專利名稱：一種制備熱啟動Taq酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Taq酶的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種制備熱啟動Taq酶的方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈鎖反應(yīng)，Polymerase chain reaction,簡稱PCR,是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于擴增特定的DNA片段，這種方法可在生物體外進行，不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。PCR這項技術(shù)，被廣泛地運用在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的實驗室，例如用于判斷檢體中是否會表現(xiàn)某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、基因復(fù)制，以及親子鑒定。PCR用于擴增一小段已知的DNA片斷，可能是單個基因，或者僅僅是某個基因的一部分。與活體生物不同的是，PCR只能復(fù)制很短的DNA片斷，通常不超過lOkbp。目前應(yīng)用的PCR反應(yīng)需要幾個基本組成DNA模板(template)，含有需要擴增的DNA片斷； 2個引物(primer),決定了需要擴增的起始和終止位置；DNA聚合酶(polymerase),復(fù)制需要擴增的區(qū)域；脫氧核苷三磷酸(dNTP)，用于構(gòu)造新的互補鏈；緩沖體系，提供適合聚合酶行使功能的化學(xué)環(huán)境。PCR反應(yīng)在熱循環(huán)設(shè)備中進行，PCR儀可以將反應(yīng)管加熱或冷卻到每步反應(yīng)所需的精確的溫度。一般的PCR反應(yīng)由20到40個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟1.利用高溫(93-98°C )使雙鏈DNA分離(熔解)。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物完全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間為3分鐘。2. 在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上(降溫或稱接合)，需30秒。

3. 最后，DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈(延長)。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片斷長度。延長速度為I分鐘/kb。PCR反應(yīng)所必需的DNA聚合酶目前廣泛采用嗜熱細(xì)菌水生棲熱菌(Thermusaquaticus,Taq )體內(nèi)產(chǎn)生的具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，因此被稱為Taq酶。其作用是通過構(gòu)建磷酸二酯鍵將脫氧核苷酸聚合形成脫氧核苷酸鏈，從而形成雙鏈DNA分子。被廣泛用于當(dāng)前的PCR操作中，Taq酶的缺點是它缺少3’到5’校正外切酶活性，因此在復(fù)制DNA時有時會出錯，造成DNA序列突變(錯誤)。為了避免操作過程中產(chǎn)生非特異性序列的擴增，人們對PCR技術(shù)進行了改良，發(fā)明了熱啟動聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hot start PCR)。該技術(shù)將DNA聚合酶與其他反應(yīng)物隔絕,或是使用在高熱狀況下才會活化的聚合酶(熱啟動Taq酶)，該酶在90°C以上才能發(fā)揮很好的催化效果，以避免在未達到設(shè)定溫度前就開始反應(yīng)。熱啟動PCR有以下幾種方式
蠟隔絕法將除了聚合酶以外的反應(yīng)物加入PCR管后，加滴熔融的石蠟；待石蠟?zāi)毯笤偌尤刖酆厦?。放入PCR儀開始反應(yīng)升溫后，石蠟融化浮至最頂層，聚合酶才與其他反應(yīng)物混合。石蠟可同時作為防止蒸發(fā)用。
熱啟動聚合酶(化學(xué)型)經(jīng)過甲醛等化學(xué)分子修飾的聚合酶，高熱下結(jié)構(gòu)改變而啟動。熱啟動聚合酶(抗體)帶有針對聚合酶的免疫抗體，高熱下使抗體分離而啟動。熱啟動聚合酶(共價鍵結(jié)合)改良自抗體型，使用小分子的化合物，阻塞聚合酶作用位置，高溫下分離。以上目前普遍使用的方法只能在第I步PCR反應(yīng)時作到熱啟動，后續(xù)步驟仍難以避免非特異性序列的擴增的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種不僅可以在PCR反應(yīng)的第一步做到熱啟動，在PCR反應(yīng)的后續(xù)步驟中同樣可以實現(xiàn)熱啟動的熱啟動Taq酶的制備方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種制備熱啟動Taq酶的方法，將Taq酶與處理溶液混合，即得熱啟動Taq酶；
所述的處理溶液為肝素溶液、肝素鈉溶液或肝素鉀溶液。所述的Taq酶與處理溶液混合液中肝素、肝素鈉或肝素鉀的濃度為O. 0001U/ml以上。將肝素、肝素鈉或肝素鉀溶于去離子水至溶液終濃度為O. 0001U/ml以上，將Taq酶加入該溶液中；將反應(yīng)產(chǎn)物采用透析、過柱或超濾方法純化，即得熱啟動Taq酶。在PCR反應(yīng)液中加入肝素、肝素鈉或肝素鉀，使肝素、肝素鈉或肝素鉀的終濃度為0. 0001U/ml 以上。 本發(fā)明具有以下優(yōu)點本發(fā)明實現(xiàn)了在PCR反應(yīng)中，不僅可以在PCR反應(yīng)的第一步做到熱啟動，在PCR反應(yīng)的后續(xù)步驟中同樣可以實現(xiàn)熱啟動，從而有效的避免了非特異性序列的擴增的發(fā)生，提高了 DNA聚合酶的反應(yīng)特異性、可靠性、均一性和靈敏度，相比現(xiàn)有同類產(chǎn)品PCR反應(yīng)可減少5 10個循環(huán)即可獲得特異性擴增條帶，提高了擴增效率，在較低循環(huán)數(shù)就能從微量、痕量樣本中檢測、克隆到目的基因，可以很大程度上減少人為誤差，適用于常規(guī)PCR反應(yīng)、復(fù)雜模板、痕跡模板的擴增和檢測。


圖1為本發(fā)明實施例3的擴增結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述，本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述
實施例1:
一種制備熱啟動Taq酶的方法，將Taq酶與處理溶液混合，即得熱啟動Taq酶。所述的處理溶液為肝素溶液、肝素鈉溶液或肝素鉀溶液，所述的Taq酶與處理溶液混合液中肝素、肝素鈉或肝素鉀的濃度為0. 0001U/ml以上。其具體操作方法為
將肝素、肝素鈉或肝素鉀溶于去離子水至溶液終濃度為0. 0001U/ml以上，將Taq酶加入該溶液中。將反應(yīng)產(chǎn)物采用透析、過柱或超濾方法純化，即得熱啟動Taq酶。實施例2
一種制備熱啟動Taq酶的方法，將Taq酶與處理溶液混合，即得熱啟動Taq酶。所述的處理溶液為肝素溶液、肝素鈉溶液或肝素鉀溶液，所述的Taq酶與處理溶液混合液中肝素、肝素鈉或肝素鉀的濃度為O. 0001U/ml以上。其具體操作方法為
在PCR反應(yīng)液中加入肝素、肝素鈉或肝素鉀，使肝素、肝素鈉或肝素鉀的終濃度為O. 0001U/ml以上，PCR反應(yīng)液中的Taq酶與肝素、肝素鈉或肝素鉀溶液混合后，即得熱啟動Taq 酶。實施例3
將本發(fā)明的熱啟動Taq酶應(yīng)用于PCR，以Foregene PCR Easy為例，以模板2. 5ul(2. 5ng), 2XPCR Easy Mix 25ul, IOuM Primer I Iul, IOuM Primer 2 lul,補 ddH20 至50ul，按如下反應(yīng)條件反應(yīng)94°C 3min熱變性，94°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，共25 40個循環(huán)，最后72°C保5min。同時以未處理過的DNA聚合酶(5U/ul)做平行對照。結(jié)束PCR反應(yīng)后，取反應(yīng)產(chǎn)物5ul，瓊脂凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1，從圖1可知，采用熱啟動耐高溫DNA聚合酶擴增強度明顯增加。圖中，1、2、3 :普通Taq酶擴增，la、2a、3a:熱啟動 Taq 酶擴增，M :1OObp-1KB Marker,1-1a :ZmIVR(225bp)，2_2a :BnPEP (248bp)，3_3a D-1gl。
權(quán)利要求
1.一種制備熱啟動Taq酶的方法，其特征在于將Taq酶與處理溶液混合，即得熱啟動Taq 酶； 所述的處理溶液為肝素溶液、肝素鈉溶液或肝素鉀溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備熱啟動Taq酶的方法，其特征在于所述的Taq酶與處理溶液混合液中肝素、肝素鈉或肝素鉀的濃度為O. 0001U/ml以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備熱啟動Taq酶的方法，其特征在于將肝素、肝素鈉或肝素鉀溶于去離子水至溶液終濃度為O. 0001U/ml以上，將Taq酶加入該溶液中；將反應(yīng)產(chǎn)物采用透析、過柱或超濾方法純化，即得熱啟動Taq酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備熱啟動Taq酶的方法，其特征在于在PCR反應(yīng)液中加入肝素、肝素鈉或肝素鉀，使肝素、肝素鈉或肝素鉀的終濃度為O. 0001U/ml以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備熱啟動Taq酶的方法，將Taq酶與處理溶液混合，即得熱啟動Taq酶；所述的處理溶液為肝素溶液、肝素鈉溶液或肝素鉀溶液。本發(fā)明的有益效果是實現(xiàn)了在PCR反應(yīng)中，不僅可以在PCR反應(yīng)的第一步做到熱啟動，在PCR反應(yīng)的后續(xù)步驟中同樣可以實現(xiàn)熱啟動，從而有效的避免了非特異性序列的擴增的發(fā)生，提高了DNA聚合酶的反應(yīng)特異性、可靠性、均一性和靈敏度，相比現(xiàn)有同類產(chǎn)品，提高了擴增效率，在較低循環(huán)數(shù)就能從微量、痕量樣本中檢測、克隆到目的基因，可以很大程度上減少人為誤差，適用于常規(guī)PCR反應(yīng)、復(fù)雜模板、痕跡模板的擴增和檢測。
文檔編號C12N9/12GK103045554SQ20121049784
公開日2013年4月17日 申請日期2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月29日
發(fā)明者鄒利平, 童玉成 申請人:成都福際生物技術(shù)有限公司