一種高吸附鎘的絲狀真菌產(chǎn)黃青霉j-5及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高吸附鎘的絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5及制備方法和應(yīng)用，步驟是：首先稱取10g鎘污染土壤于90mL的滅菌生理鹽水中，于恒溫?fù)u床上振蕩，靜置后，取上清液進(jìn)行稀釋；其次是將不同稀釋倍數(shù)的稀釋液涂布在含有10mM鎘的馬丁孟加拉紅平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第三是將平板上生長(zhǎng)的微生物進(jìn)行劃線分離純化，然后重新涂布到上述含鎘的馬丁孟加拉紅平板上進(jìn)行培養(yǎng)；第四是經(jīng)分離篩選后，保存對(duì)鎘具有穩(wěn)定抗性能力的菌株，在PDA斜面上進(jìn)行保存。獲得的絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5對(duì)多種重金屬具有高耐受性和高吸附特性，原料易獲取，成本低廉。該菌株對(duì)環(huán)境中的重金屬具有較高的固定能力，能降低其生物毒害性，適用于大面積污染土壤的原位修復(fù)。
【專利說明】一種高吸附鎘的絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境治理領(lǐng)域。更具體涉及一種對(duì)多種重金屬具有高耐受性和高吸附能力的絲狀真菌的制備方法，同時(shí)還涉及一種絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]鎘(Cd)在自然界中主要以硫鎘礦等13種礦物的形式存在，且常伴生于其他金屬礦，如鉛鋅礦等。Cd在地殼中的平均濃度為0.15mg/Kg (顏明娟，1999)，土壤Cd濃度在
0.01_2mg/Kg,各類水體中Cd濃度為0.11-10 μ g/Kg。雖然正常情況下,Cd在自然環(huán)境中以痕量的狀態(tài)存在，但是人類的活動(dòng)使其在環(huán)境中的含量以及分布范圍日益擴(kuò)大。如Cd可以直接進(jìn)入大氣、水體和土壤，并在不同環(huán)境中遷移，造成環(huán)境污染；尤其是工業(yè)廢水廢渣廢氣的排放，更是造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。
[0003]土壤環(huán)境中，Cd以多種形態(tài)存在。依據(jù)Sposito連續(xù)提取法(1982)，土壤中的鎘的形態(tài)可分為交換態(tài)、水溶態(tài)、有機(jī)結(jié)合態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、硫化物殘?jiān)鼞B(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)。Cd在土壤中各種形態(tài)所占比例的不 同，直接影響其在土壤中的遷移、轉(zhuǎn)化、吸附、解吸能力，以及對(duì)生物的生理毒性。按照Cd對(duì)生物可利用性由高到低分別為:水溶態(tài)和交換態(tài)〉碳酸鹽結(jié)合態(tài) > 有機(jī)結(jié)合態(tài) > 殘?jiān)鼞B(tài)。水溶態(tài)和交換態(tài)Cd對(duì)生物毒性最強(qiáng)。土壤中Cd的存在形態(tài)受到其本身的性質(zhì)、含量、土壤組成結(jié)構(gòu)(如:有機(jī)質(zhì)、碳酸鹽、礦物和微生物)和環(huán)境條件(如:PH，溫度和濕度等)的影響。因此，隨著環(huán)境的變化，Cd的各種形態(tài)之間是可以發(fā)生轉(zhuǎn)化的，且這種轉(zhuǎn)化行為在一定的體系中與一般的化學(xué)平衡原理相似，如酸堿平衡、氧化還原、吸附解吸、配位平衡以及沉淀溶解之間的平衡。不過，因?yàn)橥寥辣旧硎且粋€(gè)復(fù)雜的體系，這種轉(zhuǎn)化行為可能會(huì)更加復(fù)雜(廖敏等，1999)。
[0004]在水環(huán)境中，Cd的主要以離子態(tài)鎘存在。此外，Cd可與水體中的多種配體形成可溶物，如Cd (or) +，HCd02_，CdCl+, Cd (NH3)2+，Cd (HCO3) 2等。Cd在水體中的遷移能力可認(rèn)為是:離子態(tài)〉絡(luò)合態(tài)〉難溶態(tài)。姚重華等(1982)研究表明水環(huán)境發(fā)生重金屬污染時(shí)，Cd總量的增加對(duì)自身分布除對(duì)吸附態(tài)有所改變外基本不會(huì)對(duì)原來的形態(tài)分布造成影響。水體中的懸浮物，沉積物，水生生物等因素均會(huì)影響水體中不同形態(tài)Cd之間的轉(zhuǎn)化。環(huán)境中Cd的不同形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化行為為環(huán)境中Cd污染的治理提供了一定的理論支持，如何有效降低環(huán)境中Cd的生物有效性，減少Cd在農(nóng)產(chǎn)品中的富集，是近些年來國(guó)內(nèi)外環(huán)保領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)(Reddy and Parupudi, 1997;Basta et al., 2001;Diels etal., 2002;ffei andZhou, 2006)。
[0005]傳統(tǒng)治理重金屬污水的方法確實(shí)收到了一定的效果，但是面對(duì)污染日益嚴(yán)重的現(xiàn)狀，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看這些方法不同程度的存在成本高、能耗高、操作繁瑣，容易引發(fā)二次污染等缺點(diǎn)。自從1949年Ruchhoft提出了生物吸附法(活性污泥)去除污水中的重金屬钚( 239Pu)以來，生物法修復(fù)重金屬污水受到越來越多的關(guān)注，特別是利用微生物處理重金屬污水的研究逐漸成為研究熱點(diǎn)(Kratochvil and Volesky, 1998; Volesky, 1999)。
[0006]在生物吸附治理重金屬污染過程中，絲狀真菌受到了廣泛的關(guān)注。真菌的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)類似于離子型交換樹脂，具有潛在的吸附，離子交換以及共價(jià)結(jié)合重金屬離子的能力(Gadd, 1993; KrantzRiilcker et al., 1993; Kapoor et al.，1999)。真菌對(duì)于重金屬離子的吸附機(jī)制從能量代謝角度可以分為兩種不同的類型:一種是迅速作用的非能量依賴性，主要是通過菌體表面的一些結(jié)構(gòu)如羧基，羥基，巰基及磷酸基團(tuán)等進(jìn)行的物理化學(xué)吸附(Gadd, 1993)，另一種則是緩慢的生理代謝依賴型，如跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞內(nèi)沉淀(Vodnik etal., 1998) 0因此，活的菌體和死亡的菌絲體都可以用作處理重金屬的生物吸附劑。一些研究甚至表明死亡的菌絲體對(duì)于重金屬的吸附量要大于活的菌體。Jarosz-WilkoLazka等(2002)研究了白腐真菌Trametesversicolor對(duì)重金屬Cd的吸附能力，發(fā)現(xiàn)白腐真菌對(duì)于液相環(huán)境的Cd具有很強(qiáng)的吸附能力；經(jīng)過兩個(gè)小時(shí)的處理，可以去除大部分的Cd。其中快速的能量非依賴型的吸附量可以達(dá)到-2mg/(g干菌體)，而慢速的能量依賴型的吸附量為-0.3mg/(g干菌體)。Malik (2004)認(rèn)為利用活細(xì)胞來進(jìn)行重金屬的生物吸附將更符合實(shí)際，且能表現(xiàn)出更好的效果。
[0007]真菌對(duì)重金屬的耐受性或抗性有著多種不同的生物學(xué)機(jī)制，如胞外分泌物對(duì)重金屬的沉淀作用、絡(luò)合作用、結(jié)晶化作用、金屬價(jià)態(tài)的轉(zhuǎn)變、細(xì)胞壁組分及色素分子對(duì)重金屬離子的吸附、壁膜滲透性的改變、主動(dòng)外排機(jī)制以及細(xì)胞內(nèi)的富集隔離等(Gadd, 1993;Mehra andWinge, 1991)。Zafar等(2007)從重金屬污染的農(nóng)田土壤中篩選到兩株具有重金屬抗性的絲狀真菌，鑒定為Aspergillus和Rhizopus。這兩株絲狀真菌對(duì)CM及Cr具有高生物吸附能力，顯示出潛在的重金屬生物吸附劑的運(yùn)用前景。而更早的Wasay等(1998)利用Aspergillus niger可以產(chǎn)生有機(jī)酸的特性來處理三種不同質(zhì)地的重金屬污染的土壤(粘壤土，粘土，沙土)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過20到25天的處理，可以使這三種土壤中的重金屬符合魁北克所制定的土壤重金屬標(biāo)準(zhǔn)?？傮w而言，目前利用真菌處理重金屬污染土壤的報(bào)道不多，真菌資源相當(dāng)有限，成熟的處理工藝和方法還有待進(jìn)一步的研發(fā)和完善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是在于提供了一種高效吸附重金屬的絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5。本發(fā)明從鎘污染土壤中分離了一株絲狀真菌`。該菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下能顯著吸附重金屬鎘；同時(shí)，該絲狀真菌與小白菜共生水培顯示該絲狀真菌可以高效吸附固定培養(yǎng)液中的鎘，降低其生物有效性，提高植物的產(chǎn)量并降低植物對(duì)鎘的吸收，顯示了本發(fā)明所提供的絲狀真菌在重金屬污染土壤及水體治理過程中的廣闊運(yùn)用前景。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種高效吸附重金屬的絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5的制備方法，該制備方法簡(jiǎn)便快捷，所獲取的菌體具有高吸附重金屬的能力，且吸附過程不受營(yíng)養(yǎng)條件的限制。
[0010]本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供了一種絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5在重金屬污染水體及土壤的生物修復(fù)中的應(yīng)用。絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5可以有效吸附固定重金屬，降低其生物有效性，達(dá)到治理重金屬污染的目的，且其具有成本低廉、不易引起二次污染的特點(diǎn)，具備商業(yè)化發(fā)展的潛力。
[0011]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0012]一種高效吸附重金屬的絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5的制備方法，其步驟為分離、純化和復(fù)篩。具體過程為:首先稱取IOg鎘污染土壤于90mL的滅菌生理鹽水中，于28°C恒溫?fù)u床上150r/min振蕩15min，靜置Imin后，取上清液進(jìn)行10倍系列稀釋；其次是將100 μ L不同稀釋倍數(shù)的稀釋液涂布在含有IOmM鎘的馬丁孟加拉紅平板上，倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d ;第三是將平板上生長(zhǎng)的微生物進(jìn)行劃線分離純化，然后重新涂布到上述含鎘的馬丁孟加拉紅平板上進(jìn)行培養(yǎng)；第四是經(jīng)10次分離篩選后，保存對(duì)鎘具有穩(wěn)定抗性能力的菌株，在PDA斜面上進(jìn)行保存，備用。
[0013] 申請(qǐng)人:將上述分離得到的菌株中的一株菌命名為絲狀真菌J-5，并鑒定為產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum) J-5, 申請(qǐng)人:于2012年4月24日將該菌株送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為=CCTCC NO:M2012137,分類命名:產(chǎn)黃青霉 J_5Penicillium chrysogenum J-5。
[0014]絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5的特性如下:
[0015]①生物學(xué)特性:絲狀真菌，帚狀分支結(jié)構(gòu)明顯，專性需氧，最適生長(zhǎng)溫度200C-28°C ;在PDA培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量大，孢子形成初期為淡綠色，后期為墨綠色，培養(yǎng)中后期有明顯黃色色素產(chǎn)生。
[0016]②遺傳學(xué)特性:結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物鑒定確認(rèn)該菌為產(chǎn)黃青霉。
[0017]③培養(yǎng)條件:保存該真菌及獲取其孢子時(shí)所使用的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；用于吸附實(shí)驗(yàn)及測(cè)試其對(duì)重金屬耐受性用礦物鹽培養(yǎng)基(麗):(NH4) 2S045g/L; KH2PO415g/L; MgSO40.6g/L; CaCl20.6g/L; FeSO4.7Η20 5mg/L; CoCl22mg/L;葡萄糖 20g/L，pH 5.0.121。。高壓蒸汽滅菌30min。培養(yǎng)該菌可以孢子的形式進(jìn)行接種:以2%體積比的吐溫-80沖洗PDA斜面上的孢子，然后用0.2%體積比的吐溫-80稀釋至需要的孢子濃度后接種，并進(jìn)行28°C，150r/min搖瓶培養(yǎng)。圖1為J-5在礦物鹽(MM)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，培養(yǎng)5d后進(jìn)入平臺(tái)期。
[0018]③功能特性:具有對(duì)多種重金屬的耐受性。按1%接種量接種絲狀真菌J-5孢子懸液到含特定重金屬濃度的礦物 鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，7d后觀察其生長(zhǎng)狀況。絲狀真菌J-5對(duì)不同重金屬離子的耐受性檢測(cè)結(jié)果為:液體培養(yǎng)條件下對(duì)鎘(Cd2+)320mM、銅(Cu2+)80mM、鈷(Co2+) 30mM、鉻(Cr6+) 5mM、鉻(Cr3+) 35mM、鋅(Zn2+) 70mM等重金屬有較好的耐受性。
[0019]一種絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5在重金屬污染水體及土壤的生物修復(fù)中的應(yīng)用，其步驟是:
[0020](I)靜態(tài)鎘吸附:
[0021]將菌株絲狀真菌J-5在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d后，收集孢子，制備孢子懸液；然后按照1:100的比例接種到200mL的新鮮礦物鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d，過濾收集菌體并進(jìn)行真空冷凍干燥；然后，將干菌粉過300 μ m孔徑的篩子后，用于吸附鎘的分析。
[0022]將0.0lg的經(jīng)過上述預(yù)處理的菌粉，加入到含有20mL鎘溶液的50mL離心管中，然后將離心管置于28°C恒溫?fù)u床中，150r/min維持240min。吸附過程中分別在0，15，30，45，60，120,180和240min取100 μ L上清液，稀釋后進(jìn)行鎘含量分析。
[0023](2)電鍍廢水中重金屬移除實(shí)驗(yàn):
[0024]發(fā)明人測(cè)試了絲狀真菌J-5對(duì)實(shí)際電鍍廢水中重金屬移除能力。采用實(shí)施例2.1相同的處理方法，制備干菌粉。將0.0lg的干菌粉加入到20ml的電鍍廢水(Cd2+:0.13mg/L; Cu2+:0.15mg/L)中，28°C，150r/min處理2h后過濾收集上清液，按照前述方法測(cè)定吸附前后水體中鎘的濃度。[0025](3)絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5與植物共生水培實(shí)驗(yàn):
[0026]本實(shí)施例旨在證明本發(fā)明所提供的絲狀真菌J-5在模擬重金屬污染土壤中對(duì)植物生長(zhǎng)的保護(hù)能力。小白菜的種植和培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn)(Green, 1989;于方明等，2008);絲狀真菌J-5干菌粉的處理方法如前文實(shí)施例2所述。在接種絲狀真菌J-5至水培體系前，收集絲狀真菌J-5孢子并調(diào)節(jié)孢子懸液至IO7個(gè)/mL，備用。
[0027]以小白菜(Brassica chinensis L.)為供試植物，催芽后取10顆發(fā)芽狀況一致的種子于裝有IOOg滅菌蛭石的定植杯中。出苗后每2d燒IOmL滅菌自來水，5d后換0.5倍濃度的Hoagland’ s營(yíng)養(yǎng)液(于方明等，2008)，待小白菜長(zhǎng)出2片真葉后開始澆全營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)IOd后間苗至4株，然后按照不同處理方式分別加入IOOyL J-5孢子懸液(終濃度為IO4個(gè)/g蛭石)和0.0lg的凍干J-5菌體。2d后，向培樣體系中分別加入IOmL鎘含量不同的Hoagland’ s營(yíng)養(yǎng)液，使其加入到培養(yǎng)體系中鎘的終濃度分別為0，0.1, 0.5，I和2mg/Kg蛭石。后續(xù)培養(yǎng)過程中不再加入含有鎘的營(yíng)養(yǎng)液，但每2d補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液，保證水含量基本恒定。繼續(xù)培養(yǎng)30d后收獲植株；將收獲的植株的葉片部分，65°C烘干48h至恒重后，取0.0lg于ImL濃硝酸中進(jìn)行消化處理，稀釋過濾后測(cè)定鎘含量。上述盆栽試驗(yàn)每種處理設(shè)置4次重復(fù)，整個(gè)試驗(yàn)在光照培 養(yǎng)箱中完成，光照14h，溫度28°C，相對(duì)濕度60%。
[0028]因此，本發(fā)明可總結(jié)為: 申請(qǐng)人:從鎘污染土壤中，利用真菌培養(yǎng)方法，進(jìn)行真菌篩選；得到一株能在含IOmM鎘的馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的絲狀真菌， 申請(qǐng)人:將其命名為J-5。該絲狀真菌為產(chǎn)黃青霉，該菌株的保存及產(chǎn)孢子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。
[0029] 申請(qǐng)人:利用絲狀真菌J-5進(jìn)行靜態(tài)鎘吸附和電鍍廢水中重金屬移除實(shí)驗(yàn)，顯示該菌株能夠快速高效吸附重金屬鎘。隨后進(jìn)行的J-5與植物的共生水培實(shí)驗(yàn)顯示該菌株能夠降低植物對(duì)鎘的吸收，增加小白菜的產(chǎn)量。
[0030]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0031](I)菌體原料易獲取，成本低廉。
[0032](2)利用絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5的凍干菌體作為生物吸附劑不僅可以高效吸附移除污水中的重金屬離子，同時(shí)還具備良好的吸附劑再生能力，擁有商業(yè)化應(yīng)用的潛能。
[0033](3)絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5對(duì)多種重金屬具有高耐受性和高吸附特性，對(duì)環(huán)境中的重金屬具有較高的固定能力，能明顯降低其生物毒害性。該菌株可以在高濃度重金屬水平下存活，因此以產(chǎn)黃青霉J-5作為土壤重金屬鈍化劑可實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤中重金屬長(zhǎng)期固定化的同時(shí)，避免向環(huán)境中多次施加重金屬的鈍化劑，具備原位修復(fù)大面積污染土壤的潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為一種絲狀真菌J-5在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果。
[0035]圖2為一種絲狀真菌J-5的靜態(tài)鎘吸附量測(cè)定結(jié)果。
[0036]圖3為一種絲狀真菌J-5對(duì)實(shí)際電鍍污水處理結(jié)果。
[0037]圖4為一種絲狀真菌J-5以不同方式與植物共生水培對(duì)植物產(chǎn)量的影響。
[0038]圖中:CK指示實(shí)驗(yàn)條件為不添加任何形式的J-5 ;DJ指示添加死亡凍干J-5 ;LJ指示添加
[0039]J-5 孢子。
[0040]圖5為一種絲狀真菌J-5以不同方式與植物共生水培對(duì)植物葉片鎘含量的影響。[0041]圖中:CK指示實(shí)驗(yàn)條件為不添加任何形式的J-5 ;DJ指示添加死亡凍干J-5 ;LJ指示添加
[0042]J-5 孢子。
【具體實(shí)施方式】
[0043]以下敘述是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)施例。應(yīng)該說明的是，本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。本發(fā)明中所涉及的其他各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，文中沒有特別說明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說明書、手冊(cè)等加以實(shí)施。
[0044]實(shí)施例1:絲狀真菌J-5的分離及重金屬耐受能力測(cè)試
[0045]1、菌株分離:
[0046]稱取IOg鎘污染土壤于90mL的滅菌生理鹽水中，于28°C恒溫?fù)u床上150r/min振蕩15min，靜置Imin后，取上清液進(jìn)行10倍系列稀釋；然后將100 μ L不同稀釋倍數(shù)的稀釋液涂布在含有IOmM鎘的馬丁孟加拉紅平板上，倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。將平板上生長(zhǎng)的微生物進(jìn)行劃線分離純化，然后重新涂布到上述含鎘的馬丁孟加拉紅平板上進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)10次分離篩選后，保存對(duì)鎘具有穩(wěn)定抗性能力的菌株，在PDA斜面上進(jìn)行保存，備用。
[0047] 申請(qǐng)人:將上述分離得到的菌株中的一株菌命名為絲狀真菌J-5，產(chǎn)黃青霉菌(Penicilliumchrysogenum), 申請(qǐng)人:于2012年4月24日將該菌株送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M2012137。
[0048]2、菌株的生物學(xué):
[0049]①生物學(xué)特性:絲狀真菌，帚狀分支結(jié)構(gòu)明顯，專性需氧，最適生長(zhǎng)溫度200C-28°C ;在PDA培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量大，孢子形成初期為淡綠色，后期為墨綠色，培養(yǎng)中后期有明顯黃色色素產(chǎn)生。
[0050]②遺傳學(xué)特性:結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物鑒定確認(rèn)該菌為產(chǎn)黃青霉。
[0051]③培養(yǎng)條件:保存該真菌及獲取其孢子時(shí)所使用的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；用于吸附實(shí)驗(yàn)及測(cè)試其對(duì)重金屬耐受性用礦物鹽培養(yǎng)基(麗):(NH4) 2S045g/L; KH2PO415g/L; MgSO40.6g/L; CaCl20.6g/L; FeSO4.7Η20 5mg/L; CoCl22mg/L;葡萄糖 20g/L，pH 5.0.121。。高壓蒸汽滅菌30min。培養(yǎng)該菌可以孢子的形式進(jìn)行接種:以2%體積比的吐溫-80沖洗PDA斜面上的孢子，然后用0.2%體積比的吐溫-80稀釋至需要的孢子濃度后接種，并進(jìn)行28°C，150r/min搖瓶培養(yǎng)。圖1為J-5在礦物鹽(MM)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，培養(yǎng)5d后進(jìn)入平臺(tái)期。
[0052]3、J-5的重金屬耐受性測(cè)試:
[0053]按1%接種量接種絲狀真菌J-5孢子懸液到含特定重金屬濃度的礦物鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，7d后觀察其生長(zhǎng)狀況。絲狀真菌J-5對(duì)不同重金屬離子的耐受性檢測(cè)結(jié)果為:液體培養(yǎng)條件下對(duì)鎘(Cd2+) 320mM、銅(Cu2+) 80mM、鈷(Co2+) 30mM、鉻(Cr6+) 5mM、鉻(Cr3+) 35mM、鋅(Zn2+) 70mM等重金屬有較好的耐受性。
[0054]實(shí)施例2:絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5鎘吸附能力實(shí)驗(yàn)
[0055]2.1靜態(tài)鎘吸附:[0056]將菌株絲狀真菌J-5在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d后，收集孢子，制備孢子懸液；然后按照1:100的比例接種到200mL的新鮮礦物鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d，過濾收集菌體并進(jìn)行真空冷凍干燥；然后，將干菌粉過300 μ m孔徑的篩子后，用于吸附鎘的分析。
[0057]將0.0lg的經(jīng)過上述預(yù)處理的菌粉，加入到含有20mL鎘溶液的50mL離心管中，然后將離心管置于28°C恒溫?fù)u床中，150r/min維持240min。吸附過程中分別在0，15，30，45，60，120,180和240min取100 μ L上清液，稀釋后進(jìn)行鎘含量分析。吸附實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。鎘含量的分析采用石墨爐原子吸收分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定(孫西寧等，2007)。如圖2所示，隨著吸附時(shí)間的增加，菌體對(duì)鎘的單位吸附量逐漸增大。在最初的45min內(nèi)吸附量達(dá)至最大吸附量的75%以上，隨后逐漸進(jìn)入吸附平衡。其中，絲狀真菌J-5干粉在500mg/L鎘溶液中對(duì)鎘的吸附量達(dá)到87.31 ±2.04mg/g (干重)。
[0058]2.2電鍍廢水中重金屬移除實(shí)驗(yàn):
[0059]隨后發(fā)明人測(cè)試了絲狀真菌J-5對(duì)實(shí)際電鍍廢水中重金屬移除能力。采用實(shí)施例2.1相同的處理方法，制備干菌粉。將0.0lg的干菌粉加入到20ml的電鍍廢水(Cd2+: 0.13mg/L;Cu2+:0.15mg/L)中，28°C，150r/min 處理 2h 后過濾收集上清液，按照前述方法測(cè)定吸附前后水體中鎘的濃度。從圖3可以看出，絲狀真菌J-5對(duì)鎘的移除能力為85.8±2.06%，對(duì)銅的移除能力為61.7±1.51%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明中的絲狀真菌J-5能高效的吸附移除實(shí)際電鍍廢水中的重金屬鎘，同時(shí)對(duì)銅也有較高的移除能力。
[0060]實(shí)施例3:絲狀真菌J-5與植物共生水培實(shí)驗(yàn)
[0061]本實(shí)施例旨在 證明本發(fā)明所提供的絲狀真菌J-5在模擬重金屬污染土壤中對(duì)植物生長(zhǎng)的保護(hù)能力。小白菜的種植和培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn)(Green, 1989;于方明等，2008);絲狀真菌J-5干菌粉的處理方法如前文實(shí)施例2所述。在接種絲狀真菌J-5至水培體系前，收集絲狀真菌J-5孢子并調(diào)節(jié)孢子懸液至IO7個(gè)/mL，備用。
[0062]以小白菜(Brassica chinensis L.)為供試植物，催芽后取10顆發(fā)芽狀況一致的種子于裝有IOOg滅菌蛭石的定植杯中。出苗后每2d燒IOmL滅菌自來水，5d后換0.5倍濃度的Hoagland’ s營(yíng)養(yǎng)液(于方明等，2008)，待小白菜長(zhǎng)出2片真葉后開始澆全營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)IOd后間苗至4株，然后按照不同處理方式分別加入IOOyL J-5孢子懸液(終濃度為IO4個(gè)/g蛭石)和0.0lg的凍干J-5菌體。2d后，向培樣體系中分別加入IOmL鎘含量不同的Hoagland’ s營(yíng)養(yǎng)液，使其加入到培養(yǎng)體系中鎘的終濃度分別為0，0.1, 0.5，I和2mg/Kg蛭石。后續(xù)培養(yǎng)過程中不再加入含有鎘的營(yíng)養(yǎng)液，但每2d補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液，保證水含量基本恒定。繼續(xù)培養(yǎng)30d后收獲植株；將收獲的植株的葉片部分，65°C烘干48h至恒重后，取0.0lg于ImL濃硝酸中進(jìn)行消化處理，稀釋過濾后測(cè)定鎘含量。上述盆栽試驗(yàn)每種處理設(shè)置4次重復(fù)，整個(gè)試驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱中完成，光照14h，溫度28°C，相對(duì)濕度60%。
[0063]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入鎘的植株都表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩和植株矮小的現(xiàn)象。由圖4可知，在鎘濃度為lmg/Kg蛭石和2mg/Kg蛭石時(shí)，與CK處理相比，經(jīng)J-5凍干菌體和J-5孢子處理的小白菜產(chǎn)量顯著提高(P〈0.05)。由圖5可以看出，在不同鎘污染程度下，接種J-5孢子使小白菜對(duì)鎘的吸收降低了 1.2%-63.6%。這表明活性絲狀真菌J-5有效降低了鎘的生物有效性及其對(duì)植物的毒性，進(jìn)而使小白菜產(chǎn)量提高。
[0064]上述實(shí)施案例的結(jié)果說明本發(fā)明中分離獲取的絲狀真菌J-5對(duì)鎘有較高的吸附能力，達(dá)到了降低鎘的生物有效性的目的。
【權(quán)利要求】
1.一種絲狀真菌產(chǎn)黃青霉,其特征在于:產(chǎn)黃青霉菌chrysogenum)J-5, CCTCC, CCTCC NO:M2012137。
2.權(quán)利要求1所涉的一種絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5在重金屬污染水體的生物修復(fù)中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所涉的一種絲狀真菌產(chǎn)黃青霉J-5在重金屬污染土壤的生物修復(fù)中的應(yīng)用 。
【文檔編號(hào)】B01J20/28GK103451105SQ201210181161
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月4日
【發(fā)明者】黃巧云, 陳雯莉, 徐興健, 夏璐, 朱偉, 張哲軼 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)