具有粘度改變表型的絲狀真菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述的是與具有改變的生長(zhǎng)特性的變異絲狀真菌相關(guān)的組合物和方法。此類變體非常適于在深層培養(yǎng)中生長(zhǎng)，例如用于大規(guī)模生產(chǎn)用于商業(yè)應(yīng)用的酶和其他蛋白質(zhì)。
【專利說(shuō)明】具有粘度改變表型的絲狀真菌
[0001]優(yōu)先權(quán)
[0002]本專利申請(qǐng)要求于2011年4月22日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/478，162和61/478，160 以及各自于 2011 年 4 月 29 日提交的 61/480，610,61/480, 602 和 61/480，629的優(yōu)先權(quán)，所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?jiān)诖艘砸玫姆绞饺牟⑷搿?br> 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明的菌株和方法涉及絲狀真菌中的基因突變，該基因突變產(chǎn)生具有改變的生長(zhǎng)特性的菌株變體。此類變體非常適于在深層培養(yǎng)中生長(zhǎng)，例如用于大規(guī)模生產(chǎn)用于商業(yè)應(yīng)用的酶和其他蛋白質(zhì)或代謝物。
【背景技術(shù)】
[0004]絲狀真菌能夠高水平表達(dá)天然和異源蛋白質(zhì)，從而使得它們非常適于大規(guī)模生產(chǎn)用于工業(yè)應(yīng)用、醫(yī)藥應(yīng)用、動(dòng)物健康應(yīng)用以及食品和飲料應(yīng)用的酶和其他蛋白質(zhì)。絲狀真菌通常在生物反應(yīng)器中的菌絲體深層培養(yǎng)中生長(zhǎng)，該生物反應(yīng)器適于將氧和營(yíng)養(yǎng)物引入培養(yǎng)基(即，肉湯)內(nèi)并在其中分布。菌絲體的形態(tài)特征影響肉湯的流變特性，從而影響生物反應(yīng)器性能。
[0005]一般來(lái)講，肉湯的粘度越高，氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分布越不均勻，攪拌培養(yǎng)物所需的能量越高。在一些情況下，肉湯的粘度變得足夠高而明顯妨礙氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解，從而不利地影響真菌的生長(zhǎng)。另外，混合粘稠肉湯以及對(duì)粘稠肉湯進(jìn)行充氣所需的能量可大大增加生產(chǎn)成本，以及招致在馬達(dá)和電源供應(yīng)方面的資本支出較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]描述的是涉及絲狀真菌的菌株和方法，所述絲狀真菌具有產(chǎn)生粘度改變表型的遺傳改變。
[0007]在一個(gè)方面，提供衍生自親本株的絲狀真菌變異株，該變異株包含引起變異株的細(xì)胞與親本株的細(xì)胞相比產(chǎn)生改變量的功能性Tps2蛋白的遺傳改變，其中變異株的細(xì)胞在深層培養(yǎng)中的好氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞肉湯，所述細(xì)胞肉湯(i)與親本株的細(xì)胞相比，需要改變的攪拌量來(lái)維持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量處維持改變的溶氧量。
[0008]在一些實(shí)施例中，功能性Tps2蛋白的改變量為減少量，并且變異株在深層培養(yǎng)中的好氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞肉湯，所述細(xì)胞肉湯(i)與親本株的細(xì)胞相比，需要減少的攪拌來(lái)維持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量處維持增加的溶氧量。
[0009]在一些實(shí)施例中，遺傳改變包含親本株中存在的tps2基因的破壞。在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞是tps2基因 的全部或部分缺失的結(jié)果。在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞是包含tps2基因的基因組DNA的一部分缺失的結(jié)果。在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞是tps2基因誘變的結(jié)果。
[0010]在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞使用位點(diǎn)特異性重組進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞與在tps2基因的基因座處引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。
[0011]在一些實(shí)施例中，變異株不產(chǎn)生功能性Tps2蛋白。在一些實(shí)施例中，變異株不產(chǎn)生Tps2蛋白。
[0012]在一些實(shí)施例中，變異株還包含編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的基因。在一些實(shí)施例中，變異株還含sfb3基因的破壞。在一些實(shí)施例中，變異株還包含sebl基因的破壞。在一些實(shí)施例中，變異株還包含sfb3基因和sebl基因的破壞。在一些實(shí)施例中，變異株還包含至少一個(gè)選自以下的基因的破壞:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gasl基因和crzl基因。在一些實(shí)施例中，變異株每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與親本株基本上相同量或更多的蛋白質(zhì)。
[0013]在一些實(shí)施例中，絲狀真菌為盤菌亞門(Pezizomycotina)物種。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌為木霉屬(Trichoderma)物種、曲霉屬(Aspergillus)物種、鐮刀菌屬(Fusarium)物種、足放線病菌屬(Scedosporium)物種、青霉屬(Penicillium)物種、金孢子菌屬(Chrysosporium)物種、頭抱霉屬(Cephalosporium)物種、籃狀菌屬(Talaromyces)物種、Geosmithia屬物種和鏈孢霉屬(Neurospora)物種。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌可包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)(此前分類為長(zhǎng)梗木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)和紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、黑曲霉(Aspergillus niger)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、解烏頭酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillusterreus) > 醬油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、多育賽多抱(Scedosporium pro lificans)、粗糖脈抱霉(Neurospora crassa)、繩狀青霉(Penicillium funiculosum)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、埃默森籃狀菌(Talaromyces (Geosmithia) emersonii)、腐皮鍵刀菌(Fusarium venenatum)和Chrysosporium lucknowense。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌為里氏木霉。
[0014]在另一個(gè)方面，提供產(chǎn)生絲狀真菌細(xì)胞變異株的方法，該方法包括:將遺傳改變引入絲狀真菌細(xì)胞的親本株中，與所述親本株的細(xì)胞相比所述遺傳改變改變了功能性Tps2蛋白的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生變異絲狀真菌細(xì)胞，該變異絲狀真菌細(xì)胞在深層培養(yǎng)中的好氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞肉湯，所述細(xì)胞肉湯(i)與親本株的細(xì)胞相比，需要改變的攪拌量來(lái)維持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量處維持改變的溶氧量。
[0015]在一些實(shí)施例中，遺傳改變減少或防止功能性Tps2蛋白的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生變異絲狀真菌細(xì)胞，該變異絲狀真菌細(xì)胞在深層培養(yǎng)中的好氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞肉湯，所述細(xì)胞肉湯(i)與親本株的細(xì)胞相比，需要減少的攪拌來(lái)維持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量處維持增加的溶氧量。
[0016]在一些實(shí)施例中，遺傳改變包含使用遺傳操作破壞親本絲狀真菌細(xì)胞中的tps2基因。在一些實(shí)施例中，遺傳改變包含使用遺傳操作缺失親本絲狀真菌細(xì)胞中的tps2基因。在一些實(shí)施例中，遺傳改變使用位點(diǎn)特異性遺傳重組進(jìn)行。
[0017]在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞與在tps2基因的基因座處引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，變異株每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與親本株基本上相同量或更多的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞與破壞sfb3基因組合進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞與破壞至少一個(gè)選自以下的基因組合進(jìn)行:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gasl基因和crzl基因。
[0018]在一些實(shí)施例中，變異株每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與親本株基本上相同量或更多的蛋白質(zhì)。
[0019]在一些實(shí)施例中，絲狀真菌為盤菌亞門(Pezizomycotina)物種。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌為木霉屬(Trichoderma)物種、曲霉屬(Aspergillus)物種、鐮刀菌屬(Fusarium)物種、足放線病菌屬(Scedosporium)物種、青霉屬(Penicillium)物種、金孢子菌屬(Chrysosporium)物種、頭抱霉屬(Cephalosporium)物種、籃狀菌屬(Talaromyces)物種、白喬史密斯霉屬(Geosmithia)物種和鏈孢霉屬(Neurospora)物種。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌可包括但不限于里氏木霉(此前分類為長(zhǎng)梗木霉和紅褐肉座菌)、黑曲霉、煙曲霉、解烏頭Ife曲霉、米曲霉、構(gòu)桌曲霉、土曲霉、醫(yī)油曲霉、日本曲霉、多育賽多抱、粗糖脈孢霉、繩狀青霉、產(chǎn)黃青霉、埃默森籃狀菌、腐皮鐮刀菌和勒克瑙金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)。在一些實(shí)施例中，絲狀真菌為里氏木霉。
[0020]在一些實(shí)施例中，親本株還包含編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的基因。在一些實(shí)施例中，在引入減少或防止功能性Tps2蛋白的產(chǎn)生的遺傳改變之前，編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的基因存在于親本株中。在一些實(shí)施例中，親本株內(nèi)的所關(guān)注的蛋白質(zhì)由內(nèi)源基因或異源基因編碼。
[0021]在另一方面，提供由上述變異株中任一者產(chǎn)生的所關(guān)注的蛋白質(zhì)。
[0022]在又一方面，提供由上述方法中任一者產(chǎn)生的且具有上述特性中任一者的絲狀真菌。
[0023]在另一個(gè)方面，提供衍生自親本株的絲狀真菌變異株，該變異株包含:(a)遺傳改變，所述遺傳改變使得(i)與親本`株的細(xì)胞相比，需要減少的攪拌來(lái)保持深層培養(yǎng)物中預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與親本株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量處保持深層培養(yǎng)物中增加的溶氧量；和(b)編碼所關(guān)注的蛋白的基因，其中所述編碼所關(guān)注的蛋白的基因在(a)中的遺傳改變之前存在于變異株中。
[0024]在一些實(shí)施例中，所得的變異株的遺傳改變包含親本株中存在的tps2基因的破壞。在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞與在tps2基因的基因座處引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞與破壞sfb3基因組合進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞與破壞sebl基因組合進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，tps2基因的破壞與破壞至少一個(gè)選自以下的基因組合進(jìn)行:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gasl基因和crzl基因。
[0025]根據(jù)本說(shuō)明書包括附圖，本發(fā)明的變異株和方法的這些及其他的方面和實(shí)施例將是顯而易見的。
[0026]附圖簡(jiǎn)述
[0027]圖1為如實(shí)例I中所述的tps2破壞載體pRATT251_tps2D_pyr2的圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0028]1.綜沭
[0029]本發(fā)明的菌株和方法涉及具有可影響其形態(tài)和生長(zhǎng)特性的遺傳修飾的絲狀真菌細(xì)胞變異株。當(dāng)在深層培養(yǎng)中培養(yǎng)該變異細(xì)胞時(shí)，其產(chǎn)生與包含親本株細(xì)胞的細(xì)胞肉湯相比具有不同流變特性的細(xì)胞肉湯。這些變異株中的一些非常適于大規(guī)模生產(chǎn)酶及其他在商業(yè)上重要的蛋白質(zhì)。
[0030]IL 穿 SL
[0031]在詳細(xì)描述本發(fā)明菌株和方法之前，為了清楚起見對(duì)如下術(shù)語(yǔ)進(jìn)行定義。未定義的術(shù)語(yǔ)應(yīng)該與它們?cè)谙嚓P(guān)領(lǐng)域中所用的普通含義一致。
[0032]如本文所用，“里氏木霉”是指子囊菌門(Ascomycota)盤菌亞門的絲狀真菌。該生物體此前被分類為長(zhǎng)梗木霉或被分類為紅褐肉座菌。
[0033]如本文所用，短語(yǔ)“絲狀真菌細(xì)胞的變異株”或類似短語(yǔ)是指例如通過(guò)遺傳操作，衍生自(即得自或可得自)屬于盤菌亞門的親本(或參照)株的絲狀真菌細(xì)胞的菌株。在本說(shuō)明書中，親本株和變異株可描述為具有某些特性，例如遺傳修飾、表達(dá)變型、形態(tài)等；然而，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在技術(shù)上具有此類特性的親本株或變異株的細(xì)胞和“菌株”為了方便起見而提及。
[0034]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“所關(guān)注的蛋白質(zhì)”是指期望在絲狀真菌中表達(dá)的多肽。此類蛋白質(zhì)可以是酶、底物結(jié)合蛋白質(zhì)、表面活性蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)等，并且可以高水平表達(dá)，并且可用于商業(yè)化的目的。所關(guān)注的蛋白質(zhì)可由相對(duì)于變異株和/或親本株的內(nèi)源基因或異源基因編碼。所關(guān)注的蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或作為分泌性蛋白表達(dá)。
[0035]如本文所用，短語(yǔ)“基本上無(wú)活性”或類似短語(yǔ)，意指特定的活性在混合物中不能檢測(cè)到或者其存在量不會(huì)干擾該混合物的預(yù)期目的。
[0036]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”(和/或它們各自的復(fù)數(shù)形式)可互換使用來(lái)指包含肽鍵連接的氨基酸殘基的任何長(zhǎng)度的聚合物。本文中使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母或三字母代碼。該聚合物可以是線性或分支的，其可包含經(jīng)修飾的氨基酸，并且其可夾雜有非氨基酸。所述術(shù)語(yǔ)還涵蓋天然改性或通過(guò)干預(yù)改性的氨基酸聚合物；所述干預(yù)例如是二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮骰蚋男?，如與標(biāo)記組分綴合。還包括在該定義中的是例如含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知的其他修飾的多肽。
[0037]如本文所用，功能上和/或結(jié)構(gòu)上類似的蛋白質(zhì)被視為“相關(guān)蛋白質(zhì)”。此類蛋白質(zhì)可衍生自不同屬和/或種的生物體、或甚至不同綱的生物體(例如細(xì)菌和真菌)。相關(guān)蛋白還涵蓋通過(guò)一級(jí)序列分析確定、通過(guò)二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)分析確定或通過(guò)免疫交叉反應(yīng)確定的同源物。
[0038]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“衍生的多肽/蛋白質(zhì)”是指通過(guò)在N末端或C末端任一端或這兩個(gè)末端添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸、在氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)不同位點(diǎn)置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸、在蛋白質(zhì)的任一端或兩個(gè)末端或在氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或在氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自或可衍生自蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)修飾編碼天然蛋白質(zhì)的DNA序列、將該DNA序列轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的宿主中并使該經(jīng)修飾的DNA序列表達(dá)而形成衍生的蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)衍生物的制備。
[0039]相關(guān)(和衍生)蛋白質(zhì)包括“變體蛋白質(zhì)”。變體蛋白質(zhì)通過(guò)在少數(shù)氨基酸殘基處的置換、缺失和/或插入而不同于參考蛋白質(zhì)/親本蛋白質(zhì)(例如野生型蛋白質(zhì))。變體蛋白與親本蛋白質(zhì)間的差異氨基酸殘基的數(shù)目可以為一個(gè)或多個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多個(gè)氨基酸殘基。變體蛋白可與參照蛋白具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或甚至至少約99或更多的氨基酸序列同一性。變體蛋白與參照蛋白的差別還可在于所選的基序、結(jié)構(gòu)域、表位、保守區(qū)等等。
[0040]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“類似序列”是指蛋白質(zhì)內(nèi)提供與所關(guān)注的蛋白質(zhì)(即通常是所關(guān)注的起始蛋白質(zhì))類似的功能、三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或保守殘基的序列。例如，在含有α-螺旋或β_片層結(jié)構(gòu)的表位區(qū)域中，類似序列中的置換氨基酸優(yōu)選維持相同的特異性結(jié)構(gòu)。該術(shù)語(yǔ)還指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，開發(fā)類似序列使得置換氨基酸導(dǎo)致顯示類似或改善功能的變體酶。在一些實(shí)施例中，所關(guān)注蛋白質(zhì)中的氨基酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或保守殘基位于或接近所關(guān)注的區(qū)段或片段。因而，若所關(guān)注的區(qū)段或片段含有例如α -螺旋或β -片層結(jié)構(gòu)，則置換氨基酸優(yōu)選維持該特異性結(jié)構(gòu)。
[0041]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“同源蛋白”是指具有與參照蛋白類似的活性和/或結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。同源物不一定是進(jìn)化相關(guān)的。因而，預(yù)期該術(shù)語(yǔ)涵蓋從不同生物體獲得的相同、類似或?qū)?yīng)的酶(例如，就結(jié)構(gòu)和功能而言)。在一些實(shí)施例中，希望鑒定具有與參照蛋白類似的四級(jí)、三級(jí)和/或一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源物。在一些實(shí)施例中，同源蛋白可誘導(dǎo)與參照蛋白類似的免疫應(yīng)答。在`一些實(shí)施例中，同源蛋白經(jīng)工程改造而產(chǎn)生具有所需活性的酶。
[0042]序列間的同源性程度可使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法確定(參見例如 Smith 和 Waterman(1981)Adv.Appl.Math《高等應(yīng)用數(shù)學(xué)》2:482 ；Needleman 和Wunsch (1970) J.Mol.Biol《分子生物學(xué)雜志》，48:443 ；Pearson 和 Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，85:2444 ;程序，諸如在威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics Software Package,得自威斯康星州麥迪遜市遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(Genetics Computer Group, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ；和Devereux 等人(1984)Nucleic Acids Res《核酸研究》12:387-95)。
[0043]例如，PILEUP是測(cè)定序列同源性水平的有用程序。PILEUP利用漸進(jìn)性雙序列比對(duì)從一組相關(guān)序列產(chǎn)生多序列比對(duì)。其還可繪出關(guān)系樹，該關(guān)系樹示出了用于產(chǎn)生比對(duì)的聚類關(guān)系。PILEUP使用Feng和Doolittle的漸進(jìn)式比對(duì)方法(Feng和Doolittle，(1987)，(J.Mol.Evol《分子進(jìn)化雜志》35:351-60)的簡(jiǎn)化版。該方法類似于Higgins和Sharp ((1989) CABIOS 5:151-53)所描述的方法。可用的PILEUP參數(shù)包括:默認(rèn)空位權(quán)重=3.00，默認(rèn)空位長(zhǎng)度權(quán)重=0.10，以及加權(quán)的末端空位。可用的算法的另一例子是由Altschul 等人((1990) J.Mol.Biol《分子生物學(xué)雜志》215:403-10)和 Karlin 等人，((1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》90:5873-87)描述的BLAST算法。一種特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(參見，例如，Altschul等人(1996)Meth.Enzymol《酶學(xué)方法》266:460-80)。參數(shù)“W”、“T”和“X”決定比對(duì)的靈敏度和速度。BLAST程序使用下述作為缺省值:字長(zhǎng)(W) 11、BL0SUM62評(píng)分矩陣(參見，例如，Henikoff和Henikoff (1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》89:10915)比對(duì)(B) 50次、期望值(E) 10、W 5、K -4和兩條鏈的比較。
[0044]如本文所用，在至少兩個(gè)核酸或多肽的背景下，短語(yǔ)“基本上相似”和“基本上相同”通常意指與參照(例如野生型)序列相比，多核苷酸或多肽包含具有至少約70%同一性、至少約75%同一性、至少約80%同一性、至少約85%同一性、至少約90%同一性、至少約91%同一^丨生、至少約92%同一丨丨生、至少約93%同一丨丨生、至少約94%同一‘丨生、至少約95%同一‘丨生、至少約96%同一性、至少約97%同一性、至少約98%同一性或甚至至少約99%同一性或更高同一性的序列。序列同一性可用已知的程序如BLAST、ALIGN和CLUSTAL，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)測(cè)定。(參見，例如，Altschul 等人(1990) J.Mol.Biol《分子生物學(xué)雜志》215:403-410);Henikoff等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》89:10915 ;Karin 等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》90:5873 ;以及 Higgins 等人(1988) Gene《基因》73:237-244)。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公開獲得。另外,可使用FASTA對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索(Pearson 等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》85:2444-48)。兩個(gè)多肽基本上相同的一個(gè)指示是第一多肽與第二多肽是免疫交叉反應(yīng)性的。通常，差別在于保守氨基酸置換的多肽是免疫交叉反應(yīng)性的。因而，例如，若兩個(gè)肽差別僅在于保守置換，則多肽基本上與第二多肽相同。兩種核酸序列基本上一致的另一個(gè)指示是兩種分子在嚴(yán)格的條件(如，在中至高嚴(yán)格度的范圍內(nèi))下彼此雜交。
[0045]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”與術(shù)語(yǔ)“等位基因”在關(guān)于編碼和引導(dǎo)蛋白質(zhì)或RNA表達(dá)的核酸時(shí)是同義的。絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)體形式通常是單倍體，因而單拷貝的指定基因(即單個(gè)等位基因)足以賦予指定表型。
[0046]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“野生型的”和“天然的”可互換使用并且是指自然中存在的基因、蛋白質(zhì)或株系。
[0047]如本文所用，“缺失基因”是指從宿主細(xì)胞的基因組移除基因。當(dāng)基因包括未緊鄰基因的編碼序列的控制元件(例如，增強(qiáng)子元件)時(shí)，基因的缺失是指編碼序列的缺失，以及任選的相鄰增強(qiáng)子元件(包括但不限于例如啟動(dòng)子和/或終止序列)的缺失。
[0048]如本文所用，“基 因的破壞”泛指在宿主細(xì)胞中基本上防止細(xì)胞產(chǎn)生功能基因產(chǎn)物，例如蛋白質(zhì)的任何遺傳或化學(xué)操作，即突變。破壞方法的例子包括完全或部分缺失基因的任何部分，包括多肽編碼序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或另一調(diào)控元件，或者誘變上述者，其中誘變涵蓋置換、插入、缺失、倒位以及它們的組合和變型形式，上述突變中的任一者可基本上防止功能基因產(chǎn)物的產(chǎn)生?；蜻€可使用RNA1、反義或廢止基因表達(dá)的任何其他方法來(lái)破壞。
[0049]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“遺傳操作”和“遺傳改變”可交換使用并且是指核酸序列的改變/變化。該改變可包括但不限于核酸序列中的至少一個(gè)核酸的置換、缺失、插入或化學(xué)修飾。
[0050]如本文所用，“好氧發(fā)酵”是指在存在氧氣的情況下的生長(zhǎng)。
[0051]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞肉湯”統(tǒng)指液體/深層培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基和細(xì)胞。
[0052]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞群(cell mass) ”是指液體/深層培養(yǎng)物中存在的細(xì)胞組分(包括完整的和溶解的細(xì)胞)。細(xì)胞群可以干重或濕重表示。
[0053]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“流變學(xué)”是指研究物質(zhì)形變和流動(dòng)的物理學(xué)分支。
[0054]如本文所用，“粘度”是流體對(duì)機(jī)械應(yīng)力(如剪切應(yīng)力或拉伸應(yīng)力)引起的形變的抗性的量度。在本發(fā)明背景下，粘度還可指包含絲狀真菌細(xì)胞的細(xì)胞肉湯對(duì)例如通過(guò)轉(zhuǎn)子/葉輪所提供的機(jī)械應(yīng)力的抗性。由于細(xì)胞肉湯的粘度可能難以直接測(cè)量，可使用粘度的間接量度，如在預(yù)選的攪拌量處培養(yǎng)物肉湯的溶氧量、維持預(yù)選溶氧量所需的攪拌量、攪拌細(xì)胞肉湯以維持所選溶氧量所需的能量量或甚至是固體培養(yǎng)基上的集落形態(tài)。[0055]如本文所用，絲狀真菌細(xì)胞的“粘度改變”變異株是指產(chǎn)生這樣的細(xì)胞肉湯的變異株，該細(xì)胞肉湯與親本株產(chǎn)生的等價(jià)細(xì)胞肉湯相比具有減少的或增加的粘度(即，減少的或增加的對(duì)剪切或拉伸應(yīng)力的抗性)。一般來(lái)講，相當(dāng)?shù)募?xì)胞肉湯或等價(jià)的細(xì)胞肉湯具有相當(dāng)?shù)募?xì)胞群。優(yōu)選地，關(guān)于粘度的任何直接或間接量度，粘度改變的變異株與親本株之間的差別為至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。本發(fā)明描述了用于比較絲狀真菌細(xì)胞肉湯的粘度的方法。
[0056]如本文所用，絲狀真菌細(xì)胞的“粘度降低”變異株是指產(chǎn)生這樣的細(xì)胞肉湯的變異株，該細(xì)胞肉湯與親本株產(chǎn)生的等價(jià)細(xì)胞肉湯相比具有減少的粘度(即減少的對(duì)剪切或拉伸應(yīng)力的抗性)。優(yōu)選地，關(guān)于粘度的任何直接或間接量度，粘度改變的變異株與親本株之間的差別為至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。
[0057]如本文所用，“溶氧”(DO)是指以體積/體積單位測(cè)量的液體培養(yǎng)基中存在的氧(O2)量。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，溶氧水平可維持在高的水平，例如170-100%至20%之間、100-80%至20%之間、70%至20%之間、65%至20%之間、60%至20%之間、55%至20%之間、50%至20%之間、45%至20%之間、44%至20%之間、43%至20%之間、42%至20%之間、41%至20%之間、40%至20%之間、35%至20%之間、30%至20%之間以及25%至20%之間。具體地講，溶氧可在發(fā)酵開始時(shí)高并且允許隨著發(fā)酵進(jìn)行而下降。溶解氧水平可受在其下攪拌例如攪動(dòng)發(fā)酵的速率和/或受空氣或氧的添加速率控制。培養(yǎng)物可以400-700rpm攪拌例如攪動(dòng)，并且溶解氧水平通過(guò)改變空氣或氧流速和葉輪速度維持超過(guò)20%、超過(guò)25%、超過(guò)30%、超過(guò)35%、超過(guò)40%、超過(guò)45%、超過(guò)50%和超過(guò)55%或更多。
[0058]如本文所用，“主要遺傳定子 ”是指基因或其遺傳操作，該基因或其遺傳操作是在缺少其他基因或其他基因的遺傳操作的情況下賦予指定表型所必要且充分的。然而，特定基因是賦予指定表型所必要且充分的并不排除可通過(guò)進(jìn)一步的遺傳操作實(shí)現(xiàn)對(duì)表型的附加影響的可能性。
[0059]如本文所用，“功能性多肽/蛋白質(zhì)”為具有活性，例如酶活性、結(jié)合活性、表面活性性質(zhì)等，并且尚未被誘變、截短或以其他方式修飾來(lái)廢止或降低該活性的蛋白質(zhì)。如所指定的，功能性多肽可以是熱穩(wěn)定性的或不耐熱的。
[0060]如本文所用，“功能性基因”為能夠被細(xì)胞組分用于產(chǎn)生活性基因產(chǎn)物，通常是蛋白質(zhì)的基因。功能性基因是被破壞的基因的對(duì)立物，被破壞的基因被修飾而使得它們不能被細(xì)胞組分用于產(chǎn)生活性基因產(chǎn)物，或者具有降低的被細(xì)胞組分用于產(chǎn)生活性基因產(chǎn)物的能力。
[0061]如本文所用，如果變異株與親本株之間蛋白質(zhì)的表達(dá)差異小于約20%、小于約15%、小于約10%、小于約7%、小于約5%、或甚至小于約3%，則相比于親本株，變異細(xì)胞“維持或保持高的蛋白質(zhì)表達(dá)和/或分泌水平”。
[0062]如本文所用，如果宿主細(xì)胞已通過(guò)遺傳方式或化學(xué)方式改變而防止產(chǎn)生表現(xiàn)具有野生型蛋白質(zhì)的特征性活性，尤其是促進(jìn)菌絲伸長(zhǎng)或以其他方式增加液體培養(yǎng)物中絲狀真菌的粘度的活性的功能性蛋白質(zhì)/多肽，則宿主細(xì)胞已經(jīng)“經(jīng)過(guò)修飾而防止產(chǎn)生規(guī)定的蛋白質(zhì)”。此類修飾包括但不限于缺失或破壞編碼該蛋白質(zhì)的基因、修飾該基因而使得所編碼的多肽缺少上述活性、修飾該基因以影響翻譯后加工或穩(wěn)定性、以及它們的組合。[0063]如本文所用，“所關(guān)注的蛋白質(zhì)”為期望在絲狀真菌細(xì)胞的深層培養(yǎng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。一般來(lái)講，所關(guān)注的蛋白質(zhì)在商業(yè)上對(duì)于工業(yè)用途、醫(yī)藥用途、動(dòng)物健康用途以及食品和飲料用途而言是重要的，從而使得期望它們大量產(chǎn)生。要將所關(guān)注的蛋白質(zhì)與由絲狀真菌細(xì)胞表達(dá)的眾多其他蛋白質(zhì)區(qū)分開，后者通常不作為產(chǎn)物被關(guān)注，并且主要被視為本底蛋白質(zhì)污染物。
[0064]如本文所用，若相比于親本株產(chǎn)生的蛋白量，變異株產(chǎn)生的蛋白量減少不超過(guò)20%、減少不超過(guò)15%、減少不超過(guò)10%或甚至減少不超過(guò)5%，其中蛋白量被歸一化為測(cè)定了蛋白產(chǎn)量的細(xì)胞的生物質(zhì)總量，其中生物質(zhì)可用濕重(如，細(xì)胞團(tuán)塊)或干重方式表示，則變異株每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與親本株“基本上等量”的蛋白質(zhì)。
[0065]如本文所用，若相比于親本株，變異株產(chǎn)生的蛋白量增加至少5%、增加至少10%、增加至少15%或更多，其中蛋白量被歸一化為測(cè)定了蛋白產(chǎn)量的細(xì)胞的生物質(zhì)總量，其中生物質(zhì)可用濕重(如，細(xì)胞團(tuán)塊)或干重方式表示，則變異株較之親本株“每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生基本上更多的蛋白質(zhì)”。
[0066]如本文所用，“熒光染料”為發(fā)熒光的染料。優(yōu)選的熒光染料與真菌細(xì)胞壁中的纖維素和/或幾丁質(zhì)結(jié)合。
[0067]如本文所用，單數(shù)冠詞“一個(gè)”、“一種”和“所述”涵蓋多個(gè)指代物，除非上下文明確指明不是這樣。特此以引用的方式將本文所引用的所有參考文獻(xiàn)全文并入本文。如下縮寫/首字母縮寫具有如下含義，除非另外規(guī)定: [0068]
【權(quán)利要求】
1.一種衍生自親本株的絲狀真菌變異株，所述變異株包含引起所述變異株的細(xì)胞與所述親本株的細(xì)胞相比產(chǎn)生改變量的功能性Tps2蛋白的遺傳改變，其中所述變異株的細(xì)胞在深層培養(yǎng)中的好氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞肉湯，所述細(xì)胞肉湯(i)與所述親本株的細(xì)胞相比，需要改變的攪拌量來(lái)維持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量處維持改變的溶氧量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變異株，其中所述功能性Tps2蛋白的改變量為減少量，并且所述變異株在深層培養(yǎng)中的好氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞肉湯，所述細(xì)胞肉湯(i)與所述親本株的細(xì)胞相比，需要減少的攪拌來(lái)維持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量處維持增加的溶氧量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的變異株，其中所述遺傳改變包含所述親本株中存在的tps2基因的破壞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的變異株，其中所述tps2基因的破壞是所述tps2基因的全部或部分缺失的結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的變異株，其中所述tps2基因的破壞是包含所述tps2基因的基因組DNA的一部分缺失的結(jié)果。
6.根據(jù)任何權(quán)利要求3所述的變異株，其中所述tps2基因的破壞是所述tps2基因誘變的結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述的變異株，其中所述tps2基因的破壞使用位點(diǎn)特異性重組進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項(xiàng)`所述的變異株，其中所述tps2基因的破壞與在所述tps2基因的基因座處引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的變異株，其中所述變異株不產(chǎn)生功能性Tps2蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的變異株，其中所述變異株不產(chǎn)生Tps2蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求ι-?ο中任一項(xiàng)所述的變異株，其中所述變異株還包含編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的變異株，其還包含sfb3基因的破壞。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的變異株，其還包含至少一個(gè)選自以下的基因的破壞:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gas I基因和crzl基因。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的變異株，其中所述變異株每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與所述親本株基本上相同量或更多的蛋白質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的變異株，其中所述絲狀真菌為盤菌亞門(Pezizomycotina)物種。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的變異株，其中所述絲狀真菌為木霉屬(Trichoderma)物種。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的變異株，其中所述絲狀真菌為里氏木霉(Trichoderma reesei)。
18.—種產(chǎn)生絲狀真菌細(xì)胞變異株的方法，其包括:將遺傳改變引入絲狀真菌細(xì)胞的親本株中，與所述親本株的細(xì)胞相比所述遺傳改變改變了功能性Tps2蛋白的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生變異絲狀真菌細(xì)胞，所述變異絲狀真菌細(xì)胞在深層培養(yǎng)中的好氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞肉湯，所述細(xì)胞肉湯(i)與所述親本株的細(xì)胞相比，需要改變的攪拌量來(lái)維持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量處維持改變的溶氧量。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述遺傳改變減少或防止功能性Tps2蛋白的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生變異絲狀真菌細(xì)胞，所述變異絲狀真菌細(xì)胞在深層培養(yǎng)中的好氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生這樣的細(xì)胞肉湯，所述細(xì)胞肉湯(i)與所述親本株的細(xì)胞相比，需要減少的攪拌來(lái)維持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量處維持增加的溶氧量。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述遺傳改變包含使用遺傳操作破壞親本絲狀真菌細(xì)胞中的所述tps2基因。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述遺傳改變包含使用遺傳操作缺失親本絲狀真菌細(xì)胞中的所述tps2基因。
22.根據(jù)權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述遺傳改變使用位點(diǎn)特異性遺傳重組進(jìn)行。
23.根據(jù)權(quán)利要求18-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述tps2基因的破壞與在所述tps2基因的基因座處引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。
24.根據(jù)權(quán)利要求18-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述tps2基因的破壞與破壞所述sfb3基因組合進(jìn)行。
25.根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述tps2基因的破壞與至少一個(gè)選自以下的基因的破壞組合進(jìn)行:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gasl基因和crzl基因。`
26.根據(jù)權(quán)利要求18-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述變異株每單位量生物質(zhì)產(chǎn)生與所述親本株基本上相同量或更多的蛋白質(zhì)。
27.根據(jù)權(quán)利要求18-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述絲狀真菌為盤菌亞門物種。
28.根據(jù)權(quán)利要求18-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述絲狀真菌為木霉屬物種。
29.根據(jù)權(quán)利要求18-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述絲狀真菌為里氏木霉。
30.根據(jù)權(quán)利要求18-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述親本株還包含編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的基因。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中在引入所述減少或防止功能性Tps2蛋白的產(chǎn)生的遺傳改變之前，所述編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的基因存在于所述親本株中。
32.—種所關(guān)注的蛋白質(zhì)，其由根據(jù)權(quán)利要求11所述的變異株產(chǎn)生。
33.一種絲狀真菌變異株，其通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求18-31中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生。
34.一種衍生自親本株的絲狀真菌變異株，其包含: (a)遺傳改變，所述遺傳改變導(dǎo)致(i)與所述親本株的細(xì)胞相比，在深層培養(yǎng)物中需要減少的攪拌來(lái)維持預(yù)選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本株的細(xì)胞相比，在預(yù)選的攪拌量處維持深層培養(yǎng)物中增加的溶氧量，和 (b)編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的基因， 其中所述編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的基因在(a)中的所述遺傳改變之前存在于所述變異株中。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的變異株，其中所述遺傳改變包含所述親本株中存在的所述tps2基因的破壞。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的變異株，其中所述tps2基因的破壞與在所述tps2基因的基因座處引入選擇性標(biāo)記組合進(jìn)行。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的變異株，其中所述tps2基因的破壞與破壞至少一個(gè)選自以下的基因組合進(jìn)行:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gasl基因和crzl基因。
38.根據(jù)權(quán)利要求35-37中任一項(xiàng)所述的變異株，其中所述tps2基因的破壞與破壞所述sebl基因組合進(jìn)行。`
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103517981SQ201280019432
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月22日
【發(fā)明者】E·A·博迪, R·J·普萊特二世 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司