專利名稱：人二倍體狂犬病疫苗病毒液的滅活方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人二倍體狂犬病疫苗病毒液的滅活方法，屬于生物制品制備技術領域。
背景技術：
狂犬病是一種侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性病毒性傳染病，是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病，一旦發(fā)病死亡率為100%。衛(wèi)生部2009年、2010年全國法定傳染病報告發(fā)病、死亡統(tǒng)計表中，狂犬病的死亡率第一，死亡數(shù)第三，狂犬病已成為我國最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。
為滿足我國國內市場的需求，國內很多廠家都在生產(chǎn)狂犬疫苗，主要包括原代地鼠腎細胞、原代雞胚細胞和VeiO傳代細胞疫苗。這些疫苗都存在異源蛋白，外源因子，DNA污染等各種不同的風險因素。人二倍體細胞狂犬病疫苗目前只在歐洲有上市，如美國Wyeth廠，法國Sanofi Pasteur廠和德國Behring廠生產(chǎn)的二倍體疫苗,通過幾十年的市場銷售，已證實具有良好的免疫原性和安全性，這得益于生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定。國內目前狂犬病疫苗主要為滅活疫苗,滅活疫苗已失去對機體的感染力，但仍保持其免疫原性，可以刺激機體產(chǎn)生相應的免疫力，抵抗野毒株的感染，滅活疫苗免疫效果良好。滅活劑主要為福爾馬林和β_丙內酯，但是福爾馬林對狂犬病毒有持續(xù)的滅活作用，導致疫苗效力不斷下降，而丙內酯滅活的疫苗經(jīng)37°C作用后能完全水解，所以保持交苗效力的相對稱定，國內目前狂犬病毒疫苗滅活工藝，采用超濾濃縮后加入β -丙內酯4°C滅活24h后水解滅活劑，工藝較粗略，對滅活過程較少監(jiān)控，只在滅活完成后進行滅活效果驗證，存在滅活過程的不確定性，給大規(guī)?；纳a(chǎn)帶來未知性，也對終產(chǎn)品的放行具有潛在危險因素。本方法不止在滅活前對技術參數(shù)確認，并且在滅活過程中進行滅活效果監(jiān)控，滅活后進行滅活效果驗證試驗，通過在滅活步驟增加過濾及轉移，以及對滅活條件參數(shù)的確定，達到最終生產(chǎn)出的滅活疫苗安全性。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種人二倍體狂犬病疫苗病毒液的滅活方法。本發(fā)明提供的人二倍體狂犬病疫苗病毒液的滅活方法，包括以下步驟(I)濃縮人二倍體狂犬病疫苗病毒液，濃縮倍數(shù)為10 20倍，獲得病毒濃縮液；(2)添加滅活劑β -丙內酯，攪拌；(3)滅活病毒液的轉移；包括兩次滅活病毒液的轉移，第I次是將添加了滅活劑并攪拌后的病毒液轉移至另一容器，第2次是將第I次轉移后的滅活病毒液繼續(xù)攪拌滅活，然后再轉移到無毒區(qū)的容器中；(4)水解去除滅活劑。其中，步驟(I)濃縮病毒液的方法是將人二倍體狂犬病疫苗病毒液經(jīng)3 6μπι的過濾器和O. 8 μ m的過濾器過濾，再進行超濾濃縮.
所述的超濾濃縮是采用IOKB的超濾膜包進行超濾。超濾濃縮前，用不含人血白蛋白的沖洗液平衡超濾膜包，膜包平衡后的回流液的pH值為6. O 8. O。所述的沖洗液為BME液，含質量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氫鈉。進一步，本發(fā)明滅活方法中，步驟(I)還包括將超濾濃縮后的濃縮液先后經(jīng)3 6 μ m的過濾器和O. 45 μ m的過濾器過濾。本發(fā)明的狂犬病病毒液濃縮液存放于2 8°C不超過30天。本發(fā)明實施例中所用的人二倍體狂犬病疫苗病毒液是在人用二倍體細胞上接種狂犬病病毒株得到的狂犬病病毒收獲液。所述的人用二倍體細胞可以為KMB-17、W1-38、MRC-5、2BS中的一種。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的狂犬病病毒為狂犬病病毒固定毒PM-1503-3M(簡稱PM株)。在本發(fā)明的實施例中，所用的人用二倍體細胞為MRC-5。 進一步地，步驟(I)獲得的濃縮病毒液中人血白蛋白的濃度為40 60mg/ml，濃縮液的PH值為7. O 9. 0,10 15°C下平衡。更進一步地，步驟(I)獲得的濃縮病毒液中人血白蛋白的濃度為45 55mg/ml，濃縮液的pH值為7. 5 8. 5。本發(fā)明方法中，步驟(2)添加添加滅活劑丙內酯的方法是先將丙內酯用滅菌水1:40倍稀釋，再以體積比1:100添加到濃縮病毒液中。其中，步驟(2)攪拌條件為10 15°C下，155 180r/min。其中，步驟(3)中在滅活劑添加后的第50 70min時，進行第I次滅活病毒液的轉移；病毒液轉移入另一容器后繼續(xù)攪拌，待添加滅活劑后的第600min 700min時，將滅活液轉移到無毒區(qū)的容器中繼續(xù)攪拌滅活至滅活劑添加后的第1400 1500min。進一步地，步驟(3)的操作在10_15°C條件下進行。本發(fā)明滅活方法中，將步驟(3)獲得的滅活液于37°C進行水解140 160min。本發(fā)明的滅活方法對狂犬病毒液的滅活效果好，加入滅活劑后10小時即可完全滅活，且對狂犬病病毒的抗原含量沒有負面影響。本發(fā)明提供的病毒液滅活方法步驟簡單、滅活時間短、滅活效果良好、成本低、無污染，適宜在疫苗制備領域大規(guī)模推廣應用。說明書附1為丙內酯滅活病毒滅活效果曲線圖。圖2為丙內酯水解曲線圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實施例中使用的狂犬病病毒為固定毒ΡΜ-1503-3Μ (簡稱PM株)，人二倍體細胞為MRC-5，均購自法國Sanofi Pasteur公司。人二倍體狂犬病疫苗病毒液來自北京民海生物科技有限公司。實施例1狂犬病疫苗病毒液的規(guī)?；瘻缁罘椒?I)取制備好的人二倍體狂犬病疫苗病毒液的收獲液先經(jīng)3 μ m濾器過濾再經(jīng)O. 8 μ m濾器過濾，澄清過濾后用Millipore的超濾膜包超濾(10KB)，超濾濃縮前，先用不含人血白蛋白的沖洗液(BME液，含質量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氫鈉)來平衡膜包，檢測回流液的PH值，pH值為6. 0，符合要求后進行濃縮，濃縮倍數(shù)為14. 6，濃縮后的單次濃縮液先經(jīng)3 μ m濾器過濾，再經(jīng)O. 45 μ m濾器過濾后存放于2°C 28天。根據(jù)收獲的次數(shù)，將單次病毒收獲液濃縮后合并，調整人血白蛋白的濃度至45mg/ml，測得濃縮液的pH值為7. 50，再將溫度平衡至12°C過夜，將丙內酯首先用滅菌注射用水1:40倍稀釋，再按照1:100的體積比滴加到濃縮合并液中，12°C下持續(xù)攪拌，轉速為155r/min，在加入β-丙內酯后第58min時停止攪拌，將滅活液轉移至另一容器，使瓶壁或管道中的未滅活病毒不沾染滅活液，繼續(xù)攪拌(155r/min)滅活，在加入β -丙內酯后第660min時，將滅活液通過區(qū)域傳遞孔轉移到無毒區(qū)的另一個新容器中繼續(xù)滅活至滅活劑加入后第1420min時，結束滅活，整個滅活過程保持溫度為12°C。將容器轉移水浴鍋中，37°C水解150min，水解后的滅活液稱為原液。命名為實例I。通過氣相色譜的分析方法監(jiān)測β -丙內酯在37°C水解情況，見表I。表I β -丙內酯水解情況分析
進樣時間(min) 峰面積 β-丙內麗旨濃度(ppm)
O3377299.4
302706236.0
60 1919 161.7 90 1341 107.1 120 892 64,6 _150_571_344_通過檢測結果分析，β -丙內酯在水解150分鐘時其濃度由未水解時的299. 4ppm降至34. 4ppm，低于該方法定量限以下，說明β -丙內酯在37°C水解150分鐘可完全達到水解效果。實施例2狂犬病疫苗病毒液的規(guī)模化滅活方法(2)取制備好的人二倍體狂犬病疫苗病毒液的收獲液先經(jīng)4. 5μπι濾器過濾再經(jīng)O. 8 μ m濾器過濾,澄清過濾后用Millipore的超濾膜包超濾(IOKB),超濾濃縮前,先用不含人血白蛋白的沖洗液(BME液，含質量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氫鈉)來平衡膜包，檢測回流液的PH值，pH值為7. 0，符合要求后進行濃縮，濃縮倍數(shù)為18. 8倍，濃縮后的單次濃縮液先經(jīng)4. 5 μ m濾器過濾，再經(jīng)O. 45 μ m濾器過濾后存放于4°C 20天。將單次收獲液濃縮后合并，調整人血白蛋白的濃度至55mg/ml，測得濃縮液的pH值為8. 43，再將溫度平衡至11°C。將丙內酯首先用滅菌注射用水1:40倍稀釋，再按照1:100的體積比滴加到濃縮合并液中，ire下,持續(xù)攪拌,轉速為160r/min,在加入β-丙內酯后60min時停止攪拌，將滅活液轉移至另一容器，使瓶壁或管道中的未滅活病毒不沾染滅活液，繼續(xù)攪拌(160r/min)滅活，在680min時，將滅活液通過區(qū)域傳遞孔轉移到無毒區(qū)的另一個新容器中繼續(xù)滅活至滅活劑加入后第1440min (即加入滅活劑后第24小時)時，結束滅活，整個滅活過程保持溫度為11 12°C之間。將容器轉移水浴鍋中，37°C水解144min，水解后的滅活液稱為原液。命名為實例2。通過氣相色譜的分析方法監(jiān)測丙內酯在37°C水解情況，其水解情況同實施例I類似，β_丙內酯在水解144分鐘時其濃度低于該方法定量限以下，說明本實施例中β -丙內酯在37°C水解144分鐘可完全達到水解效果。實施例3狂犬病疫苗病毒液的規(guī)?；瘻缁罘椒?3)取制備好的人二倍體狂犬病疫苗病毒液的收獲液先經(jīng)6 μ m濾器過濾再經(jīng)O. 8 μ m濾器過濾，澄清過濾后用Millipore的超濾膜包超濾(10KB)，超濾濃縮前，先用不含人血白蛋白的沖洗液(BME液，含質量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氫鈉)來平衡膜包，檢測回流液的PH值，pH值為8. 0，符合要求后進行濃縮，濃縮倍數(shù)為16. 7倍，濃縮后的單次濃縮液先經(jīng)6 μ m濾器過濾，再經(jīng)O. 45 μ m濾器過濾后置于6°C環(huán)境下保存30天。根據(jù)收獲的次數(shù)，將單次收獲液濃縮后合并，調整人血白蛋白的濃度至48mg/ml，測得濃縮液的pH值為8. 30，再將溫度平衡至11.5°C，將丙內酯首先用滅菌注射用水1:40倍稀釋，再按照1:100的體積比滴加到濃縮合并液中，在11 12°c條件下持續(xù)攪拌，轉速為170r/min，在加入 β -丙內酯后62min時停止攪拌，將滅活液轉移至另一容器，使瓶壁或管道中的未滅活病毒不沾染滅活液，繼續(xù)攪拌(170r/min)滅活，在加入β -丙內酯后第700min時，將滅活液通過區(qū)域傳遞孔轉移到無毒區(qū)的另一個新容器中繼續(xù)滅活至滅活劑加入后第1460min時，結束滅活，整個滅活過程保持溫度為11 12°C之間。將容器轉移水浴鍋中，37°C水解156min，水解后的滅活液稱為原液。命名為實例3。通過氣相色譜的分析方法監(jiān)測丙內酯在37°C水解情況，其水解情況同實施例I類似，β_丙內酯在水解156分鐘時其濃度低于該方法定量限以下，說明本實施例中β -丙內酯在37°C水解156分鐘可完全達到水解效果。實施例4狂犬病疫苗病毒液的規(guī)?；瘻缁罘椒?4)取制備好的人二倍體狂犬病疫苗病毒液的收獲液先經(jīng)3 μ m濾器過濾再經(jīng)O. 8 μ m濾器過濾，澄清過濾后用Millipore的超濾膜包超濾(10KB)，超濾濃縮前，先用不含人血白蛋白的沖洗液(BME液，含質量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氫鈉)來平衡膜包，檢測回流液的PH值，pH值為7. 5，符合要求后進行濃縮濃縮后的單次濃縮液先經(jīng)3 μ m濾器過濾，再經(jīng)0.45 μ m濾器過濾后存放于8°C 3天。根據(jù)收獲的次數(shù)，按照上述濃縮。對于最后一次濃縮，通過計算使多次濃縮合并液的濃縮倍數(shù)為16. 8。將單次收獲液濃縮后合并，調整人血白蛋白的濃度至60mg/ml，測得濃縮液的pH值為7. 90，再將溫度平衡至12. 5°C過夜，將β-丙內酯首先用滅菌注射用水1:40倍稀釋，再按照1:100的體積比滴加到濃縮合并液中，保持溫度為12 13°C之間，持續(xù)攪拌165r/min，在加入β -丙內酯后60min時將滅活液轉移至另一容器，使瓶壁或管道中的未滅活病毒不沾染滅活液，繼續(xù)攪拌(165r/min)滅活，在加入β -丙內酯后620min時，將滅活液通過區(qū)域傳遞孔轉移到無毒區(qū)的另一個新容器中繼續(xù)滅活至滅活劑加入后第1400min時，結束滅活，整個滅活過程保持溫度在12 13°C之間。將容器轉移水浴鍋中，37°C水解140min，水解后的滅活液稱為原液。命名為實例4。通過氣相色譜的分析方法監(jiān)測丙內酯在37°C水解情況，其水解情況同實施例I類似，β_丙內酯在水解140分鐘時其濃度低于該方法定量限以下，說明本實施例中β -丙內酯在37°C水解140分鐘可完全達到水解效果。實施例5狂犬病疫苗病毒液的規(guī)模化滅活方法(5)
取制備好的人二倍體狂犬病疫苗病毒液的收獲液先經(jīng)3 μ m濾器過濾再經(jīng)O. 8 μ m濾器過濾，澄清過濾后用Millipore的超濾膜包超濾(10KB)，超濾濃縮前，先用不含人血白蛋白的沖洗液(BME液，含質量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氫鈉)來平衡膜包，檢測回流液的PH值，pH值為7. 8，符合要求后進行濃縮，濃縮后的單次濃縮液先經(jīng)3μπι濾器過濾，再經(jīng)0.45 μ m濾器過濾后存放于2°C。根據(jù)收獲的次數(shù)，按照上述濃縮。對于最后一次濃縮，通過計算使多次濃縮合并液的濃縮倍數(shù)為13. 2。將單次收獲液濃縮后合并，調整人血白蛋白的濃度至55mg/ml，測得濃縮液的pH值為8. 00，再將溫度平衡至12°C過夜，將β -丙內酯首先用滅菌注射用水1:40倍稀釋，再按照1:100的體積比滴加到濃縮合并液中，在12°C下持續(xù)攪拌170r/min，在加入β-丙內酯后50min時將滅活液轉移至另一容器，使瓶壁或管道中的未滅活病毒不沾染滅活液，繼續(xù)攪拌(160r/min)滅活，在加入β -丙內酯后690min時，將滅活液通過區(qū)域傳遞孔轉移到無毒區(qū)的另一個新容器中繼續(xù)滅活至滅活劑加入后第1430min時，結束滅活，整個滅活過程保持溫度為12°C。將容器轉移水浴鍋中，37°C水解148min,水解后的滅活液稱為原液。命名為實例5。 通過氣相色譜的分析方法監(jiān)測丙內酯在37°C水解情況，其水解情況同實施例I類似，β_丙內酯在水解148分鐘時其濃度低于該方法定量限以下，說明本實施例中β -丙內酯在37°C水解148分鐘可完全達到水解效果。實施例6狂犬病疫苗病毒液的規(guī)?；瘻缁罘椒?6)取制備好的人二倍體狂犬病疫苗病毒液的收獲液先經(jīng)6 μ m濾器過濾再經(jīng)O. 8 μ m濾器過濾，澄清過濾后用Millipore的超濾膜包超濾(10KB)，超濾濃縮前，先用不含人血白蛋白的沖洗液(BME液，含質量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氫鈉)來平衡膜包，檢測回流液的PH值，pH值為7. 6，符合要求后進行濃縮，濃縮后的單次濃縮液先經(jīng)6μπι濾器過濾，再經(jīng)0.45 μ m濾器過濾后存放于4°C 10天。根據(jù)收獲的次數(shù)，按照上述濃縮。對于最后一次濃縮，通過計算使多次濃縮合并液的濃縮倍數(shù)為17.1。將單次收獲液濃縮后合并，調整人血白蛋白的濃度至40mg/ml，，測得濃縮液的pH值為9. 0，再將溫度平衡至10°C，將β-丙內酯首先用滅菌注射用水1:40倍稀釋，再按照1:100的體積比滴加到濃縮合并液中，10 12°C溫度范圍內，持續(xù)攪拌，轉速為180r/min，在加入β-丙內酯后70min時將滅活液轉移至另一容器，使瓶壁或管道中的未滅活病毒不沾染滅活液，繼續(xù)攪拌(165r/min)滅活，在加入β -丙內酯后670min時，將滅活液通過區(qū)域傳遞孔轉移到無毒區(qū)的另一個新容器中繼續(xù)滅活至滅活劑加入后第1500min時，結束滅活，整個滅活過程保持溫度為10 12°C溫度之間。將容器轉移水浴鍋中，37°C水解160min，水解后的滅活液稱為原液。命名為實例6。通過氣相色譜的分析方法監(jiān)測丙內酯在37°C水解情況，其水解情況同實施例I類似，β_丙內酯在水解160分鐘時其濃度低于該方法定量限以下，說明本實施例中β -丙內酯在37°C水解160分鐘可完全達到水解效果。實施例7滅活效果的驗證(動物試驗)按實施例1 6的方法,分別于滅活劑加入后第1、3、5、7、10、12、14小時和原液取滅活病毒懸液各5ml，在20分鐘內進行腦腔注射20只小鼠，每只O. 03ml，小鼠為SPF級昆明小鼠，12 15g，雄性，注射后每日觀察，連續(xù)觀察22天，記錄小鼠是否有體重減輕或麻痹、癱瘓等狂犬病病癥。試驗結束后計算小鼠體重平均增加情況.，并計算動物死亡率。
表2 β -丙內酯滅活狂犬病疫苗病毒液接種小鼠死亡率情況
權利要求
1.一種人二倍體狂犬病疫苗病毒液的滅活方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)濃縮人二倍體狂犬病疫苗病毒液，濃縮倍數(shù)為10 20倍，獲得病毒濃縮液； (2)添加滅活劑β-丙內酯，攪拌； (3)滅活病毒液的轉移；包括兩次滅活病毒液的轉移，第I次是將添加了滅活劑并攪拌后的病毒液轉移至另一容器，第2次是將第I次轉移后的滅活病毒液繼續(xù)攪拌滅活，然后再轉移到無毒區(qū)的容器中； (4)水解去除滅活劑。
2.如權利要求1所述的滅活方法，其特征在于，步驟(I)濃縮病毒液的方法是將狂犬病病毒液先后經(jīng)3 6 μ m的過濾器和O. 8 μ m的過濾器過濾，然后進行超濾濃縮。
3.如權利要求2所述的滅活方法，其特征在于，所述的超濾濃縮是采用IOKB的超濾膜包進行超濾。
4.如權利要求2所述的滅活方法，其特征在于，還包括將超濾濃縮后的濃縮液先后經(jīng)3 6 μ m的過濾器和O. 45 μ m的過濾器過濾。
5.如權利要求1 4任一所述的滅活方法，其特征在于，步驟(I)獲得的濃縮病毒液中人血白蛋白的濃度為40-60mg/ml，濃縮液的pH值為7. O 9. 0,10_15°C下平衡。
6.如權利要求1所述的滅活方法，其特征在于，步驟(2)添加添加滅活劑β-丙內酯的方法是先將β_丙內酯用滅菌水1:40倍稀釋，再以體積比1:100添加到濃縮病毒液中。
7.如權利要求1所述的滅活方法，其特征在于，步驟(2)攪拌條件為10 15°C下，155 180r/mino
8.如權利要求1所述的滅活方法，其特征在于，步驟(3)中在滅活劑添加后的第50 70min時，進行第I次滅活病毒液的轉移；病毒液轉移入另一容器后繼續(xù)攪拌，待添加滅活劑后的第600min 700min時，將滅活液轉移到無毒區(qū)的容器中繼續(xù)攪拌滅活至滅活劑添加后的第1400 1500min。
9.如權利要求1所述的滅活方法，其特征在于，步驟(3)的操作在10 15°C條件下進行。
10.如權利要求1所述的滅活方法，其特征在于，將步驟(3)獲得的滅活液于37°C進行水解 140 160min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人二倍體狂犬病疫苗病毒液的滅活方法，該方法包括以下步驟，即濃縮病毒液、添加滅活劑、病毒滅活液的轉移、水解去除滅活劑。本發(fā)明的滅活方法對人二倍體狂犬病疫苗病毒液的滅活效果好，加入滅活劑后10小時即可完全滅活，且對狂犬病病毒的抗原含量沒有負面影響。本發(fā)明提供的病毒液滅活方法操作步驟簡單、滅活時間短、成本低、無污染，適宜在疫苗制備領域大規(guī)模應用。
文檔編號C12N7/06GK103013933SQ20121054606
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權日2012年12月14日
發(fā)明者左靜, 高正倫, 劉海文, 方群, 季振濤, 鄭森遠, 張騫, 劉勇, 張芮銘, 代凡, 吳淞, 張雪, 戴會忠, 劉雅靜, 王云達, 樊鵬 申請人:北京民海生物科技有限公司