專利名稱：一種心肌細胞的中藥保存液及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種心肌細胞保存液及其應用。
背景技術：
心肌梗死后，心肌細胞永久性丟失。且成熟心肌不可再生，不可能通過分裂增殖來彌補病理性細胞數(shù)量減少。雖然近來有研究證實在心肌梗死后梗死區(qū)邊緣有少量心肌細胞發(fā)生有絲分裂，但這種分裂十分微弱，根本不足以代償有臨床意義的壞死心肌。現(xiàn)有治療手段也無法促使心肌再生。近年來有研究使用細胞移植至受損心臟替代壞死心肌，修復心肌結構和功能，該技術稱之為“心肌再生”或“細胞心肌成形術” (cellular cardiomyoplasty,CCM)。心肌重塑是梗死后心功能持續(xù)惡化的核心機制，很多實驗發(fā)現(xiàn)干細胞移植能阻止心肌重塑。Mangi等移植攜帶Akt基因的大鼠MSCs，發(fā)現(xiàn)心肌重塑被抑制、心功能改善，移植細胞占據(jù)80% 90%的瘢痕，有完全正常的收縮和舒張功能。他們認為心功能改善機制是CCM可以抑制心肌內(nèi)炎癥和病理性肥厚、減少膠原沉積。Kudo等。。發(fā)現(xiàn)骨髓干細胞移植的獲益機制主要是減少心肌梗死面積和抑制纖維化。Chachques等.結扎羊兩支冠脈，將骨骼肌衛(wèi)星細胞(skeletal myoblasts, SMs)和VEGF注射至梗死中心和周邊，3個月后細胞移植抑制了左室擴大。Olivares等發(fā)現(xiàn)MSCs移植后梗死心臟的心室?guī)缀涡螤畹靡院芎玫谋３?。川彎?Ligustrazine)來源于傘形科植物川彎的干燥根莖,為批嗪類生物堿。川芎辛香行散，溫通血脈，上行頭顛，下走血海，功能活血行氣，祛風止痛，被前人譽為血中之氣藥?，F(xiàn)代研究表明川芎嗪有解 痙、降低血管阻力和強烈抑制血小板聚集的作用，對已聚集的血小板有解聚作用，能明顯降低全血粘度；還能增加冠脈流量、有改善心肌供氧、降低心肌耗氧的作用，治療缺血性腦血管及冠心病效果良好，還可以治療偏頭痛和重癥肺心病。川芎嗪的分子量為136.20，分子式=C8H12N2,金氏等發(fā)現(xiàn)東J11芎能使SOD活性和MDA含量明顯恢復，證實了東)11芎能夠穩(wěn)定細胞的膜性結構，抵抗細胞膜和膜性結構受自由基攻擊，最終達到清除自由基的目的，對缺氧缺糖心肌起保護作用。梁氏等在實驗發(fā)現(xiàn)川芎嗪預處理對整體動物缺血再灌注損傷的保護作用后，用體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞觀察了川芎嗪預處理對低氧/再給氧損傷的保護作用。結果表明川芎嗪預處理對體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞低氧/再給氧所致?lián)p傷具有保護作用，其機制可能與提高心肌細胞抗氧化酶活性，清除氧自由基有關。目前大多動物實驗和醫(yī)學研究均取得積極結果，很多實驗就細胞移植途徑作出有意義的探索，但符合應用要求、安全高效的給入途徑研究甚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種心肌細胞保存液及其應用。本發(fā)明提供的心肌細胞保存液，含有川芎嗪、N2添加劑、B27添加劑。所述川芎嗪濃度為10_6mOl/L-10_8mOl/L ;所述N2添加劑百分濃度為1% (質(zhì)量百分含量)；所述B27添加劑百分濃度為I % (質(zhì)量百分含量)。本發(fā)明提供的心肌細胞保存液，是優(yōu)選為是將10_6mOl/L-10_8mOl/L川芎嗪、I %的N2添加劑(質(zhì)量百分含量)、1%的B27添加劑(質(zhì)量百分含量)，添加入9%生理鹽水。所述川芎嗪可以以液體的形式加入，也可以以干粉的形式加入。本發(fā)明提供的心肌細胞保存液用于保存心肌細胞，在12小時以內(nèi)細胞存活率為85%以上，甚至達到95%以上。所述心肌細胞保存液可用于保存心肌細胞，特別是離體的心肌細胞，優(yōu)選為離體的人心肌細胞。本發(fā)明還保護一種保存心肌細胞的方法，是將心肌細胞懸浮于所述心肌細胞保存液，4-8°C保存12小時以下(如4-6°C保存12小時或6_8°C保存12小時)；所述心肌細胞和所述心肌細胞保存液的配比為6 X 105-7 X IO5個心肌細胞活細胞:lmL心肌細胞保存液(如6 X 105-6.8 X IO5個心肌細胞活細胞:ImL心肌細胞保存液，或6.8 X 105-7 X IO5個心肌細胞活細胞=ImL心肌細胞保存液)。所述心肌細胞可為離體的心肌細胞，優(yōu)選為離體的人心肌細胞。本發(fā)明還保護一種治療心腦血管疾病的藥物，是將心肌細胞懸浮于所述心肌細胞保存液得到的細胞懸液；所述心肌細胞和所述心肌細胞保存液的配比為6X 105-7X 105個心肌細胞活細胞=ImL心肌細胞保存液(如6X 105-6.8X IO5個心肌細胞活細胞:lmL心肌細胞保存液，或6.8 X 105-7 X IO5個心肌細胞活細胞:ImL心肌細胞保存液)。所述心肌細胞可為離體的心肌細胞，優(yōu)選為離體的人心肌細胞。本發(fā)明提供的心肌細胞保存液具有穩(wěn)定性高、療效好、安全性高、無毒副作用、便于儲存和運輸，適應臨床大 規(guī)模使用，應用前景廣闊的特點。本發(fā)明提供的藥物可分化成有功能的心肌細胞，具有再生修復實質(zhì)器官和發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的雙向作用，可以提高心肌功能、改善心臟的微環(huán)境。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例1、心肌細胞保存液的制備所述川芎嗪購自上海源葉生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為YY90188 ;N2添加劑購自于invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號為17502048 ；B27添加劑購自于invitrogen，產(chǎn)品目錄號為 17504-044。所述川芎嗪在所述分化培養(yǎng)基中的濃度為10_6mOl/L-10_8mOl/L ;所述N2添加劑在所述分化培養(yǎng)基中的百分濃度為0.3-1% (質(zhì)量百分含量)；所述B27添加劑在所述分化培養(yǎng)基中的百分濃度為0.3-1% (質(zhì)量百分含量)。心肌細胞保存液I的制備方法:將10_6mol/L川芎嗪，0.3% N2添加劑，0.3% B27添加劑融入9 %生理鹽水。
心肌細胞保存液II的制備方法:將107moI/L川芎嗪，0.6% N2添加劑，0.6% B27添加劑融入9 %生理鹽水。心肌細胞保存液III的制備方法:將10_8mol/L川芎嗪，1% N2添加劑，1% B27添加劑融入9%生理鹽水。實施例2、人心肌細胞的細胞的擴大培養(yǎng)D-hank’ S平衡鹽液緩沖液:溶劑為水，含有如下溶質(zhì):0.8 %的NaCl、0.04 %的KCl、0.006% 的 Na2HPO1.H2O 和 0.006% 的 KH2PO1 ； %均為質(zhì)量百分含量。1、將I瓶人心肌細胞用IOml D_hank’ S平衡鹽液緩沖液清洗兩次。2、收集細胞，用胰酶37°C條件下消化6分鐘(5_7分鐘均可);消化過程中在倒置顯微鏡下觀察細胞，用手掌輕輕拍打培養(yǎng)瓶確保人心肌細胞完全消化。3、終止消化，然后每瓶中加入IOml D_hank’S平衡鹽液緩沖液，反復吹打使細胞懸浮，得到細胞懸液。4、將細胞懸液進行活細胞計數(shù)，方法如下:將細胞懸液和0.4%臺盼蘭溶液等體積混合，輕輕混勻；1分鐘后，在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)細胞；活細胞排斥臺盼蘭，染成藍色的細胞是死細胞。5、將細胞懸液移入離心管中，以2000rpm的離心速度離心lOmin，離心結束，棄上
清，獲得人心肌細胞。實施例3、實施例1制備 的心肌細胞保存液的應用將實施例2中的人心肌細胞分別重懸于實施例1制備的四種心肌細胞保存液，配比均為6.8 X IO5個人心肌細胞活細胞:1ml心肌細胞保存液，4°C保存12小時后取樣(細胞懸液)測定細胞存活率。細胞存活率測定方法:將0.5ml細胞懸液與0.5ml 0.2%臺盼蘭溶液混合，得到混合液；吸取10微升混合液，滴加在蓋片邊緣，使混合液充滿蓋片和計數(shù)板之間；靜置I分鐘；隨機選取幾個視野，共計數(shù)300個細胞(計數(shù)著色細胞數(shù)目，即死細胞數(shù)目)，細胞存活率=(300-死細胞數(shù)目)/300 X 100% ;重復計數(shù)5次，結果取5次計數(shù)的平均值。共進行三次重復實驗，結果取平均值，見表I。表I實施例3的實驗結果
權利要求
1.一種心肌細胞保存液，所述川芎嗪濃度為10_6mOl/L-10_8mOl/L ;所述N2添加劑百分濃度為1% (質(zhì)量百分含量)；所述B27添加劑百分濃度為1% (質(zhì)量百分含量)。
2.按權利要求1所述的心肌細胞保存液，其特征在于:所述川芎嗪濃度為IO-6Hiol/L-108mol/L，所述N2添加劑百分濃度為1% (質(zhì)量百分含量)，所述B27添加劑百分濃度為1% (質(zhì)量百分含量)，是用9%生理鹽水溶液配制成的。
3.權利要求1或2所述的心肌細胞保存液在保存心肌細胞中的應用。
4.按權利要求3所述的應用，其特征在于:所述心肌細胞為離體的心肌細胞。
5.按權利要求3或4所述的應用，其特征在于:所述心肌細胞為人心肌細胞。
6.一種保存心肌細胞的方法，是將心肌細胞懸浮于權利要求1或2所述的心肌細胞保存液，4-8°C保存12小時以下；所述心肌細胞和所述心肌細胞保存液的配比為6X 105-7X IO5個心肌細胞活細胞:lmL心肌細胞保存液。
7.按權利要求6所述的方法，其特征在于:所述心肌細胞為離體的心肌細胞。
8.按權利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述心肌細胞為人心肌細胞。
9.一種治療糖尿病的藥物，是將心肌細胞懸浮于權利要求1或2所述心肌細胞保存液得到的細胞懸液；所述心肌細胞和所述心肌細胞保存液的配比為6X105-7X IO5個心肌細胞活細胞=ImL心肌細胞保存液。
10.按權利要求9所述的藥物，其特征在于:所述心肌細胞為離體的心肌細胞，優(yōu)選為離體的人心 肌細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種心肌細胞保存液及其應用。本發(fā)明提供的心肌細胞保存液，10-6mol/L-10-8mol/L的川芎嗪濃度、1％(質(zhì)量百分含量)的N2添加劑和1％(質(zhì)量百分含量)所述B27添加劑是用9％生理鹽水溶液配制成的。本發(fā)明提供的心肌細胞保存液用于保存心肌細胞，在12小時以內(nèi)細胞存活率為89％以上，甚至達到97％以上。本發(fā)明公開的心肌細胞保存液具有穩(wěn)定性高、療效好、安全性高、無毒副作用、便于儲存和運輸，適應臨床大規(guī)模使用，應用前景廣闊的特點。
文檔編號A61K35/24GK103081893SQ20111034594
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權日2011年11月7日
發(fā)明者田杰 申請人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細胞科技有限公司