專利名稱：一種細(xì)菌通用pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)菌通用的PCR檢測方法，用于所有細(xì)菌的檢測。
背景技術(shù)：
疫苗等生物制品的生產(chǎn)需要遵從藥品產(chǎn)生質(zhì)量管理規(guī)范，并且在規(guī)范的質(zhì)量檢測體系經(jīng)過嚴(yán)格的檢測才能確保疫苗安全性和有效性，以求最大效率地提高接種后的效應(yīng)作用，最大限度地降低免疫接種后的不良反應(yīng)。微生物檢驗(yàn)是醫(yī)療器械、生物藥品等生產(chǎn)制造行業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要內(nèi)容，其內(nèi)容主要包括以培養(yǎng)方法檢測是否有細(xì)菌、支原體等微生物的污染；其中菌檢是微生物檢測的最基本也是最重要的組成部分，純菌實(shí)驗(yàn)檢測諸如減毒活菌苗自身菌體的活菌量、總菌量以及是否有其他雜菌的存在；以及以CHO細(xì)胞毒試驗(yàn)、HeLa細(xì)胞毒等試驗(yàn)檢測細(xì)菌毒素的活力等。傳統(tǒng)方法對檢測場所和檢測人員素質(zhì)要求較高，且培養(yǎng)基的配制、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的把握等繁瑣，且需時(shí)較長，不利于快速做出判斷。原核生物的r RNA含有3種類型23S、16S、5SrRNA，它們分別含有2，900、1540和120個(gè)核苷酸。16SrRNA為核糖體RNA的一個(gè)亞基，其編碼基因是16SrDNA ；16SrDNA長度適中信息量較大、易分析，且在有多個(gè)區(qū)段保守性，根據(jù)這些保守區(qū)可以設(shè)計(jì)出細(xì)菌通用物，可以擴(kuò)增出具有細(xì)菌高度特異性的片段，是生物的種屬鑒定和系統(tǒng)的重要分子基礎(chǔ)。以16SrDNA為目的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能精確的揭示微生物種類和遺傳的多樣性，從而16SrDNA序列分析成了微生物分類鑒定主要依據(jù)。隨著核酸測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的微生物的16SrDNA序列被測 定并收入國際基因數(shù)據(jù)庫中，16SrDNA序列分析技術(shù)在微生物分類鑒定及分子檢測中得到了廣 泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于傳統(tǒng)檢測方法的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)菌通用的PCR檢測方法，可快速鑒別不同細(xì)菌，敏感性、準(zhǔn)確性優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法，解決了特異性PCR逐個(gè)篩選鑒別病原的繁瑣性，克服了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法的限制，操作方便，檢測快速準(zhǔn)確且靈敏度聞。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
一種細(xì)菌通用的PCR檢測方法，包括以下步驟
I)樣品處理
無菌條件下從樣本中分離細(xì)菌，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板、血液瓊脂平板和麥康凱平板上，置恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)，獲得單菌落；單菌落用單菌落接種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)；收集菌液，在液氮和35-40°C下，分別反復(fù)凍融裂解細(xì)菌或超聲波破碎細(xì)菌，之后消化處理；2)核酸提取
將處理后的樣本，用總核酸試劑盒提取核酸，核酸提取后用分光光度計(jì)測核酸濃度；
3)PCR擴(kuò)增
設(shè)計(jì)引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2加入到PCR反應(yīng)體系中對細(xì)菌DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
4)PCR產(chǎn)物克隆、測序
PCR產(chǎn)物純化回收，使用分光光度計(jì)檢測核酸濃度，回收產(chǎn)物16°C過夜連接PMD-18T克隆載體進(jìn)行克??；隨機(jī)挑選克隆產(chǎn)物中的10個(gè)菌落，分別于AMP+LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 6小時(shí)，用上述引物SEQ ID ΝΟ:1和SEQ ID NO:2進(jìn)行PCR進(jìn)行鑒定，電泳觀測結(jié)果，PCR結(jié)果陽性的樣本菌液送測序公司進(jìn)行測序。步驟I)中恒溫培養(yǎng)箱的溫度為35_40°C，培養(yǎng)時(shí)間為18_24h。步驟I)中消化處理過程為Iml的細(xì)菌中分別加入5 μ I的RNase，及l(fā)OXBuffer，37°C消化1. 5小時(shí)后，80°C、5min終止消化。步驟3)中所述PCR反應(yīng)體系為細(xì)菌DNA模板1-10 μ1、10XPCR buffer5_20 μ1、dNTPs Mixture4-10 μ1、r TaqO. 25 μ I, ddH20 補(bǔ)足 50 μ I ;引物的加入量為 16SrDNAFl-μ l、16SrDNA Rl μ I。步驟3)中所述 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?96°C，預(yù)變性 2min ；96°C,30s ； 55。。，30s ；72°C,60s ；35個(gè)循環(huán)，72°C，10min，4°C保存；擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。步驟4)中克隆程序?yàn)閷⑦B接產(chǎn)物加入至100 μ I的DH5a感受態(tài)中，冰浴30min 后，于421水浴熱激908，置冰上3 51^11后，加入50(^1的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)Ih ；將培養(yǎng)液3000rpm離心3min，棄去400 μ I培養(yǎng)基，剩余培養(yǎng)基重新與離心細(xì)菌沉淀混合，混合液涂布于Amp-LB固體培基，充分吸收后，于37°C倒置培養(yǎng)12 16h。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的建立了一種細(xì)菌通用PCR檢測方法，可快速鑒別不同細(xì)菌，敏感性、準(zhǔn)確性優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法，解決了特異性PCR逐個(gè)篩選鑒別病原的繁瑣性；該方法可用于生產(chǎn)中疑似細(xì)菌污染產(chǎn)品及臨床病料樣本的快速檢測，有利于提高生產(chǎn)效率以及疾病的快速準(zhǔn)確診斷，本發(fā)明克服了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法的限制，操作方便，檢測快速準(zhǔn)確且靈敏度高，已廣泛應(yīng)用到菌種鑒定，群落對比分析等領(lǐng)域，是一種客觀和可信度較高的鑒別方法。結(jié)果表明本發(fā)明的PCR檢測方法具有良好的特異性和較高的敏感性，同時(shí)為細(xì)菌快速診斷試劑盒研發(fā)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。下面結(jié)合附圖及具體的實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為敏感性試驗(yàn)電泳圖；泳道1:陰性對照，泳道2 :細(xì)菌稀釋度10-8，泳道3 細(xì)菌稀釋度10-7，泳道4 :細(xì)菌稀釋度10-6，泳道5 :細(xì)菌稀釋度10-5，泳道6 :細(xì)菌稀釋度10-4，泳道7 :細(xì)菌稀釋度10-3 ;泳道8 :細(xì)菌稀釋度10-2 ;泳道9 :細(xì)菌稀釋度10_1 ;泳道10 :陽性對照；
圖2為特異性試驗(yàn)電泳圖⑷為DL 2000 MARK ;泳道I大腸桿菌；泳道2副豬嗜血桿菌；泳道3綠膿桿菌；泳道4巴氏桿菌；泳道5沙門氏菌；泳道6為陰性對照；圖3為大腸桿菌16S rDNA PCR檢測；M為DL 2000 MARK ;泳道I大腸桿菌；
圖4為未知樣品16S rDNA PCR結(jié)果；M DL2000 ；1, 2為檢測樣本；
圖5為未知樣品16S rDNA PCR測序結(jié)果BLAST ；
圖6為單菌落照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :細(xì)菌通用PCR方法敏感性試驗(yàn)
取大腸桿菌作已知檢測，溶解于PBS (pH值7. 4)緩沖液中，取500 μ L處理的菌液按1:10倍連續(xù)稀釋，之后按上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行DNA抽提、PCR及序列分析，確定該方法敏感性。I)實(shí)驗(yàn)材料
菌株DH5a菌株由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司生藥研發(fā)中心保存；
試劑麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂、Dunham氏蛋白胨水溶液、葡萄糖蛋白胨水溶液、LB均購自廣州齊云生物藥品有限公司；Π引哚(靛基質(zhì))試劑、Μ. R (甲基紅)試劑、VP試劑等常規(guī)生化試劑購自廣州建陽生物；微量生化發(fā)酵管購自杭州天和微生物試劑有限公司；Tris-HCl、EDTA、NaAc、乙醇、NaCl、LiCl等試劑購自鼎國生物藥品有限公司；DNA膠回收試劑盒為omega公司產(chǎn)品；常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；引物16SrDNA F : 5’ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGGGA-3’
16SrDNA R :5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACAG-3’
2)實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)菌分離、純化以及預(yù)處理取大腸桿菌作已知檢測，溶解在PBS(pH值7. 4)緩沖液中，取500mL處理的菌液按1:10倍連續(xù)稀釋；無菌操作從樣本中分離細(xì)菌，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板、血液瓊脂平板和麥康凱平板上，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18-24h，觀察單個(gè)菌落形態(tài)；挑取單菌落接種液體培養(yǎng)基，200rpm、37°C培養(yǎng)24h ;收集菌液，液氮或_80°C中，37°C反復(fù)凍融三次裂解細(xì)菌(超聲波破碎亦可)，Iml的菌液中分別加入5μ I的RNase，及10XBuffer，37°C消化1. 5小時(shí)后，80°C 5min終止消化；
細(xì)菌核酸提取將處理后的樣本，按常規(guī)方法提取核酸，核酸提取后用分光光度計(jì)測核酸濃度；
PCR擴(kuò)增:反應(yīng)體系(50 μ I ):10XPCR buffer 與 dNTPs Mixture 總量為 25 μ I，細(xì)菌DNA模板 10 μ 1，引物 16SrDNA F 與 16SrDNA R 各 Iul (10 μ M)，ddH20 補(bǔ)足 50 μ I 反應(yīng)體系；反應(yīng)條件96°C，預(yù)變性 2min，96°C，30s，55。。，30s，72。。，60s，35 個(gè)循環(huán)，72°C，lOmin。4°C保存，取5μ LPCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并觀測結(jié)果；
PCR產(chǎn)物克隆測序?qū)U(kuò)增結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物純化回收，回收試劑盒為TaKaRaDNA Fragment Purification Kit Ver. 2. O.并使用分光光度計(jì)測核酸濃度；回收產(chǎn)物連接于 PMD 18-T Vector，連接體系為 PMD 18-T Vector*l I μ I, insert DNA 0. 3pmol,Solution I 5μ 1，ddH20補(bǔ)足10μ 1，16°C過夜連接，連接產(chǎn)物加入至100μ I的DH5a感受態(tài)中，冰浴30min后，于42°C水浴熱激90s，置冰上3 5min后，加入500 μ I的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)lh，將培養(yǎng)液3000rpm離心3min，棄去200 μ I培養(yǎng)基。剩余培養(yǎng)基重新與離心細(xì)菌沉淀混合，混合液涂布于AIX LB固體培基，充分吸收后，于37°C倒置培養(yǎng)12 16h ；隨機(jī)挑選10個(gè)菌落，分別于AMP+LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 6小時(shí)，使用上述引物PCR進(jìn)行鑒定。電泳觀測結(jié)果，PCR結(jié)果陽性的樣本送測序公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過BLAST與GenBank公布的序列進(jìn)行比對分析；
3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
電泳結(jié)果用細(xì)菌通用PCR方法檢測取大腸桿菌作已知檢測，溶解在PBS (pH值7. 4)緩沖液中，取ImL處理的菌液按1: 10倍連續(xù)稀釋，敏感性試驗(yàn)表明，細(xì)菌通用PCR方法檢測大腸桿菌最聞稀釋度為10-6，如圖1不。測序結(jié)果測序結(jié)果為大腸桿菌基因序列，NCBI BLAST結(jié)果如圖1。本實(shí)施例中，以取大腸桿菌作已知檢測，進(jìn)行了細(xì)菌通用PCR方法的敏感性試驗(yàn)，細(xì)菌通用PCR方法檢測大腸桿菌最高稀釋度為10-8。表明該方法具有較高的敏感性。實(shí)施例2、細(xì)菌通用PCR方法特異性試驗(yàn) O實(shí)驗(yàn)材料
毒株、細(xì)胞特異性試驗(yàn)檢測細(xì)菌(如表I所示)毒株由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司生藥研發(fā)中心研發(fā)并保存。表I
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌通用的PCR檢測方法，其特征在于包括以下步驟 1)樣品處理 無菌條件下從樣本中分離細(xì)菌，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板、血液瓊脂平板和麥康凱平板上，置恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)，獲得單菌落；單菌落用單菌落接種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)；收集菌液，在液氮和35-40°C下，分別反復(fù)凍融裂解細(xì)菌或超聲波破碎細(xì)菌，之后消化處理； 2)核酸提取 將處理后的樣本，用總核酸試劑盒提取核酸，核酸提取后用分光光度計(jì)測核酸濃度； 3)PCR擴(kuò)增 設(shè)計(jì)引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2加入到PCR反應(yīng)體系中對細(xì)菌DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 4)PCR產(chǎn)物克隆、測序 PCR產(chǎn)物純化回收，使用分光光度計(jì)檢測核酸濃度，回收產(chǎn)物161過夜連接？1 -18丁克隆載體進(jìn)行克??；隨機(jī)挑選克隆產(chǎn)物中的10個(gè)菌落，分別于AMP+LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 6小時(shí)，用上述引物SEQ ID ΝΟ:1和SEQ ID NO:2進(jìn)行PCR進(jìn)行鑒定，電泳觀測結(jié)果，PCR結(jié)果陽性的樣本菌液送測序公司進(jìn)行測序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌通用的PCR檢測方法，其特征在于步驟I)中恒溫培養(yǎng)箱的溫度為35-40°C，培養(yǎng)時(shí)間為18-24h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌通用的PCR檢測方法，其特征在于步驟I)中消化處理過程為1ml的細(xì)菌中分別加入5μ l的RNase，及10XBuffer，37°C消化1. 5小時(shí)后，80°C、5min終止消化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌通用的PCR檢測方法，其特征在于步驟3)中所述PCR反應(yīng)體系為細(xì)菌 DNA 模板 l-10μ 1U0XPCR buffer5_20 μ1、dNTPs Mixture4_10 μ1、rTaqO. 25μ1、ddH20 補(bǔ)足 50μl ;引物的加入量為 16SrDNA Fl-μ1、16SrDNA Rl μ l。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌通用的PCR檢測方法，其特征在于步驟3)中PCR擴(kuò)增程序?yàn)?96°C，預(yù)變性 2min ；96°C,30s ； 55。。，30s ；72°C,60s ;35 個(gè)循環(huán)，72°C，lOmin，4°C保存；擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌通用的PCR檢測方法，其特征在于步驟4)中克隆程序?yàn)閷⑦B接產(chǎn)物加入至100 μ I的DH5a感受態(tài)中，冰浴30min后，于42°C水浴熱激90s，置冰上3 511^11后，加入50(^1的LB培養(yǎng)基，37 °C振蕩培養(yǎng)Ih ;將培養(yǎng)液3000rpm離心3min，棄去400 μ I培養(yǎng)基，剩余培養(yǎng)基重新與離心細(xì)菌沉淀混合，混合液涂布于Amp-LB固體培基，充分吸收后，于37°C倒置培養(yǎng)12 16h。
全文摘要
本發(fā)明公開一種細(xì)菌通用的PCR檢測方法，包括樣品處理、核酸提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物克隆、測序等步驟，本發(fā)明的建立的細(xì)菌通用PCR檢測方法，可快速鑒別不同細(xì)菌，敏感性、準(zhǔn)確性優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法，解決了特異性PCR逐個(gè)篩選鑒別病原的繁瑣性；該方法可用于生產(chǎn)中疑似細(xì)菌污染產(chǎn)品及臨床病料樣本的快速檢測，有利于提高生產(chǎn)效率以及疾病的快速準(zhǔn)確診斷，本發(fā)明克服了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法的限制，操作方便，檢測快速準(zhǔn)確且靈敏度高，已廣泛應(yīng)用到菌種鑒定，群落對比分析等領(lǐng)域，是一種客觀和可信度較高的鑒別方法。結(jié)果表明本發(fā)明的PCR檢測方法具有良好的特異性和較高的敏感性，同時(shí)為細(xì)菌快速診斷試劑盒研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK103060440SQ20121053695
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者任常寶, 邵定勇, 陳瑞愛, 黃紅亮, 謝小雨, 唐兆新 申請人:肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司, 廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司