專利名稱：一種三角帆蚌的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體基因、蛋白及其抗體的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(SolubleTNF-related apoptosis-inducing ligand, sTRAIL)基因、蛋白及其抗體的制備，屬于生物技術領域。
背景技術：
腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducingligand, TRAIL)，又稱為凋亡素 2 配體(AP02 ligand, AP0-2L) (Wiley et al. , 1995 ；Pittiet al.，1996)，其胞外結構域在金屬蛋白酶的作用下，可降解形成可溶性的細胞因子sTRAILCSoluble TRAIL )，TRAIL 具有 TRAIL 的生物學功能(Bodmer et al.，2000)。TRAIL 是TNF超家族中一類重要的跨膜細胞因子(Wiley et al. , 1995 ；Pitti et al.，1996)，可選擇性地引起人類大多數(shù)腫瘤細胞發(fā)生細胞凋亡包括腦、腎、肝、肺、胃、結腸、乳腺、前列腺、胰腺、膽管、宮頸、皮膚和造血系統(tǒng)來源的腫瘤細胞，而對正常細胞無或僅具有極低的毒性(Dphil，2007;馬遠方，2007)，以TRAIL為靶點的分子治療已成為肺癌等癌癥治療的新熱點。我國是水產(chǎn)大國，三角帆蛘等貝類養(yǎng)殖是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。三角帆蛘不僅肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)價值高，還具有抗癌降血脂等功效。目前國內(nèi)外通過提取三角帆蛘等貝類體內(nèi)的多糖等生物活性物質(zhì)，并開發(fā)出了保健食品。但以上多為多糖等物質(zhì)的混合物，是免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)品，并且基礎研究資料少，對腫瘤細胞的毒性作用較低，對其功效及副作用等所知不多。因此利用基因工程技術開發(fā)三角帆蛘中sTRAIL蛋白抗體產(chǎn)品，有助于新型抗腫瘤藥物的研制與開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(Soluble TNF-related apoptosis-inducing ligand, sTRAIL)基因、蛋白及其抗體的制備，設計了擴增三角帆蛘中sTRAIL編碼序列的寡聚核苷酸引物，獲得了三角帆蛘sTRAIL基因編碼框全序列，并通過構建原核表達載體,表達并純化了可溶性的sTRAIL蛋白質(zhì)產(chǎn)品，并制備了其多克隆兔抗血清。為了達成上述目的，本發(fā)明的解決方案是
一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體基因，具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列?！N三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白質(zhì)，具有SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列?！N三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的抗體的制備方法，包括如下步驟
1)以三角帆蛘血淋巴細胞的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴增sTRAIL蛋白基因的寡聚核苷酸引物，所述的引物具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列的，利用PCR技術獲得具有SEQ ID NO. I所示的sTRAIL的基因編碼框核苷酸序列；
2)利用DNA重組技術將sTRAIL基因編碼框的序列片段克隆到合適的pMD19_T載體(Takara公司，日本)中，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET_28 (a)原核表達載體(Novagen公司，美國)連接，利用PCR法篩選陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得編碼框正確的重組表達載體 pET-28a (+) -sTRAIL ；
3)將陽性重組質(zhì)粒pET-28(a)_ sTRAIL轉(zhuǎn)化到表達宿主菌萬.coli Rossetta (DE3)(天根公司，中國)，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG) (Sigma公司，美國)誘導表達，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行檢測；
4)將陽性表達菌液擴大培養(yǎng)，利用蛋白質(zhì)純化試劑盒(Merck公司，德國)分離純化重組蛋白質(zhì)，制得的重組蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO. 2所不的氣基酸序列；
5)用純化得到sTRAIL重組蛋白免疫新西蘭大白兔，經(jīng)過一次初始免疫和三次加強免疫后，頸動脈取血，分離血清，獲得sTRAIL多克隆兔抗血清。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明設計了擴增三角帆蛘中sTRAIL編碼序列的寡聚核苷酸引物，獲得了三角帆蛘sTRAIL基因編碼框全序列，并通過構建原核表達載體,表達并純化了可溶性的sTRAIL蛋白質(zhì)產(chǎn)品，并制備了其多克隆兔抗血清，有助于新型抗腫瘤藥物的研制與開發(fā)。
具體實施例方式實施例I
本實施例的一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體基因，具有SEQ IDNO. I所示的核苷酸序列。一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白質(zhì)，具有SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列。一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的抗體的制備方法，包括如下步驟
I、PCR擴增剪取三角帆蛘的外套膜組織，用液氮研磨后，用TRIzoI (上海生工，加拿大)法提取三角帆蛘的的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工，加拿大)進行反轉(zhuǎn)錄，獲得三角帆蛘的cDNA。以該cDNA為模板，設計擴增sTRAIL蛋白基因的引物，所述的引物具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，將設計好擴增sTRAIL蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作為目的片段進行擴增，進行嵌套聚合酶鏈式PCR反應，PCR擴增反應的參數(shù)為94°C預變性5min ;35個循環(huán)94°C 45sec, 58°C 45sec, 72°C 55 sec ;72°C 10 min ;獲得具有SEQ IDNO. I所示的sTRAIL的基因編碼框核苷酸序列。2.重組表達載體pET-28a(+)_sTRAIL的構建將PCR擴增得到的PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體(Takara公司，日本)相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(天根生物，德國)，涂布含氨芐青霉素的LB (上海生工，加拿大)篩選平板，挑取幾個單克隆進行酶切和PCR鑒定；取一陽性克隆擴大培養(yǎng)，以堿裂解法抽提質(zhì)粒，將純化后的質(zhì)粒以及和ZAoI限制性內(nèi)切酶(上海生工，加拿大)雙酶切，再插入經(jīng)過同樣雙酶切的pET-28a(+)載體(Novagen公司，美國)的相應位點上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21 (DE3) (Novagen，美國)。利用PCR法篩選陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得編碼框正確的重組表達載體pET-28a (+)-sTRAIL。3.重組蛋白的表達與鑒定將陽性重組質(zhì)粒pET_28a(+)-sTRAIL轉(zhuǎn)化表達宿主菌萬.coli Rossetta (DE3 )(天根公司，中國)感受態(tài)，涂布含卡那霉素的LB(上海生工，加拿大)平板，37°C倒置培養(yǎng)過夜。挑取一個單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LB-Kan培養(yǎng)液(上海生工，加拿大)，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。取適量菌液，按1:100的比例擴大培養(yǎng)至OD6c 為O. 4-0.5時，將菌液分為若干等份，不加或分別加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG(Sigma公司，美國)誘導表達，使其終濃度在0-1. O mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)6小時，離心收集細菌。細菌經(jīng)超聲波裂解后(300W，20分鐘，超聲2秒鐘，間隔2秒鐘)，離心分離上清液和沉淀，分別上樣，進行SDS-PAGE電泳(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定目的蛋白。4、重組蛋白質(zhì)的純化將步驟3)中重組蛋白的表達為陽性的表達菌液擴大培養(yǎng)， 按上述方法進行超聲處理后，將破碎過的菌液過Ni-NTA親和層析柱(Novagen公司，美國)，sTRAIL重組蛋白結合在柱上,其它蛋白不能結合而流失；再利用蛋白試劑盒(Merck公司，德國)中提供的洗脫液，將sTRAIL蛋白洗脫下來，即得所需純化的重組蛋白；采用12%的SDS-PAGE進行電泳鑒定；制得的重組蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。5、蛋白質(zhì)定量將純化鑒定過的蛋白質(zhì)按Brad-ford法進行定量(Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976，72:248-254)o6、sTRAIL多克隆兔抗血清的制備將純化蛋白質(zhì)定量后，取適量蛋白，挑選2只體重約2 kg的健康新西蘭大白兔(雄兔)，進行多克隆抗體制備。用純化所得的pET-28a(+)-sTRAIL為抗原加入等體積的佐劑充分乳化后免疫兔子，采用多點背部皮下注射，共免疫四次。(I)免疫前，從耳靜脈處收集3_5ml正常血清作為抗體檢測時的陰性對照。(2)用剪刀剪去兔子背部部分兔毛，酒精消毒后進行背部皮下多點注射。(3)初次免疫取約I mg抗原，加入等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后注射，背部選取8-10個點，每個點注射約0. I ml ;
(4)第二次免疫間隔14天后進行，抗原量為0.5mg，加入等體積弗氏不完全佐劑充分乳化后注射，方法同上；
(5)第三、四次免疫間隔7天后按同樣方法，進行第四次免疫后，從耳靜脈采血Iml分離血清，用雙相瓊脂擴散法進行免疫血清的抗體效價檢測，效價應達到1:16以上才能放血；
(6)血清分離第四次免疫后第4天，待抗體效價達到要求后，進行頸動脈采血并分離血清。分裝后，保存于_80°C。7、抗體效價檢測免疫后的兔抗血清用ELISA方法檢測1:5000稀釋的多克隆兔抗血清的效價，具體操作步驟如下
(I)包被與封閉用包被液將蛋白稀釋至1-10 μ g/ml ;在每個聚苯乙烯酶標板的反應孔中加入O. I ml，4°C過夜；棄去孔內(nèi)溶液，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗3次，每次
5min。 (2)加樣加入用PBST稀釋指定倍數(shù)的待檢抗血清于O. I ml于上述已包被的反應孔中，37°C孵育I h ；PBST洗3次，每次5 min (同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
(3)加酶標抗體于各反應孔中，加入O. Iml新鮮稀釋的酶標抗體，37°C孵育I h，PBST洗3次，每次5 min。 (4)顯色于各反應孔中加入新鮮配制的O. I ml OPD底物溶液，37°C，顯色15-30分鐘。 (5)反應終止于各反應孔中分別加入O. 05 ml反應終止液(2 M)。 (6)數(shù)據(jù)測定與計算用酶標儀于490 nm處測各孔的OD值，大于規(guī)定的陰性對照OD值的2. I倍，即為陽性?？贵w效價計算公式為樣本OD值-空白對照OD值)/(陰性對照OD值-空白對照OD值。通過本實施例設計了擴增三角帆蛘中sTRAIL編碼序列的寡聚核苷酸引物，獲得了三角帆蛘sTRAIL基因編碼框全序列，并通過構建原核表達載體，表達并純化了可溶性的sTRAIL蛋白質(zhì)產(chǎn)品，并制備了其多克隆兔抗血清，有助于新型抗腫瘤藥物的研制與開發(fā)。SEQ ID NO. IATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTG
TCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCAGAGCAACTTGCACTCGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAACGCAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCCTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTAASEQ ID NO. 2
MVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFQSNLHSRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENAKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFSEQ ID NO. 3
sTRAILf :5’ 一 GAATGTTCAGAGCCTATTCC —3’
Adaptorp :5’ 一 CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC C TTTTTTTTTTTTTTT—3’
權利要求
1.一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體基因，其特征在于具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。
2.一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白質(zhì)，其特征在于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.—種如權利要求I所述的三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的抗體的制備方法，其特征在于包括如下步驟 1)以三角帆蛘血淋巴細胞的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴增sTRAIL蛋白基因的寡聚核苷酸引物，所述的引物具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列的，利用PCR技術獲得具有SEQ ID NO. I所示的sTRAIL的基因編碼框核苷酸序列； 2)利用DNA重組技術將sTRAIL基因編碼框的序列片段克隆到合適的pMD19_T載體中，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-28 (a)原核表達載體連接，利用PCR法篩選陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得編碼框正確的重組表達載體pET-28a(+)-sTRAIL ； 3)將陽性重組質(zhì)粒pET-28(a)_ sTRAIL轉(zhuǎn)化到表達宿主菌疋coli RossettaiM ,)，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行檢測； 4)將陽性表達菌液擴大培養(yǎng)，利用蛋白質(zhì)純化試劑盒分離純化重組蛋白質(zhì)，制得的重組蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO. 2所不的氣基酸序列； 5)用純化得到sTRAIL重組蛋白免疫新西蘭大白兔，經(jīng)過一次初始免疫和三次加強免疫后，頸動脈取血，分離血清，獲得sTRAIL多克隆兔抗血清。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三角帆蚌的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體基因，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；一種三角帆蚌的可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白質(zhì)，具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；及其抗體的制備。通過本發(fā)明得到三角帆蚌sTRAIL蛋白抗體產(chǎn)品，有助于新型抗腫瘤藥物的研制與開發(fā)。
文檔編號C12N15/28GK102965379SQ201210480470
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權日2012年11月23日
發(fā)明者楊受保 申請人:紹興文理學院