專利名稱：：Hpv抗原融合蛋白疫苗組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一方面提供了包含編碼免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白的核酸分子的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，其中該突變HPV抗原是包含至少兩個半胱氨酸殘基替代的E7多肽。在一個實施方式中，在人類乳頭瘤病毒相關(guān)的疾病發(fā)生之前給予融合蛋白。在另一個實施方式中，在人類乳頭瘤病毒相關(guān)的疾病被確診后給予融合蛋白。[0017本發(fā)明一方面提供了治療或預(yù)防人類乳頭瘤病毒相關(guān)疾病的方法，包括給予有效量的編碼包含免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白的核酸，其中該突變HPV抗原是包含至少兩個半胱氨酸殘基替代的E7多肽。在具體實施方式中，該編碼融合蛋白的核酸選自由以下成員構(gòu)成的組SEQIDNOS:5，7,11和13。在一個實施方式中，核酸可以被直接提供給受試者。在另一個實施方式中，該核酸與免疫細(xì)胞通過離體方式(exv/vo)4妻觸。圖2示出了重組HPV融合多肽在還原條件下(圖1A)或非還原條件下(圖1B)的SDS-PAGE分析圖。兩塊膠上樣順序相同，分別為第1道在4度貯存7天的C7E7樣品；第2道在4度貯存7天的C7E7m2樣品；第3道在4度貯存7天的C7E7m3樣品；第4道在-20度貯存7天的C7E7樣品；第5道在-20度貯存7天的C7E7m2樣品；第6道在-20度貯存7天的C7E7m3樣品。本發(fā)明總體而言涉及包含突變形式的HPVE7抗原和免疫刺激多肽的融合蛋白，該融合蛋白可用作疫苗來預(yù)防和/或治療人類乳頭瘤病毒相關(guān)的疾病。盡管不希望受理論的限制，免疫刺激多肽和HPV抗原的融合能促進(jìn)針對HPV的免疫應(yīng)答，例如，通過輔助MHCI類分子/肽裝配。因此，這種組合可以增強(qiáng)疫苗在治療或預(yù)防HPV-相關(guān)疾病中的治療效果。單位，前綴和符號可以以它們被接受的SI形式表示。除非另外說明，核酸按從5，到3，的順序從左到右書寫；氨基酸序列按從氨基端到羧基端的順序從左到右書寫。氨基酸可以以IUPAC-IUBMB命名委員會推薦的廣為人知的三字母符號或單字母符號來指代。同樣地，核普酸可以以被廣泛接受的單字母代碼來指代。本發(fā)明中應(yīng)用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"包括藥用兼容的任一和所有的溶劑，分散劑，包衣，抗細(xì)菌和抗真菌物質(zhì)，等滲和延遲吸收物質(zhì)等。在一個實施方式中，人CRT的N端結(jié)構(gòu)域(如SEQIDNO:2序列中的18-366位氨基酸，縮寫為C6)連接到HPV-16E7抗原以形成C6E7融合蛋白。編碼C6E7的核酸序列參見表5。在這個實施方式中，密碼子被優(yōu)化以適于在大腸桿菌中表達(dá)。編碼C6E7的氨基酸序列參見表6。表5.編碼C6E7的多核苦齡列(SEQIDNO:3)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>在一個實施方式中，人全長CRT(SEQIDNO:2序列，縮寫為C7)連接到HPV-16E7m3抗原以形成C7E7m3融合蛋白。編碼C7E7m3的核酸序列參見表15。編碼C7E7m3的氨基酸序列參見表16。表15.編碼C7E7m3的多核苦^f列(SEQIDNO:13)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>含免疫刺激多肽，該免疫刺激多肽可以增強(qiáng)與之相連的突變HPVE7抗原的免疫原性。在一個實施方式中，免疫刺激蛋白具有伴侶功能。不希望受理論的限制，具有伴侶功能的蛋白可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)輔助其它蛋白進(jìn)行正確折疊。具體地，一些伴倡蛋白可以輔助MHCI類分子的裝配。在一些實施方式中，該免疫刺激多肽是屬于分子伴侶超家族的蛋白，它能夠輔助非天然多肽的折疊，該免疫刺激多肽包括，但不限于，Hsp27，Hsp40，Hsp70，Hsp90，HsplOO，HspllO和其它一些小分子Hsp。在一些具體實施方式中，一免疫刺激多肽可以輔助MHCI類分子/肽復(fù)合物在抗原呈遞細(xì)胞中的裝配，該免疫刺激多肽包括，但不限于，4丐網(wǎng)蛋白，鉤聯(lián)接蛋白(calnexin)，tapasin和ER60。如下文討i侖的，含有本發(fā)明疫苗的一個或多個合適的單位劑型可被制成持續(xù)釋放的劑型(如采用微膠嚢，參考WO94/07529和U.S.Pat.NO.4,962,091),可通過不同的途徑給藥，包括非經(jīng)腸(包4舌,爭脈注射和肌內(nèi)注射)途徑以及直4妻注射入患病組織。例如，本疫苗可以直接注射入肺瘤。制劑可以方便地以單獨的單位劑型形式存在，并可以通過任一廣為人知的藥劑學(xué)方法制備獲得。這些方法包括將治療劑(HPV融合多肽疫苗)與液態(tài)載體、固態(tài)介質(zhì)、半固態(tài)載體、精細(xì)分割的固態(tài)載體或其組合相互結(jié)合的步驟，必要時，將產(chǎn)品導(dǎo)入或加工到期望的遞藥系統(tǒng)中。藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或輔藥組合而形成藥用制劑或單位劑型。制劑中的總活性成份占制劑重量的0.1至99.9%。"藥學(xué)上可接受的"指載體、稀釋劑、輔藥，和/或鹽與制劑中的其他成份能相容，并對其受藥者無毒害。藥物的活性成份可以以粉末或顆粒的形式或以溶液、懸浮液或乳狀液的形式存在。所有涉及本發(fā)明公開的出版物、專利申請、出版的專利、以及其它文件都被并入本文作為參考，猶如把每一篇出版物、專利申請、出版的專利、以及其它文件的全部都明確地、單獨地并入本文作的矛盾時以本文中的定義為準(zhǔn)。實施例0126本發(fā)明由以下實施例進(jìn)一步說明，但無論如何不以此為限。實施例1-本發(fā)明中的HPV疫苗多肽的制備5.HPV疫苗多肽的表達(dá)6.HPV融合多肽的純化0140上清液中的蛋白用PEI(聚乙烯亞胺，Sigma-Aldrich,St.,Louis，MO)沉淀。簡要的步驟是，10%的PEI和離心獲得的上清按0.08:1的比例混合。混合物在4。C條件下靜置15分鐘后，12000rc/離心30分鐘。然后，沉淀物使用含0.3MNaCl的緩沖液A(50mMTris，0.5mMEDTA，50mMNaCl，5%甘油，PH7.9)洗滌，棄去上清。使用20倍體積的含0.9MNaCl的緩沖液A洗提目的蛋白。離心去除沉淀，收集上清。接著，上清使用55%的硫酸銨(7.5g硫酸銨/20mL液體)過夜沉淀。離心收集沉淀。為了確定蛋白從大腸桿菌中表達(dá)和純化出來后的穩(wěn)定性和純度，新鮮制備的C6E7、C6E7m2和C6E7m3樣品經(jīng)過SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析(分別見圖1A、1B和1C)。凝膠經(jīng)掃描后，進(jìn)行光密度測定以確定HPV融合蛋白的相對含量。結(jié)果具體表示為C6E7,C6E7m2和C6E7m3相對應(yīng)的條帶的像素點數(shù)量與整條泳道的像素點總數(shù)量的百分比。對每一種HPV疫苗多肽而言，樣品在還原條件下比非還原條件下表現(xiàn)更大量的具有預(yù)期分子量的蛋白(表18)。這說明在每個制備品中多肽與多肽之間有二硫鍵形成。但是在非還原條件下，檢測到的C6E7m2的含量顯著高于野生型C6E7的含量(88.18%對66.43%)。表18通過光密度測定法測定蛋白條帶的含量(4'C儲存)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>[0146為了確定HPV融合多肽儲存時的穩(wěn)定性，樣品在4。C放置2個月，然后再進(jìn)行SDS-PAGE分析(見圖1D和表18)。SDS-PAGE分析表明C6E7m2的純度顯著高于C6E7和C7E6m3。儲存后的野生型C6E7表現(xiàn)大量降解。如非還原和還原SDS-PAGE所示(圖1D),所有的C6E7樣品在儲存期間都發(fā)生降解。部分C6E7m3也發(fā)生降解，但沒有達(dá)到與野生型一樣的程度。在儲存期間，幾乎所有的C6E7m2都保持完整。比較還原和非還原條件下的電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的C6E7m2是聚集的(SDS-PAGE上的高分子量條帶可以證明)。這可能是在儲存期間由于半胱氨酸的交聯(lián)導(dǎo)致的，然而，當(dāng)在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE時，二硫鍵是打開的。本發(fā)明也斗全測了C7E7、C7E7m2和C6E7m3疫苗多肽在4"C或-20"C放置7天后的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖2所示。在(C放置7天后，還原或非還原條件下的SDS-PAGE顯示野生型C6E7幾乎全部被降解(圖2A和圖2，泳道1)。相反地，4X:放置7天后的突變體C7E7m2和C7E7m3大部分是完整的(圖2A和圖2B,泳道2-3)。同樣地，與突變體C7E7m2和C7E7m3相比(圖2A和圖2B,泳道5-6),-20°C放置7天后野生型C7E7出現(xiàn)大量的降解(圖2A和圖2,泳道4)。與野生型相比，C7E7m2和C7E7m3突變體對降解和聚合更具有4氐抗力，這可被用于生產(chǎn)出從生產(chǎn)到用藥期間保持穩(wěn)定的由這些多肽組成的HPV疫苗。因此，與含野生型E7抗原的多肽相比，本發(fā)明中的HPV融合多肽提供的疫苗組合物具有在儲存期間表現(xiàn)增強(qiáng)的穩(wěn)定性的特征。實施例3_本發(fā)明HPV融合多肽對體內(nèi)腫瘤發(fā)生的預(yù)防作用|0149采用人腫瘤小鼠模型檢測了本發(fā)明HPV融合多肽預(yù)防HPV誘導(dǎo)的肺瘤發(fā)生的能力。在具體實施中，小鼠在給予本發(fā)明的HPV融合多肽后，接種HPV16E6/E7轉(zhuǎn)化的小鼠TC-1細(xì)胞。用本發(fā)明的HPV融合多肽免疫小鼠后，除肺瘤發(fā)生率下降外，肺瘤的體積也變小。第0天在小鼠(n=10只/組)右側(cè)皮下接種1.5xl()5個能表達(dá)E7的TC-1細(xì)胞。第5天，分別給小鼠注射PBS、單獨200(xgBCG或C6E7m2、單獨60|agE7或E7m2,或注射BCG分別與E7、E7m2、或C6E7m2的混合物。每隔3到4天觀察腫瘤生長狀態(tài)，并使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長度和寬度。腫瘤體積通過如下公式計算長度x寬度x寬度+2，同時將腫瘤的生長變化繪制成曲線圖。。在第三項研究中研究了經(jīng)全長鈣網(wǎng)蛋白與野生型或突變型HPVE7抗原組成的融合蛋白聯(lián)合BCG免疫后小鼠產(chǎn)生的T細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。圖6C比較了分別從100嗎C7E7m2或100pgC7E7m2耳關(guān)合不同劑量的BCG(50|ig,100pg,200pg或400(ig)或單獨400pgBCG免疫小鼠來源的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。實驗結(jié)果表明BCG能協(xié)助本發(fā)明的HPV疫苗發(fā)揮作用，誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。[0169在第四項研究中研究了經(jīng)4丐網(wǎng)蛋白N端結(jié)構(gòu)域(18-366位氨基酸)與野生型或突變型HPVE7抗原組成的融合蛋白聯(lián)合BCG免疫后小鼠產(chǎn)生的T細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。圖6D比較了從lOOiagC6E7m2或lOO^igC6E7m2聯(lián)合不同劑量的BCG(50嗎，lOOpg,200(xg或400^ig)或單獨400|agBCG免疫小鼠來源的效應(yīng)T'淋巴細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。實驗結(jié)果表明BCG能協(xié)助本發(fā)明的HPV疫苗發(fā)揮作用，誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。在第三項研究中研究了經(jīng)全長鈣網(wǎng)蛋白與野生型或突變型HPVE7抗原組成的融合蛋白聯(lián)合BCG免疫后小鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生情況。圖7C比較了分別經(jīng)100pgC7E7m2或100jxgC7E7m2聯(lián)合不同劑量的BCG(50嗎，IOO嗎，200|iig或400)ig)或單獨400昭BCG免疫后小鼠脾細(xì)胞的IFN-Y產(chǎn)生情況。實驗結(jié)果表明BCG能協(xié)助本發(fā)明的HPV融合多肽疫苗發(fā)揮作用，誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞因子產(chǎn)生。這些研究表明本發(fā)明的HPV疫苗組合物能被用于誘導(dǎo)特異的免疫應(yīng)答-細(xì)胞因子產(chǎn)生(當(dāng)用HPVE7抗原在體外刺激時)。這些結(jié)果支持本疫苗組合物可以被用于在人類誘導(dǎo)出針對HPV誘發(fā)的癌細(xì)胞的免疫攻擊。因此，本發(fā)明的HPV融合多肽疫苗組合物能夠通過誘導(dǎo)免疫應(yīng)答來治療或預(yù)防HPV相關(guān)的疾病。實施例7-人類中的治療性和預(yù)防性免疫(預(yù)示性的)[0177本發(fā)明的HPV融合多肽可^^用于治療HPV感染和其感染所導(dǎo)致的疾病。特別的，對于有患HPV感染相關(guān)病癥風(fēng)險的(或易患HPV感染相關(guān)病癥的)或已患有HPV感染相關(guān)病癥的受試者，本發(fā)明提供了預(yù)防和治療的方法?？梢栽诟腥镜陌Y狀特征表現(xiàn)之前給予預(yù)防性HPV融合多肽，從而預(yù)防或延遲疾病或病情的發(fā)展。在治療性應(yīng)用中，本發(fā)明的HPV融合多肽被用于疑似感染或已經(jīng)感染了HPV的受試者。本發(fā)明將一個適當(dāng)?shù)?、能發(fā)揮治療或預(yù)防效果的給藥劑量定義為治療或預(yù)防有效劑量。0178在本實施例中，用本發(fā)明的疫苗組合物免疫患HPV相關(guān)疾病(如宮頸癌)的受試者。HPV融合多肽的制備如實施例1所描述。由C6E7m2或C7E7m3組成的疫苗(包含或不包含BCG佐劑)可以被給予巴氏涂片檢測結(jié)果異常的人類受試者。巴氏涂片檢測能檢測出宮頸細(xì)胞的改變，并能檢測出異常的宮頸細(xì)胞。因此，巴氏涂片檢測能提示已患或易患HPV相關(guān)疾病的受試者的宮頸細(xì)胞的改變情況。在經(jīng)過治療后，監(jiān)測患者的腫瘤的發(fā)生情況和/或腫瘤體積的縮小情腫瘤的發(fā)生，或與正常的受試者(即沒有遭受病毒感染)相比受試者的肺瘤體積縮小。等同物[01791本發(fā)明不限于本申請中所述的具體實施方案，這些實施方案僅僅為了解釋說明本發(fā)明的各個方面。可以在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，對本發(fā)明作出多種修改和變化，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。除了本說明所列舉的方法和裝備以外，從本發(fā)明先前的描述中，功能上等同的方法和裝置對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。這些修改和變化意圖落入本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明將僅由所附權(quán)利要求的術(shù)語以及這些權(quán)利要求對應(yīng)的等同物的全部范圍所限定。應(yīng)該理解的是本發(fā)明并不限定于所描述的特定方法，試劑，化合物，組合物或生物系統(tǒng)，這些毫無疑問地是可以變化的。也應(yīng)當(dāng)理解，這里所使用的術(shù)語僅用來描述特定的實施方案，并不用于限定。10180其它的實施方案在如下的權(quán)利要求中被闡述。權(quán)利要求1.疫苗組合物，包含免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白，其中該突變HPV抗原為包含至少兩個半胱氨酸殘基的替代的HPV16E7多肽。2.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述的免疫刺激多肽選自由以下成員構(gòu)成的組4丐網(wǎng)蛋白，鈣聯(lián)接蛋白，tapasin，ER60，Hsp27，Hsp40,Hsp70,Hsp90,HsplOO和Hspl10。3.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述的免疫刺激多肽是釣網(wǎng)蛋白或其生物活性結(jié)構(gòu)域，片段或同源物。4.權(quán)利要求3的疫苗組合物，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網(wǎng)蛋白的N端結(jié)構(gòu)域，包含SEQIDNO:2的18-366位氨基酸。5.權(quán)利要求3的疫苗組合物，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網(wǎng)蛋白的N端結(jié)構(gòu)域，包含SEQIDNO:2的18-180位氨基酸。6.權(quán)利要求l的疫苗組合物，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的一個或多個半胱氨酸殘基上的替代，所述半胱氨酸殘基選自由半胱氨酸-24,半胱氨酸-59和半胱氨酸-68構(gòu)成的組。7.權(quán)利要求6的疫苗組合物，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的半胱氨酸-59和半胱氨酸-68上的替代。8.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述的融合蛋白選自由以下成員構(gòu)成的組SEQIDNOS:6，8，12和14。9.權(quán)利要求l的疫苗組合物，進(jìn)一步包含佐劑。10.權(quán)利要求9的疫苗組合物，其中所述的佐劑是BCG。11.治療或預(yù)防人類乳頭瘤病毒相關(guān)疾病的藥物組合物，包含有效量的權(quán)利要求1的融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。12.權(quán)利要求11的藥物組合物，進(jìn)一步包含佐劑。13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述的佐劑是BCG。14.編碼免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白的核酸分子，其中該突變HPV抗原為包含至少兩個半胱氨酸殘基的替代的E7多肽。15.權(quán)利要求14的核酸分子，其中所述的免疫刺激多肽是鈣網(wǎng)蛋白或其生物活性同源物，結(jié)構(gòu)域或片段。16.權(quán)利要求15的核酸分子，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網(wǎng)蛋白的N端結(jié)構(gòu)域，包含SEQIDNO:2的18-366位氨基酸。17.權(quán)利要求15的核酸分子，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網(wǎng)蛋白的N端結(jié)構(gòu)域，包含SEQIDNO:2的18-180位氨基酸。18.權(quán)利要求14的核酸分子，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的一個或多個半胱氨酸殘基上的替代，所述半胱氨酸殘基選自由半胱氨酸-24,半胱氨酸-59和半胱氨酸-68構(gòu)成的組。19.權(quán)利要求18的核酸分子，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的半胱氨酸-59和半胱氨酸-68上的替代。20.權(quán)利要求14的核酸分子，其中所述的融合蛋白選自由以下成員構(gòu)成的組SEQIDNOS:6，8,12和14。21.權(quán)利要求14的核酸分子，其中所述的編碼融合蛋白的核酸選自由以下成員構(gòu)成的組SEQIDNOS:5，7,11和13。22.包含權(quán)利要求14的核酸分子的表達(dá)載體。23.權(quán)利要求22的表達(dá)載體，進(jìn)一步包含可操作地連接到所述核酸分子的啟動子。24.包含權(quán)利要求20的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。25.治療或預(yù)防人類乳頭瘤病毒相關(guān)疾病的方法，包括給予受試者有效量的包含免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白，其中該突變HPV抗原是包含至少兩個半胱氨酸殘基替代的E7多肽，從而治療或預(yù)防該受試者中的HPV-相關(guān)疾病。26.纟又利要求25的方法，其中所述的人類乳頭瘤病毒相關(guān)疾病選自由以下成員構(gòu)成的組宮頸癌，肛門上皮內(nèi)瘤樣病變，宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變，肛門生殖器疣，復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭狀瘤和陰道上皮內(nèi)瘤樣病變。27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中在人類乳頭瘤病毒相關(guān)疾病發(fā)生之前給予所述融合蛋白。28.權(quán)利要求25的方法，其中所述的免疫刺激多肽選自由以下成員構(gòu)成的組4丐網(wǎng)蛋白，4丐耳關(guān)4妾蛋白，tapasin,ER60,Hsp27，Hsp40,Hsp70，Hsp90,Hsp100和Hsp110。29.權(quán)利要求25的方法，其中所述的免疫刺激多肽是鈣網(wǎng)蛋白或其生物活性同源物，結(jié)構(gòu)域或片段。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網(wǎng)蛋白的N端結(jié)構(gòu)域，包含SEQIDNO:2的18-366位氨基酸。31.權(quán)利要求29的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人釣網(wǎng)蛋白的N端結(jié)構(gòu)域，包含SEQIDNO:2的18-180位氨基酸。32.權(quán)利要求25的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的一個或多個半胱氨酸殘基上的替代，所述半胱氨酸殘基選自由半胱氨酸-24，半胱氨酸-59和半胱氨酸-68構(gòu)成的組。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的半胱氨酸-59和半胱氨酸-68上的替代。34.權(quán)利要求24的方法，其中所述的融合蛋白選自由以下成員構(gòu)成的組SEQIDNOS:6，8，12和14。35.權(quán)利要求24的方法，進(jìn)一步包含給予有效量佐劑的步驟。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述的佐劑是BCG。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述的BCG與所述融合蛋白同時給予。38.治療或預(yù)防人類乳頭瘤病毒相關(guān)疾病的方法，包括給予受試者有效量的編碼包含免疫刺激多肽和突變HPV抗原的融合蛋白的核酸，其中該突變HPV抗原是包含至少兩個半胱氨酸殘基替代的E7多肽，/人而治療或預(yù)防該受試者中的HPV-相關(guān)疾病。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述的免疫刺激多肽是鈣網(wǎng)蛋白或其生物活性同源物，結(jié)構(gòu)域或片段。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網(wǎng)蛋白的N端結(jié)構(gòu)域，包含SEQIDNO:2的18-366位氨基酸。41.權(quán)利要求38的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網(wǎng)蛋白的N端結(jié)構(gòu)域，包含SEQIDNO:2的18-180位氨基酸。42.權(quán)利要求38的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的一個或多個半胱氨酸殘基上的替代，所述半胱氨酸殘基選自由半胱氨酸-24,半胱氨酸-59和半胱氨酸-68構(gòu)成的組。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的半胱氨酸-59和半胱氨酸-68上的替代。44.權(quán)利要求38的方法，其中所述的融合蛋白選自由以下成員構(gòu)成的組SEQIDNOS:6，8，12和14。45.權(quán)利要求38的方法，其中所述的編碼融合蛋白的核酸選自由以下成員構(gòu)成的組SEQIDNOS:5，7,11和13。46.制備疫苗組合物的方法，包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼免疫刺激多肽和突變HPV抗原的重組融合蛋白的核酸，其中該突變HPV抗原是包含至少兩個半胱氨酸殘基替代的E7多肽。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述的宿主細(xì)胞是五.co//細(xì)胞。48.權(quán)利要求46的方法，其中所述的免疫刺激多肽是鈣網(wǎng)蛋白或其生物活性同源物，結(jié)構(gòu)域或片段。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網(wǎng)蛋白的N端結(jié)構(gòu)域，包含SEQIDNO:2的18-366位氨基酸。50.權(quán)利要求48的方法，其中所述的免疫刺激多肽是人鈣網(wǎng)蛋白的N端結(jié)構(gòu)域，包含SEQIDNO:2的18-180位氨基酸。51.;f又利要求46的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的一個或多個半胱氨酸殘基上的替代，所述半胱氨酸殘基選自由半胱氨酸-24,半胱氨酸-59和半胱氨酸-68構(gòu)成的組。52.權(quán)利要求50的方法，其中所述的突變E7多肽具有SEQIDNO:1的半胱氨酸-59和半胱氨酸-68上的替代。53.權(quán)利要求46的方法，其中所述的融合蛋白選自由以下成員構(gòu)成的組SEQIDNOS:6，8,12和14。權(quán)利要求46的方法，其中所述的編碼融合蛋白的核酸選自由以下成員構(gòu)成的組SEQIDNOS:5，7，11和13。全文摘要本發(fā)明提供了包含免疫刺激多肽和突變的人乳頭瘤病毒E7蛋白的融合蛋白。本發(fā)明還提供了編碼該融合蛋白的基因，含有該基因的表達(dá)載體，包含該融合蛋白的藥物組合物，用該融合蛋白治療或預(yù)防人類乳頭瘤病毒相關(guān)疾病的方法，以及該融合蛋白在制備治療或預(yù)防人類乳頭瘤病毒相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。文檔編號A61K39/12GK101528255SQ200780039068公開日2009年9月9日申請日期2007年10月19日優(yōu)先權(quán)日2006年10月19日發(fā)明者崔俊生,冰朱,楊世方申請人:沙東生物藥業(yè)(天津)有限公司;北京沙東生物技術(shù)有限公司