜合征(LQT-1)。
23.如權(quán)利要求21所述的分化自誘導性人多能干細胞(iPS細胞)的心肌細胞的經(jīng)分離的群或組，其特征在于，所述突變是選自下組的基因中的突變:心臟肌鈣蛋白T(TNNT2)；肌球蛋白重鏈(MYH7);原肌球蛋白I(TPMl);肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MYBPC3) ;5' -AMP-活化的蛋白激酶亞基Y_2(PRKAG2) ;3型肌鈣蛋白I (TNNI3);肌聯(lián)蛋白(TTN);肌球蛋白，輕鏈2 (MYL2);肌動蛋白，α心肌I (ACTCl);電壓門控性鉀通道，KQT-樣亞家族，成員I(KCNQl)；斑菲素蛋白2(ΡΚΡ2)和心臟LIM蛋白(CSRP3)。
24.如權(quán)利要求20所述的經(jīng)分離的群，其特征在于，所述心臟病是擴張型心肌病(DCM)。
25.如權(quán)利要求24所述的經(jīng)分離的群，其特征在于，所述突變是TNNT2R173W。
26.如權(quán)利要求24所述的經(jīng)分 離的群，其特征在于，相對于正常心肌細胞，所述DCM心肌細胞具有響應(yīng)正性肌力壓力的初始正性變時作用，之后變?yōu)橐运ソ邽樘卣鞯呢撔宰饔谩?br> 27.如權(quán)利要求20所述的經(jīng)分離的群，其特征在于，所述心臟病是肥大型心肌病(HCM) ο
28.如權(quán)利要求27所述的經(jīng)分離的群，其特征在于，所述突變是MYH7R663H。
29.如權(quán)利要求27所述的經(jīng)分離的群，其特征在于，相對于正常心肌細胞，所述HCM心肌細胞展現(xiàn)出細胞大小增大、異常Ca2+瞬變的較高發(fā)生率以及細胞內(nèi)Ca2+水平升高。
30.如權(quán)利要求21所述的經(jīng)分離的群，其特征在于，一組心肌細胞包含具有不同基因型的心肌細胞。
31.如權(quán)利要求26所述的組，其特征在于，一組心肌細胞包含在不同環(huán)境條件下的心肌細胞。
32.如權(quán)利要求31所述的組，其特征在于，一種或多種所述環(huán)境條件包括采用β-腎上腺素激動劑的刺激。
【文檔編號】C12N5/074GK103987854SQ201280045656
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月21日
【發(fā)明者】孫寧, M·T·隆蓋克, R·C·羅賓斯, J·吳, F·藍, A·李, P·伯里奇 申請人:小利蘭·斯坦福大學托管委員會