用于從疫苗離析和量化抗原的方法
【專利摘要】本公開(kāi)涉及在缺乏可用抗原標(biāo)準(zhǔn)品的情況下開(kāi)發(fā)用于量化疫苗組合物中的抗原的改進(jìn)方法。更具體地說(shuō)，本公開(kāi)提供了從疫苗組合物分離抗原的快速和穩(wěn)健方法，包括在沒(méi)有去污劑和沒(méi)有烷基化的情況下溶解抗原、使用酸化防止抗原亞型再次結(jié)合、用色譜法離析抗原亞型和用氨基酸分析量化所洗脫的抗原的步驟。本公開(kāi)的方法適于用于各種抗原，由此在迄今為止疫苗制造的領(lǐng)域中提供改進(jìn)方法。
【專利說(shuō)明】用于從疫苗離析和量化抗原的方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)要求2011年4月21日提交的序列號(hào)61/477，835的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式整體并入本文。
[0003]領(lǐng)域
[0004]本公開(kāi)通常涉及疫苗領(lǐng)域及用于在沒(méi)有已知標(biāo)準(zhǔn)品的情況下離析和測(cè)量疫苗中的抗原含量的方法。
[0005]背景
[0006]流感病毒基于其核蛋白抗原和基質(zhì)蛋白抗原之間的抗原性差異通常分為三類:A、B和C。取決于兩種主要病毒表面糖蛋白:血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性質(zhì)，流感病毒進(jìn)一步分為亞型。HA和NA均攜帶抗原表位。產(chǎn)生針對(duì)HA和NA的抗體與抵抗人類和動(dòng)物中的感染和/或疾病相關(guān)聯(lián)。針對(duì)流感接種疫苗的功效很大程度上由疫苗中的免疫原性HA的量來(lái)決定。因此，A型和B型流感病毒的主要的抗原決定簇是HA而對(duì)流感接種疫苗的功效很大程度上由疫苗中的免疫原性HA的量即抗原含量來(lái)決定。
[0007]迄今為止，抗原含量用世界衛(wèi)生組織合作中心(以下稱為“WHO”)提供的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)測(cè)量，其用于測(cè)定抗原值例如疫苗的HA含量。然而，通常，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品不可用時(shí)，例如當(dāng)病毒抗原的不同季節(jié)菌株存在抗原性差異(即較低同源性)或當(dāng)存在病毒的大流行爆發(fā)而對(duì)于其尚無(wú)可用標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，疫苗由疫苗制造商制備。
[0008]這種大流行病爆發(fā)發(fā)生在2009年4月，當(dāng)墨西哥、美國(guó)和幾個(gè)其它國(guó)家中A型流感/加利福尼亞/07/2009 HlNl大流行病爆發(fā)時(shí)，組合來(lái)自人類、豬和禽流感的基因的新型流感菌株進(jìn)化，最初稱為“豬流感”。在此特定的情況下，在WHO具有用于Hl抗原的可用標(biāo)準(zhǔn)品之前，需要疫苗。在2009年9月，美國(guó)食品和藥品管理局批準(zhǔn)了針對(duì)2009年HlNl流感病毒的四種疫苗。然而在開(kāi)發(fā)這些疫苗的時(shí)候，仍然沒(méi)有可用的WHO標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)量化新疫苗中的HA。
[0009]數(shù)十年來(lái)，已經(jīng)使用具有由世界衛(wèi)生組織(WHO)合作中心提供的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的單向輻射免疫擴(kuò)散(SRID或SRD)對(duì)流感疫苗的HA含量進(jìn)行了測(cè)定。這些國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)用于測(cè)定抗原值例如疫苗的HA含量。在SRID中，流感病毒顆粒被去污劑破壞，并且被呈遞使其在載有抗體的瓊脂糖凝膠中在室溫下免疫擴(kuò)散三天。在凝膠染色時(shí)，測(cè)量抗原-抗體復(fù)合物的沉淀區(qū)域的直徑，并且通過(guò)使用用具有已知HA含量的這種亞型的整個(gè)病毒參考批次獲得的校準(zhǔn)曲線，計(jì)算某亞型的病毒制劑的抗原含量。然而，SRID是費(fèi)力且低通量的測(cè)定法。此外，特別對(duì)于未經(jīng)純化的(過(guò)程中的)流感病毒，靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度相對(duì)較低。
[0010]Kapteyn等(Vaccine 24:3137-44, 2006 ;“Kapteyn”)公開(kāi)了用于量化流感病毒培養(yǎng)中的HA以及用于鑒定來(lái)自三價(jià)疫苗中的單個(gè)流感菌株的HA的RP-HPLC測(cè)定法。然而，Kapteyn的方法不在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下量化HA。另外，Kapteyn使用去污劑溶解抗原和烷基化以防止具有活性巰基基團(tuán)的蛋白質(zhì)重新結(jié)合并形成復(fù)合物。實(shí)際上，在Kapteyn的方法中，HA通過(guò)使用強(qiáng)去污劑溶解膜而被完全離析。Kapteyn的方法也沒(méi)有被描述適于量化來(lái)自福爾馬林滅活的流感菌株的HA。[0011]因此，迄今為止本領(lǐng)域沒(méi)有公開(kāi)用于準(zhǔn)確地和有效地測(cè)定粗制或純化HA樣品中的HA抗原濃度的方法，特別是在不用去污劑或烷基化試劑處理的樣品中以及在缺少由WHO合作中心提供的HA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品下。顯然，在可從WHO合作中心得到抗原標(biāo)準(zhǔn)品之前，在本領(lǐng)域中非常需要用于在疫苗制造中可靠離析和量化包括病毒抗原諸如HA抗原的抗原的穩(wěn)健、準(zhǔn)確和快速的方法。下面的公開(kāi)描述了此類方法的詳情。
[0012]概述
[0013]開(kāi)發(fā)本文描述的方法以在缺乏可用抗原標(biāo)準(zhǔn)品的情況下提供測(cè)量疫苗中的抗原含量的裝置。因此，本發(fā)明解決本領(lǐng)域中涉及在不需要國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的情況下、在疫苗開(kāi)發(fā)和制造過(guò)程期間快速和準(zhǔn)確量化疫苗中的抗原濃度的一個(gè)或多個(gè)需要。因此，本文提供的方法允許疫苗制造商在不等待WHO開(kāi)發(fā)和提供標(biāo)準(zhǔn)品的情況下更快地生產(chǎn)疫苗，該疫苗可以被傳遞給公眾。
[0014]更具體地說(shuō)，本發(fā)明在不使用標(biāo)準(zhǔn)品的情況下提供離析和準(zhǔn)確量化疫苗抗原的快速和穩(wěn)健方法，其是準(zhǔn)確且可重復(fù)的。本公開(kāi)適于用于各種抗原，由此在迄今為止疫苗制造的領(lǐng)域中提供改進(jìn)方法。
[0015]本發(fā)明提供了用于從疫苗組合物離析抗原的方法，該方法包括以下步驟:(a)在沒(méi)有去污劑和沒(méi)有烷基化試劑的情況下溶解疫苗組合物中的抗原；和(b)通過(guò)分級(jí)分離離析抗原或抗原亞型。
[0016]在一些方面中，溶解步驟通過(guò)還原進(jìn)行。在一些方面中，還原包括用二硫蘇糖醇處理疫苗組合物。在一些方面中，還原包括約5分鐘至約20小時(shí)的孵育時(shí)間。在其它方面中，還原包括約30分鐘至約2小時(shí)的孵育時(shí)間。在更具體的方面中，還原包括約I小時(shí)的孵育時(shí)間。在另外的方面中，還原包括約20°C至約100°C的孵育溫度。在各種方面中，還原包括約50°C至約90°C的孵育溫度。在某些方面中，還原包括約85°C的孵育溫度。在進(jìn)一步的方面中，還原步驟是受pH控制的。在各種方面中，還原在約pH 6至約pH 11的pH下進(jìn)行。在特定方面中，還原在約PH 7至約`pH 10的pH下進(jìn)行。在附加方面中，溶解步驟還包括用離液劑變性。在各種方面中，離液劑是鹽酸胍、脲、硫脲、鋰、高氯酸鹽或硫氰酸鹽。在另外的方面中，還原還通過(guò)酸化抗原或抗原亞型來(lái)進(jìn)行，以防止在分離的抗原亞型之間形成二硫鍵。在各種方面中，用磷酸、鹽酸、硫酸、三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸或甲酸進(jìn)行酸化。
[0017]在一些方面中，分級(jí)分離通過(guò)色譜法進(jìn)行。在各種方面中，色譜法是高效液相色譜法(HPLC)、反相HPLC (RP-HPLC)、離子交換HPLC (IEX-HPLC)、親和色譜法、疏水相互作用色譜法(HIC)或尺寸排阻色譜法(SEC)。在示例性方面中，色譜法是反相(RP)-HPLC。
[0018]本發(fā)明還提供用于量化疫苗組合物中的抗原或抗原亞型含量的方法。此類方法包括上文所述的的用于從疫苗組合物離析抗原的所有方法(具有量化抗原或抗原亞型的另一步驟)。在示例性方面中，量化步驟在不使用抗原標(biāo)準(zhǔn)品的情況下進(jìn)行。在各種方面中，量化步驟包括通過(guò)氨基酸分析量化抗原。在一些方面中，抗原是病毒的或細(xì)菌的。在某些方面中，抗原是血凝素(HA)。在特定方面中，HA來(lái)自流感病毒疫苗組合物、麻疹病毒疫苗組合物、副流感病毒疫苗組合物或腮腺炎病毒疫苗組合物。在一些方面中，疫苗組合物是流感病毒疫苗組合物。在另外的方面中，流感病毒疫苗組合物提供對(duì)選自由A型流感和B型流感組成的組的流感病毒的防護(hù)作用。在各種方面中，抗原亞型是A型流感HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15 和 HA16 與 B 型流感 HA 的任一種。在某些方面中，抗原亞型是4型流感撤亞型撤1、撤2、撤3、撤5、撤7、撤9、撤10或B型流感HA。在示例性方面中，A型流感HA亞型是HAl。在另外的方面中，流感疫苗組合物提供對(duì)選自由 A 型流感 HlNl、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7和B型流感組成的組的流感類型的防護(hù)作用。在各種方面中，該方法量化抗原含量，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于約2.5%。在更具體的方面中，RSD為約2.2%。在進(jìn)一步更具體的方面中，RSD為約1.3%ο
[0019]上述概述并非意圖定義本公開(kāi)的每個(gè)方面，并且附加方面在其它部分例如下列詳述中有所描述。整個(gè)文件旨在作為統(tǒng)一的公開(kāi)相關(guān)聯(lián)，并且應(yīng)當(dāng)理解，涵蓋本文所述特征的所有組合，即使這些特征的組合并不一起存在于本文件的同一句子、或段落或章節(jié)中。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)根據(jù)下列詳述將變得明顯。然而，應(yīng)該理解，雖然指示本公開(kāi)的具體實(shí)施方案，但是該詳述和具體實(shí)施例僅通過(guò)說(shuō)明的方式給出，因?yàn)閺拇嗽斒鲋?，本公開(kāi)的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將變得明顯。
[0020]詳述
[0021]本公開(kāi)提供了用于在缺少國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品例如世界衛(wèi)生組織(WHO)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品下在疫苗開(kāi)發(fā)和制造中離析和制備抗原以及測(cè)定抗原濃度的新方法，WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品是具有確定生物活性的生物參考制劑。該方法包括在現(xiàn)有技術(shù)上的改進(jìn)，即通過(guò)在不使用去污劑和不使用烷基化的情況下溶解來(lái)自疫苗組合物中的病毒的抗原。溶解的抗原然后通過(guò)分級(jí)分離來(lái)分離和通過(guò)定量氨基酸分析來(lái)量化。
[0022]WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的適時(shí)可用性充當(dāng)世界范圍內(nèi)疫苗制造中生物學(xué)測(cè)量的比較的基礎(chǔ)。然而，當(dāng)新病毒爆發(fā)且標(biāo)準(zhǔn)品需要制備時(shí)，這些WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品不是現(xiàn)成的。迄今為止，問(wèn)題是，響應(yīng)于新病毒的爆發(fā)，疫苗制造商被迫迅速開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)新疫苗，同時(shí)等待WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的遞送以量化其新疫苗中的抗原。通過(guò)提供用于量化抗原而不需要WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的新方法，本公開(kāi)的方法提供了這個(gè)問(wèn)題的解決方案。
`[0023]迄今為止，用于分離和回收源于病原體的抗原的方法的另一問(wèn)題是，使抗原與其它蛋白分離不是最優(yōu)的。在本領(lǐng)域中，所關(guān)注的抗原蛋白峰的分辨率較差，回收率低且不是定量的，以及樣品制備時(shí)間較長(zhǎng)。本公開(kāi)通過(guò)使用色譜法離析樣品中的抗原來(lái)解決許多這些問(wèn)題，該樣品在不使用去污劑以及(在示例性方面中)在沒(méi)有烷基化的情況下被變性和還原以保護(hù)抗原上的巰基基團(tuán)。因此，樣品制備時(shí)間大大減少以及副反應(yīng)較少。使用色譜法離析抗原后，抗原濃度在不使用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的情況下被量化。在更特定的方面，進(jìn)行定量氨基酸分析作為抗原量化的替代方法。
[0024]來(lái)自現(xiàn)有技術(shù)的待解決的問(wèn)題是提供準(zhǔn)確、快速和穩(wěn)健的方法，該方法可應(yīng)用于抗原的高通量分離、純化和量化。在更特定的方面，待解決的問(wèn)題是在不使用去污劑、無(wú)需烷基化以及無(wú)需抗原標(biāo)準(zhǔn)品的情況下提供此類方法。本文描述的方法顯示，血凝素(HA)抗原、特別是主決定簇HAl與存在于制劑中的其它蛋白質(zhì)分離得非常好并且具有高純度，并通過(guò)將它與其它(已知)值、內(nèi)標(biāo)比較或通過(guò)定量氨基酸分析，允許本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)測(cè)定存在于制劑中的抗原的量。
[0025]更具體地說(shuō)，本公開(kāi)涉及用于分離HA抗原的新方法，該方法包括在沒(méi)有去污劑的情況下應(yīng)用可溶性抗原制劑并且(在一方面中)在色譜柱上分級(jí)分離該抗原的步驟。在某些方面中，本公開(kāi)還包括從該柱上洗脫HA抗原，而在甚至進(jìn)一步的方面中，通過(guò)AAA量化抗原。
[0026]在詳細(xì)解釋本公開(kāi)的任何實(shí)施方案之前，然而，應(yīng)當(dāng)理解，本公開(kāi)在其申請(qǐng)中不限于下面描述中陳述的或附圖和實(shí)施例所示的部件的結(jié)構(gòu)和布置的細(xì)節(jié)。本文使用的部分標(biāo)題僅用于編制目的，并且不被解釋為限制所描述的主題。此申請(qǐng)中所列的全部參考文獻(xiàn)以引用的方式明確地并入本文。
[0027]本公開(kāi)包含其它實(shí)施方案并且以各種方式實(shí)踐或執(zhí)行。此外，應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的用語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)是為了描述的目的且不應(yīng)被視為限制性的。術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或“具有”及其變化意指涵蓋其后列出的項(xiàng)目和其等同物以及附加項(xiàng)目。
[0028]定義[0029]除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本公開(kāi)所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。
[0030]下列縮寫詞貫穿使用。
[0031]AA 氨基酸
[0032]AAA 氨基酸分析
[0033]DNA 脫氧核糖核酸
[0034]EDTA 乙二胺四乙酸
[0035]HA血凝素
[0036]HA1-16 血凝素亞型 1-16
[0037]HPLC 高效液相色譜法
[0038]HIC 疏水相互作用色譜法
[0039]IEX-HPLC 離子交換 HPLC
[0040]kDa千道爾頓
[0041]LC-MS/MS 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法
[0042]MALDI/T0F 基質(zhì)輔助激光解析電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜法
[0043]MVB單價(jià)原液
[0044]RSD相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差
[0045]RP-HPLC 反相 HPLC
[0046]SDS十二烷基硫酸納
[0047]SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0048]SEC尺寸排阻色譜法
[0049]SRD單向輻射免疫擴(kuò)散
[0050]UV紫外線
[0051]這里注意，如本說(shuō)明書和所附的權(quán)利要求書所用的，除非上下文另外清楚地指出，否則單數(shù)形式“一種/ 一個(gè)(a)”、“一種/ 一個(gè)(an)”和“該(the) ”包括復(fù)數(shù)指示物。
[0052]如本文所用的，除非另外說(shuō)明，否則下列術(shù)語(yǔ)具有歸于它們的含義。
[0053]術(shù)語(yǔ)“多肽”和“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換地使用，是指通過(guò)肽鍵鏈接的氨基酸殘基的聚合物。“蛋白質(zhì)”一般指大的多肽?！半摹币话阒付痰亩嚯?。
[0054]還需要明確理解，本文所引用的任何數(shù)值包括較低值至較高值的所有值，即，所列舉的最低值和最高值之間的數(shù)值的所有可能組合被認(rèn)為在本申請(qǐng)中明確規(guī)定。例如，若濃度范圍規(guī)定為約1%至50%，則數(shù)值諸如2%至40%、10%至30%或1%至3%等意圖明確列舉在此說(shuō)明書中。上面所列的值僅僅是特別預(yù)期的實(shí)例。
[0055]在各種方面中，范圍在本文表示為“約(about)”或“大約(approximately)”一個(gè)特定值和/或至“約”或“大約”另一特定值。術(shù)語(yǔ)“幾乎”也可以與術(shù)語(yǔ)“大約”互換使用。當(dāng)數(shù)值通過(guò)利用先前的“約”表示為近似值時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，某些變化量包括在該范圍內(nèi)并且包括公開(kāi)或引用值的值+/_10%、+/-5%和+/-1.0%。
[0056]“流感”是指正粘液病毒科(Orthmyxoviridae)家族中流感病毒A、B和C三種類型的任一類型。只有A型和B型流感導(dǎo)致季節(jié)性暴發(fā)。經(jīng)由通過(guò)血凝素(HA)結(jié)合到通常在哺乳動(dòng)物的鼻、咽喉和肺中以及鳥(niǎo)類的小腸中的上皮細(xì)胞的表面上的唾液酸糖，流感病毒感染其宿主。
[0057]A型流感類具有一個(gè)物種，A型流感病毒?；贖A蛋白(H1-16)和神經(jīng)氨酸酶蛋白(N1-9)的血清學(xué)特性，A型流感被分為亞型或血清型。根據(jù)血凝素和神經(jīng)氨酸酶的組合命名流感亞型,例如HxNy。已在人類中證實(shí)的、通過(guò)已知的人類大流行病死亡的數(shù)量排序的亞型包括但不限于 H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3 和 H10N7。B 型流感類具有一個(gè)物種，B型流感病毒。B型流感比A型變異速率慢2-3倍并因此遺傳差異小，只有一種B型流感血清型。C型流感類具有一個(gè)物種，C型流感病毒，其感染人類、犬和豬，有時(shí)導(dǎo)致嚴(yán)重疾病和區(qū)域流行病。然而，C型流感比其它類型少見(jiàn)。
[0058]術(shù)語(yǔ)“抗原”或“抗原亞型”是指能夠被選擇性結(jié)合試劑諸如抗體結(jié)合并另外能夠用于在對(duì)象中產(chǎn)生能夠結(jié)合每個(gè)抗原的表位的抗體的分子或分子的一部分。在各種方面中，抗原具有一個(gè)或多個(gè)表位。在示例性方面中，HA是抗原。HA是負(fù)責(zé)將病毒結(jié)合到被感染的細(xì)胞的抗原糖蛋白。迄今為止鑒定出至少有17種不同的HA抗原，標(biāo)記為HA1-HA16或者可選地A型流感的H1-H16，以及B型流感的至少一種已知HA抗原。H1、H2和H3通常發(fā)現(xiàn)于人類A型流感中，和B型流感HA抗原通常發(fā)現(xiàn)于人類B型流感中。本公開(kāi)包括分離和量化所有已知和未知的HA病毒蛋 白質(zhì)的方法，所述HA病毒蛋白質(zhì)包括但不限于HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15、HA16 和 B 型流感 HA的任一種。
[0059]術(shù)語(yǔ)“抗原含量”或“抗原濃度”是指抗原的量，即疫苗樣品中抗原的濃度。
[0060]術(shù)語(yǔ)“疫苗”或“疫苗組合物”是指改善對(duì)特定疾病(例如，流感)的免疫力的生物制劑。術(shù)語(yǔ)“疫苗”或“疫苗組合物”在本文可互換使用來(lái)描述所有疫苗配方，包括疫苗研發(fā)和制造中涉及的入流_、上游-和下游-過(guò)程的制劑。
[0061 ] 術(shù)語(yǔ)“標(biāo)準(zhǔn)品”或“國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品”或“國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)品”或“抗原標(biāo)準(zhǔn)品”指的是由管理機(jī)構(gòu)例如由世界衛(wèi)生組織(WHO)或WHO合作中心提供的、具有確定生物活性的生物參考制劑。
[0062]“相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差”、“RSD”或“％RSD”是變異系數(shù)的絕對(duì)值。它通常表示為百分?jǐn)?shù)。有時(shí)所用的類似術(shù)語(yǔ)是相對(duì)方差，其是變異系數(shù)的平方。而且，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)誤差除以估值然后乘以100獲得、被表示為百分?jǐn)?shù)的統(tǒng)計(jì)估值的可靠性的量度。RSD廣泛用于分析化學(xué)以表達(dá)測(cè)定法的精確度和可重復(fù)性。RSD=(數(shù)組X的標(biāo)準(zhǔn)偏差)X 100/(數(shù)組X的平均值)。
[0063]本文使用的部分標(biāo)題僅用于編制目的，并且不被解釋為以任何方式限制所描述的主題。
[0064]從疫苗離析抗原
[0065]本公開(kāi)包括用于從疫苗組合物離析抗原(包括但不限于HA抗原)的方法。在示例性實(shí)施方案中，流感病毒疫苗從卵源材料或來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)的病毒材料的上游、入流或下游過(guò)程獲得。來(lái)自疫苗組合物的抗原然后在沒(méi)有去污劑的情況下溶解。
[0066]抗原溶解，也稱為病毒裂解，包括使用化學(xué)或物理方法破壞病毒來(lái)離析一種或多種抗原用于進(jìn)一步離析和量化。在示例性方面中，溶解步驟在不使用去污劑的情況下通過(guò)還原來(lái)進(jìn)行。在本文描述的方法中不使用去污劑，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合蛋白質(zhì)并改變其性質(zhì)，即去污劑污染離析的抗原并干擾抗原濃度的精確測(cè)定所需的色譜分離。
[0067]因此，抗原溶解通過(guò)不是去污劑且可還原蛋白質(zhì)二硫鍵的任何還原劑進(jìn)行。合適的還原試劑包括但不限于二硫蘇糖醇(DTT)、三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)、Protein-S-S-Reductant?(G Biosciences'、，Maryland Heights, MO)、β-疏基乙醇、β-疏
基乙胺、硫代丙基-瓊脂糖、硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、硫代磷酸鈉、亞硫酸鹽和亞硫酸鹽生成劑、二硫赤蘚糖醇、三丁基膦、谷胱甘肽、巰基乙酸鹽、2，3- 二巰基丙醇或過(guò)甲酸。在各種方面中，鹽酸胍或另一離液劑諸如但不限于脲、硫脲、鋰、高氯酸鹽和硫氰酸鹽也用于溶解反應(yīng)緩沖液中。離液劑使蛋白質(zhì)變性但不能沉淀蛋白質(zhì)。用于進(jìn)行蛋白質(zhì)還原的化合物和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本文實(shí)施例中更詳細(xì)描述了具體還原溶液和條件。
[0068]在示例性方面中，還原緩沖液或還原劑將HA分子之間的二硫鍵還原成相應(yīng)的亞單位例如HAl和ΗΑ2并從病毒釋放例如HAl。在某些方面中，以約lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、llmM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM的濃度使用DTT。在更特定的方面中，以例如范圍從約20mM至約IOOmM的濃度使用 DTT。`
[0069]在示例性方面中，還原包括約5分鐘至約20小時(shí)、約10分鐘至約10小時(shí)或約30分鐘至約2小時(shí)的孵育時(shí)間。在某些方面中，孵育時(shí)間為約I小時(shí)。因此，孵育時(shí)間為5分鐘、約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約I小時(shí)、約1.5小時(shí)、約2小時(shí)、約2.5小時(shí)、約3小時(shí)、約3.5小時(shí)、約4小時(shí)、約4.5小時(shí)、約5小時(shí)、約5.5小時(shí)、約6小時(shí)、約6.5小時(shí)、約7小時(shí)、約7.5小時(shí)、約8小時(shí)、約8.5小時(shí)、約9小時(shí)、約9.5小時(shí)、約10小時(shí)、約11小時(shí)、約12小時(shí)、約13小時(shí)、約14小時(shí)、約15小時(shí)、約16小時(shí)、約17小時(shí)、約18小時(shí)、約19小時(shí)或約20小時(shí)。本文實(shí)施例中更詳細(xì)描述了具體還原時(shí)間。
[0070]在其它方面中，還原包括約20°C至約100°C的孵育溫度。在特定方面中，還原包括約50°C至約90°C的孵育溫度。在更特定的方面中，還原包括約85°C的孵育溫度。因此，孵育溫度為約 20°C、約 25°C、約 30°C、約 35°C、40°C、約 45°C、約 50°C、約 55°C、約 60°C、約650C，約70 V，約75°C、約80 V、約85°C、約90 V、約95°C或約100°C。本文實(shí)施例中更詳細(xì)描述了具體還原溫度。
[0071]在另一方面中，還原抗原是受pH控制的。在各種方面中，還原反應(yīng)在約pH 6至約pH 11的pH下進(jìn)行。在特定方面中，pH為約pH 7至約pH 10。在更特定的方面中，pH為約
7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9-,9.0-,9.1-,9.2-,9.3-,9.4-,9.5-,9.6-,9.7-,9.8-,9.9 和 10.0。
[0072]在示例性方面中，在沒(méi)有烷基化的情況下進(jìn)行還原。烷基化保護(hù)還原后蛋白質(zhì)的巰基基團(tuán)并防止游離半胱氨酸的逆反應(yīng)。因此，烷基化通常用于防止分離的HA抗原例如HAl和HA2與其它蛋白質(zhì)的重新結(jié)合和/或復(fù)合物形成。然而，使用烷基化試劑如4-乙烯基吡啶降低蛋白純度，如本文實(shí)施例中更詳細(xì)描述的。因此，為了防止分離的抗原例如HAl和HA2與其它蛋白質(zhì)的重新結(jié)合和/或復(fù)合物形成，在不使用烷基化試劑的情況下保護(hù)所有蛋白質(zhì)的疏基基團(tuán)。
[0073]在示例性方面中，為了在進(jìn)一步不使用烷基化試劑的情況下防止分離的抗原與其它蛋白質(zhì)的重新結(jié)合和/或復(fù)合物形成，通過(guò)酸化的質(zhì)子化來(lái)保護(hù)還原的蛋白質(zhì)巰基基團(tuán)。酸化防止二硫鍵形成，因?yàn)閷?duì)于二硫鍵形成，巰基基團(tuán)需要至少部分地呈離子形式。酸化是簡(jiǎn)單而有效的處理方法，其中監(jiān)測(cè)并調(diào)節(jié)PH以防止抗原沉淀。在各種方面中，用磷酸、鹽酸、硫酸、三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸或甲酸進(jìn)行酸化。在示例性方面中，用磷酸進(jìn)行酸化；然而，使用磷酸酸化不是限制性的，因?yàn)槭褂帽绢I(lǐng)域中所有其它的酸化方法。酸化的方法是本領(lǐng)域熟知的并且在本文中不作進(jìn)一步的闡述。本文實(shí)施例中更詳細(xì)描述了具體酸化溶液和條件。
[0074]抗原分級(jí)分離
[0075]在還原和酸化后，抗原通過(guò)分級(jí)分離離析。在示例性方面中，分級(jí)分離通過(guò)色譜法進(jìn)行。使用本領(lǐng)域已知的任何合適類型的色譜法。例如，此類合適類型的色譜法包括但不限于高效液相色譜法(HPLC)、反相HPLC (RP-HPLC)、離子交換HPLC (IEX-HPLC)、親和色譜法、疏水相互作用色譜法(HIC)或尺寸排阻色譜法(SEC)。
[0076]在一些方面中，抗原分級(jí)分離通過(guò)RP-HPLC進(jìn)行。因此，合適類型的反相柱包括但不限于具有從C2到C18不等的各種改性的、多孔、非多孔或整體式的硅膠柱或基于聚合物的柱。適用于分析目的的柱直徑通常是，但不限于，約75 μ m至約5_的范圍，取決于流速，流速可以不同地從約0.1 μ 1/min`變化至約5ml/min。對(duì)于足夠量的抗原的離析,通常使用具有約Imm至約IOmm的直徑的柱。用通常含有調(diào)節(jié)劑(諸如但不限于鹽酸、硫酸、三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸、甲酸、磷酸和磷酸鹽緩沖液)的含水溶劑與有機(jī)溶劑(諸如但不限于乙腈、甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、異丙醇和四氫呋喃)的混合物，從反相柱分離并洗脫蛋白質(zhì)。用于蛋白質(zhì)的反相HPLC的方法是本領(lǐng)域熟知的并且在本文不作進(jìn)一步的闡述，因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行。本文實(shí)施例中更詳細(xì)描述了具體的反相HPLC方法和條件。
[0077]如本文實(shí)施例中描述的，通過(guò)色譜法進(jìn)行的抗原分級(jí)分離提供了極好的線性度和精確度，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)較低。線性度，即獲得直接與樣品中分析物的濃度(量)成比例的試驗(yàn)結(jié)果的能力(在一定范圍內(nèi))，在任何分析程序中是重要的。分析程序的精確度表達(dá)在多個(gè)指定條件下從均一樣品的多次采樣獲得的一系列測(cè)量之間的一致接近度(分散程度)。在各種方面中，在三個(gè)層面:可重復(fù)性、中間精確度和可再現(xiàn)性上考慮精確度。
[0078]抗原量化
[0079]在不使用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，在通過(guò)分級(jí)分離進(jìn)行離析之后用于量化抗原或抗原亞型的方法被包括在本公開(kāi)中。用于量化分級(jí)分離的抗原的合適方法包括但不限于氨基酸分析(AAA)、氮測(cè)定(凱氏)、質(zhì)譜法以及同位素稀釋質(zhì)譜法。[0080]在示例性方面中，抗原濃度使用AAA進(jìn)行測(cè)定。AAA指的是用于測(cè)定氨基酸組合物和/或基于抗原和氨基酸的分子量來(lái)量化組合物中抗原的濃度的方法。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行AAA。AAA不僅是適用于精確測(cè)定蛋白質(zhì)量的工具，而且還提供有關(guān)相對(duì)氨基酸組合物和游離氨基酸的詳細(xì)信息。參見(jiàn)氨基酸分析協(xié)議:分子生物學(xué)方法(Amino Acid Analysis Protocols:Methods in Molecular Biology),第159卷(由 Cooperet al等人編輯，?.2001 Humana Press Inc., Totawa, NJ)。相對(duì)氨基酸組合物給出蛋白質(zhì)的特征圖，其通常足夠用于鑒定蛋白質(zhì)。它通常用作決策支持用于選擇用于蛋白質(zhì)片段化的蛋白酶。[0081]通常，AAA包括水解，然后分離、檢測(cè)和量化。水解或“酸水解”通常通過(guò)酸性條件實(shí)現(xiàn)。例如，標(biāo)準(zhǔn)程序是用6M鹽酸(24小時(shí)，Il(TC)水解。該標(biāo)準(zhǔn)程序是時(shí)間要求和溫度之間的折衷，并可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)調(diào)整。在示例性方面中,進(jìn)行水解時(shí)間研究以確定用于HA的最佳水解的時(shí)間。然而，對(duì)于根據(jù)本公開(kāi)的方法量化的每個(gè)單獨(dú)的抗原，水解時(shí)間可以被優(yōu)化。用于AAA的程序是本領(lǐng)域熟知的且用于AAA的產(chǎn)品是商業(yè)可得的(AccQ標(biāo)記試劑盒(Waters, No WAT052880)和Sigma-Aldrich)。在一些實(shí)施方案中，使用ZorbaxEclipse AAA HPLC柱。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉進(jìn)行AAA的各種方法。本文實(shí)施例中更詳細(xì)描述了具體AAA程序。
[0082]基于特定抗原的已知序列，計(jì)算每個(gè)抗原分子的理論氨基酸數(shù)并隨后計(jì)算每次注射的抗原摩爾量。在樣品制備期間，計(jì)算或測(cè)量抗原的分子質(zhì)量和應(yīng)用的稀釋因子允許計(jì)算樣品中的抗原濃度，表示為μ g抗原/mL樣品。
[0083]在示例性方面中，本文下面提供了計(jì)算HA濃度的公式。
[0084]nμA1=nAA/xAA
[0085]nμ1..血凝素HAl的摩爾量[μ mol]
[0086]nAA…單個(gè)氨基酸的摩爾量(由氨基酸分析產(chǎn)生的結(jié)果)[μ mol]
[0087]xAA…單個(gè)氨基酸的數(shù)量/血凝素HAl分子
[0088]nμA1=nHA[0089]1?…血凝素的摩爾量[μ mol]
[0090]IHha=IIha^Mha
[0091]IIha…血凝素的摩爾量[μ mol]
[0092]1?…HA 的質(zhì)量[μ g]
[0093]Mha…血凝素的分子質(zhì)量(計(jì)算或測(cè)定的)[μ g* μ moF1]
[0094]Cha=Hiha^dfZv1
[0095]Cha…血凝素的濃度[μ g/ml]
[0096]DF…稀釋因子
[0097]Vi…注射體積[ml]
[0098]在本公開(kāi)的示例性實(shí)施方案中，HA的量化基于HAl的峰面積，HAl與其它疫苗組分很好地分離。本公開(kāi)的應(yīng)用性已經(jīng)證實(shí)用于包括但不限于HlNl、H3N2、H5N1、H9N2的不同A型流感亞型和B型流感，強(qiáng)烈表明本文公開(kāi)的方法可以廣泛應(yīng)用于不同HA抗原。本公開(kāi)已經(jīng)對(duì)于來(lái)自流感的HA進(jìn)行了詳細(xì)描述，但不限于僅使用來(lái)自流感的HA。本公開(kāi)還可應(yīng)用于來(lái)自其它病毒的HA抗原并應(yīng)用于其它抗原或抗原亞型的分離和量化。[0099]測(cè)定本文所述的疫苗組合物中抗原濃度的方法測(cè)量抗原濃度，RSD小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2.9%、小于約2.8%、小于約2.7%、小于約2.6%、小于約2.5%、小于約2.4%、小于約2.3%、小于約2.2%、小于約2.1%、小于約2.0%、小于約1.9%、小于約1.8%、小于約1.7%、小于約1.6%、小于約1.5%、小于約1.4%、小于約1.3%、小于約1.2%、小于約1.1%和小于約1.0%。在示例性方面中，取決于抗原濃度，本文描述的方法測(cè)量抗原濃度，RSD為約2.2%和約1.3%ο
[0100]本文引用的每個(gè)出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考通過(guò)引用以與本公開(kāi)不相抵觸的程度整體并入。
[0101]應(yīng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅為了舉例說(shuō)明的目的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到根據(jù)本發(fā)明的各種修改或變化，這些均包括在本申請(qǐng)的精神和權(quán)限以及所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)為了所有目的據(jù)此通過(guò)引用整體并入。
實(shí)施例
[0102]本公開(kāi)的附加方面和細(xì)節(jié)根據(jù)下列實(shí)施例將是明顯的，這些實(shí)施例旨在是說(shuō)明性的而非限制性的。
[0103]實(shí)施例1:
[0104]開(kāi)發(fā)和優(yōu)化用于離析和量化疫苗中的HA的方法
[0105]本文所述的實(shí)驗(yàn)的目的是開(kāi)發(fā)新HPLC方法，該方法基于當(dāng)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)試劑可從WHO或其它地方得到時(shí)HA (即HAl)的測(cè)量結(jié)果來(lái)測(cè)量A型流感/加利福尼亞/07/2009 (HlNl)的疫苗制劑的總HA含量。
[0106]評(píng)估A型流感/加利福尼 亞/07/2009 (HlNl)的以下批次的新產(chǎn)品:
[0107]表1:試驗(yàn)和參考項(xiàng)目

蛋白質(zhì)含量
___( g/ml)
[0108]I__小規(guī)模批次__149
2__大規(guī)模批次__530
3__大規(guī)模批次__373
[0109]通過(guò)反相HPLC量化HA
[0110]如下優(yōu)化樣品制備條件。未稀釋的樣品或用去離子水稀釋的樣品與相同體積的還原緩沖液(6M鹽酸胍、266mM Tris/HClUmM EDTA、pH 8.3、40mM 二硫蘇糖醇)混合。將樣品在85°C下孵育I小時(shí)，然后加入10%(v/v)8.5%磷酸以中止反應(yīng)并防止逆反應(yīng)，即防止由游離半胱氨酸形成二硫鍵。將18，407g樣品離心10分鐘以除去任何顆粒物質(zhì)。使用相同的HPLC條件。
[0111]使用裝備有四元泵和二極管陣列檢測(cè)器的Agilent HPLC系統(tǒng)。使用以下梯度，在Jupiter 5 μ C4柱(150x2mm)上通過(guò)反相HPLC分離蛋白質(zhì):
[0112]洗脫液A:0.1%三氟乙酸的水溶液[0113]洗脫液B:乙腈中0.085%三氟乙酸
[0114]洗脫液C:甲醇
[0115]樣品和標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)分離方法注射，用20%洗脫液B以0.4ml/分鐘的流速等度洗脫IOmin0隨后進(jìn)行用于洗脫蛋白質(zhì)的方法:
[0116]表2:用于HPLC分析的梯度
[0117]
【權(quán)利要求】
1.一種用于從疫苗組合物離析抗原的方法，所述方法包括以下步驟: (a)在沒(méi)有去污劑和沒(méi)有烷基化試劑的情況下溶解所述疫苗組合物中的所述抗原；以及 (b)通過(guò)分級(jí)分離來(lái)離析所述抗原或抗原亞型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶解步驟通過(guò)還原進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述還原包括用二硫蘇糖醇處理所述疫苗組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述溶解步驟還包括用離液劑變性。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述還原還通過(guò)酸化所述抗原或抗原亞型來(lái)進(jìn)行，以防止在分離的抗原亞型之間形成二硫鍵。
6.一種用于量化包括抗原的疫苗組合物中的抗原或抗原亞型含量的方法，所述方法包括權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)所述的方法以及量化所述抗原或抗原亞型的另一步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述量化步驟在不使用抗原標(biāo)準(zhǔn)品的情況下進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述 的方法，其中所述量化步驟使用抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求7-8的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述量化步驟包括通過(guò)氨基酸分析量化抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求3-9的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述還原包括約5分鐘至約20小時(shí)的孵育時(shí)間。
11.根據(jù)權(quán)利要求3-10的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述還原包括約30分鐘至約2小時(shí)的孵育時(shí)間。
12.根據(jù)權(quán)利要求3-11的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述還原包括約I小時(shí)的孵育時(shí)間。
13.根據(jù)權(quán)利要求3-12的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述還原包括約20°C至約100°C的孵育溫度。
14.根據(jù)權(quán)利要求3-13的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述還原包括約50°C至約90°C的孵育溫度。
15.根據(jù)權(quán)利要求3-14的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述還原包括約85°C的孵育溫度。
16.根據(jù)權(quán)利要求4-15的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述離液劑是鹽酸胍、脲、硫脲、鋰、高氯酸鹽或硫氰酸鹽。
17.根據(jù)權(quán)利要求4-16的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酸化用磷酸、鹽酸、硫酸、三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸或甲酸進(jìn)行。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17的任一項(xiàng)所述的方法，其中分級(jí)分離通過(guò)色譜法進(jìn)行。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述色譜法是高效液相色譜法(HPLC)、反相HPLC (RP-HPLC)、離子交換HPLC (IEX-HPLC)、親和色譜法、疏水相互作用色譜法(HIC)或尺寸排阻色譜法(SEC)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述色譜法是反相(RP)-HPLC。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原是病毒的或細(xì)菌的。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原是血凝素(HA)。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22所述的方法，其中所述HA來(lái)自流感病毒疫苗組合物、麻疹病毒疫苗組合物、副流感病毒疫苗組合物或腮腺炎病毒疫苗組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疫苗組合物是流感病毒疫苗組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求23-24的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述流感病毒疫苗組合物提供對(duì)選自由A型流感和B型流感組成的組的流感病毒的防護(hù)作用。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗原亞型是A型流感HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15 和 HA16 與 B 型流感HA的任一種。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗原亞型是A型流感HA亞型HA1、HA2、HA3、HA5、HA7、HA9、HAlO 或 B 型流感 HA。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述A型流感HA亞型是HAl。
29.根據(jù)權(quán)利要求26-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述流感疫苗組合物提供對(duì)選自由 A 型流感 HlNl、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7 和 B 型流感組成的組的流感病毒的防護(hù)作用。
30.根據(jù)權(quán)利要求5-29的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法量化抗原含量，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于約2.5%。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述RSD為約2.2%。
32.根據(jù)權(quán)利要求30-31的任`一項(xiàng)所述的方法，其中所述RSD為約1.3%。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK103502263SQ201280018905
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月21日
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