專利名稱：預(yù)測銀屑病關(guān)節(jié)炎患者對抗TNFα抗體的臨床反應(yīng)的血清標記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用血清生物標記物來預(yù)測經(jīng)診斷患有銀屑病關(guān)節(jié)炎的患者對用抗腫瘤壞死因子α (TNFa)生物治療劑治療的反應(yīng)的方法和過程。
背景技術(shù)：
用生物療法如戈利木單抗(人的抗人TNFa單克隆抗體)治療銀屑病關(guān)節(jié)炎 (PsA)患者，面臨著許多挑戰(zhàn)。治療和臨床研究設(shè)計的有效性，受到對于在戈利木單抗治療后會反應(yīng)的PsA患者以及哪些PsA患者會喪失反應(yīng)的預(yù)測能力的影響。替代標記物或生物標記物可用于應(yīng)對這些問題。生物標記物定義為“被作為正常生物過程、致病過程、或?qū)χ委熜愿深A(yù)的藥理反應(yīng)的指示物客觀測量與評價的特征”。生物標記物工作組(Biomarker Working Group), 2001. Clin. Pharm. and Therap. 69 :89_95。最近，生物標記物已被進一步定義為這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)中表達的改變可以與疾病或進展的風險增加相關(guān)，或者所述蛋白質(zhì)可以預(yù)測對給定治療的反應(yīng)。通過添加抗TNF α抗或生物制劑至體外或體內(nèi)系統(tǒng)來中和TNF α，能夠改變炎性細胞因子和許多其他血清蛋白以及非蛋白組分的表達。添加至培養(yǎng)的滑膜成纖維細胞的抗 TNFa 抗體減少細胞因子 IL-I、IL-6、IL-8 和 GM-CSF 的表達(Feldmann & Maini (2001) Annu Rev Immunol 19:163-196)。用英夫利昔單抗治療的類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者具有降低的TNFR1、TNFR2、IL-IR拮抗劑、IL-6、血清淀粉樣蛋白A、結(jié)合珠蛋白和纖維蛋白原的血清水平(Charles 1999 J Immunol 163 :1521-1528) 其他研究表明，用英夫利昔單抗治療的RA患者具有降低的可溶性(s) ICAM-3和sP選擇素的血清水平(Gonzalez-Gay，2006 Clin Exp Rheumatol 24 :373-379)，以及細胞因子 IL-18 水平的降低(Pittoni, 2002 Ann Rheum Dis 61:723-725 ；van Oosterhout,2005 Ann Rheum Dis 64 :537-543)。在患有各種免疫介導(dǎo)的炎性疾病的患者中觀察到升高水平的C反應(yīng)蛋白(CRP)。 這些觀察結(jié)果表明CRP可能具有作為抗TNF α治療的標記物的潛在價值。M Clair, 2004 Arthritis Rheum 50 :3432-3443顯示，英夫利昔單抗在早期RA患者中使CRP恢復(fù)到正常水平。在難治性銀屑病關(guān)節(jié)炎(refractory psoriatic arthritis) (Feletar, 2004 Ann Rheum Dis 63 :156-161)中，用英夫利昔單抗治療也使CRP恢復(fù)到正常水平。還顯示CRP水平與僅用甲氨蝶呤治療的早期RA患者的關(guān)節(jié)損傷進展相關(guān)(Smolen，2006 Arthritis Rheum 54 702-710)。將英夫利昔單抗治療加入甲氨蝶呤治療時，則CRP水平不再與關(guān)節(jié)損傷的進展相關(guān)。Strunk證明，RA患者的英夫利昔單抗治療減少了炎癥相關(guān)細胞因子如IL_6以及血管生成相關(guān)細胞因子如VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)的表達Q006 Rheumatol Int. 26 252-256)。Ulfgren(2000 Arthritis Rheum 43 :2391-2396)表明，英夫利昔單抗治療在治療兩周內(nèi)降低了滑膜中TNF、IL1和IL-I β的合成。MastroiannU2005 Br J Dermatol 153 :531-536)表明，VEGF、FGF和MMP-2的減少與英夫利昔單抗治療后銀屑病面積和嚴重程度的顯著改善相關(guān)。Visvanathan(Ann Rheum Dis 2008,67 :511-517 ；)表明，英夫利昔單抗治療降低了 PsA患者的血清中IL-6、VEGF和CRP的水平，并且這些降低反映改善的疾病活動度量。最近還查驗了在T細胞介導(dǎo)的炎癥過程中具有確定作用的脂肪細胞因子、瘦素和脂連蛋白與RA和對抗TNF療法的反應(yīng)的關(guān)系(Popa等人.2009，J. Rheumatol. 35 :274-30)。治療前血清標記物濃度也與對抗TNFa治療的反應(yīng)相關(guān)。發(fā)現(xiàn)了 IL_2R的低基線血清水平與難治性RA患者對英夫利昔單抗的臨床反應(yīng)相關(guān)(Kuuliala 2006)。 Visvanathan(2007a)表明，用英夫利昔單抗加MTX治療RA患者引起多種炎癥相關(guān)標記物 (包括MMP-3)減少。研究數(shù)據(jù)表明，MMP-3的基線水平與治療1年后臨床改善的程度顯著相關(guān)。已經(jīng)特別針對銀屑病關(guān)節(jié)炎查驗了少數(shù)標記物。例如，F(xiàn)inH2007 Clin Experiment Rheum 25 =305-308)比較了活動性或非活動性PsA患者和健康對照組中的 VEGF，指出與其他兩組相比，VEGF的水平在患有活動性疾病的患者中顯著較高，并且與患者的臨床監(jiān)測評分如VAS和PASI相關(guān)。因此，盡管已經(jīng)顯示炎癥和全身性疾病的多種血清蛋白標記物和非蛋白標記物在抗TNF α治療期間被改變，然而迄今未找到預(yù)測對于受到這樣治療的全部炎性疾病或?qū)τ谔囟膊?如銀屑病關(guān)節(jié)炎)有反應(yīng)或無反應(yīng)的獨特的標記物組和預(yù)測算法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及使用多種生物標記物來預(yù)測患者對抗TNF α療法治療的反應(yīng)，并且更具體地涉及使用多種生物標記物來確定患者是否會對治療反應(yīng)。此外，本發(fā)明可以用來確定患者是否已經(jīng)對治療反應(yīng)，并且該反應(yīng)是否會持續(xù)。在一個方面，本發(fā)明包括多組分篩選法的用途，所述多組分篩選法使用患者血清樣品來預(yù)測PsA患者對用TNF α中和單克隆抗體治療有反應(yīng)以及無反應(yīng)。在一個實施例中，使用在數(shù)據(jù)集中識別的已經(jīng)與實際臨床反應(yīng)評估結(jié)果相關(guān)的特定標記物組來預(yù)測用抗TNF α療法治療前所測試的PsA患者的臨床反應(yīng)，其中所述數(shù)據(jù)集來自抗TNFa療法開始之前的PsA患者。在一個特定實施例中，所述標記物組是選自脂連蛋白、MDC、PAP、SGOT, VEGF、脂蛋白、A和β -2-微球蛋白的兩種或更多種標記物。在另一個實施例中，使用在數(shù)據(jù)集中識別的已經(jīng)與實際臨床反應(yīng)評估結(jié)果相關(guān)的特定標記物組來預(yù)測用抗TNFa療法治療前所測試的PsA患者的臨床反應(yīng)，其中所述數(shù)據(jù)集來自抗TNFa療法開始之前和之后的PsA患者。在一個特定實施例中，所述標記物組是選自脂連蛋白、MDC、PAP、SGOT, VEGF、脂蛋白A和β -2-微球蛋白的兩種或更多種標記物。本發(fā)明還提供了用于預(yù)測PsA患者對抗TM^a療法的反應(yīng)的基于計算機的系統(tǒng)，其中所述計算機使用來自患者數(shù)據(jù)集的值來與預(yù)測算法例如決策樹進行比較，其中所述數(shù)據(jù)集包括選自脂連蛋白、MDC、PAP、SGOT、VEGF、脂蛋白A和β _2_微球蛋白的一種或多種標記物的血清濃度。在一個實施例中，所述基于計算機的系統(tǒng)是用于處理患者數(shù)據(jù)集并且產(chǎn)生輸出的受訓神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，其中所述數(shù)據(jù)集包括選自脂連蛋白、MDC、PAP、SGOT、VEGF、脂蛋白A 和β-2-微球蛋白的一種或多種血清標記物濃度。本發(fā)明還提供了能夠處理和檢測從PsA患者獲得的標本或樣品中的血清標記物的裝置，其中所述血清標記物濃度選自脂連蛋白、MDC、PAP、SGOT、VEGF、脂蛋白A和β -2-微球蛋白。在一個實施例中，所述裝置將通過檢測脂連蛋白、MDC、PAP、SGOT、VEGF、脂蛋白A 和β-2-微球蛋白中的一者所產(chǎn)生的信息在用于預(yù)測對抗TNFa療法有反應(yīng)或無反應(yīng)的算法中進行比較。本發(fā)明還提供套盒，所述套盒包括能夠處理和/或檢測從I^sA患者獲得的標本或樣品中的血清標記物的裝置，其中所述血清標記物濃度選自脂連蛋白、MDC、PAP、SG0T、 VEGF、脂蛋白A和β -2-微球蛋白，從而經(jīng)處理和/或檢測的血清標記物水平可以與用于預(yù)測對抗TNF α療法有反應(yīng)或無反應(yīng)的算法進行比較。


圖1-2是以決策樹形式示出的PsA反應(yīng)預(yù)測模型，所述決策樹基于血清標記物的使用并且與ACRS20所評價的患者臨床反應(yīng)相關(guān)。無反應(yīng)者或“否”節(jié)點意指該節(jié)點中的受試者由該模型預(yù)測為無反應(yīng)者，而“是”節(jié)點意指該節(jié)點中的受試者由該模型預(yù)測為反應(yīng)者。在該節(jié)點內(nèi)，由符號“/”隔開顯示該節(jié)點中實際無反應(yīng)者的數(shù)量和實際反應(yīng)者的數(shù)量。圖1是由基線(第0周)標記物數(shù)據(jù)建立的預(yù)測模型，在第14周使用ACR20從接受戈利木單抗的研究患者通過多重方法分析所述基線標記物數(shù)據(jù)，其中無反應(yīng)者的初始分類器基于VEGF(臨界值< 8. 08，對數(shù)標度)，并且反應(yīng)者的第二分類器基于VEGF(臨界值 >=8. 08，對數(shù)標度)、PAP(臨界值> =-2.四，對數(shù)標度)，以及作為脂連蛋白的第三分類器(臨界值>=1.35，對數(shù)標度)?；赩EGF (臨界值>=8. 08，對數(shù)標度)和PAP小于
<"2. 29或VEGF(臨界值>于>=8. 08，對數(shù)標度)、PAP >= -2. 29和脂連蛋白(臨界值
<1.35，對數(shù)標度)，一患者也被預(yù)測為無反應(yīng)者。圖2是由基線(第0周)至第4周的標記物水平數(shù)據(jù)變化和在第14周ACR20的變化建立的預(yù)測模型，從接受戈利木單抗的研究患者通過多重方法分析所述基線標記物數(shù)據(jù)，其中初始反應(yīng)者標準是MDC的變化(臨界值>大于>等于-0.12，對數(shù)標度)并且次級分類器是脂蛋白A的變化(臨界值<小于-0. 23)；當脂蛋白A的變化大于或等于所述臨界值并且MDC的變化大于或等于所述臨界值時，該患者被預(yù)測為反應(yīng)者?；讦?2-微球蛋白變化(臨界值>大于>等于-0. 11，對數(shù)值)，MDC變化<小于-0. 12的患者被再分類為反應(yīng)者，并且如果β 2-微球蛋白變化小于所述臨界值，則該患者被再分類為無反應(yīng)者。
具體實施例方式MMACR，美國風濕病學會評分CART,分類與回歸樹模型CRP，C反應(yīng)蛋白
DAS28，使用28個關(guān)節(jié)的疾病活動指數(shù)評分DIP，遠端指節(jié)間EIA，酶免疫測定法ELISA，酶聯(lián)免疫測定法G-CSF =粒細胞集落刺激因子HAQ，健康評估問卷MAP，多重分析物特征圖MDC,巨噬細胞源趨化因子NAPSI，銀屑病甲嚴重性指數(shù)PAP，前列腺酸性磷酸酶PASI，銀屑病關(guān)節(jié)炎嚴重性指數(shù)I^sA，銀屑病關(guān)節(jié)炎SELDI，表面增強激光解吸與離子化SAP,血清淀粉樣蛋白P組分SGOTTNF α /TNF α，腫瘤壞死因子αTNFR，腫瘤壞死因子受體VEGF，血管內(nèi)皮生長因子ILIL，白介素IL-1R, IL-I 受體VAS，視覺模擬評分^X“生物標記物”由生物標記物定義工作組定義為‘被作為正常生物過程、致病過程、 或?qū)χ委熜愿深A(yù)的藥理反應(yīng)的客觀指示物客觀地測量和評價的特征’ (Atkinson等人，2001 Clin Pharm Therap 69(3) :89-95)。因此，解剖學或生理學過程可以作為生物標記物，例如活動范圍，如同蛋白質(zhì)、基因表達(mRNA)、小分子、代謝物或礦物質(zhì)的水平可以充當生物標記物那樣，前提條件是該生物標記物與相關(guān)的生理、毒理、藥理和臨床結(jié)果之間存在經(jīng)驗證的聯(lián)系。標記物的“血清水平”意指通過一種或多種方法(例如免疫測定法)對從標本(例如血液)制備的樣品(通常離體)測量的標記物的濃度。免疫測定法對每種標記物使用免疫特異性試劑(通常為抗體)，并且此測定法可以多種形式(包括酶偶聯(lián)反應(yīng)，例如，EIA、 ELISA、RIA、或其他直接或間接探針)進行。對樣品中標記物進行定量的其他方法也是可能的，例如與電化學探針、熒光探針連接的檢測法。該測定也可以是“多重的”，其中多種標記物在單個樣品分析時被檢測和定量。觀察研究通常將其結(jié)果報告為比值比(OR)或相對風險。兩者均為暴露(例如，吸煙、使用藥物等)與疾病或死亡之間的關(guān)聯(lián)程度的量度。相對風險1.0表示該暴露不會改變疾病的風險。相對風險1. 75表示患者暴露時發(fā)展該疾病的機會是原來的1. 75倍或罹患該疾病的風險高出75%。小于1的相對風險表示該暴露降低了風險。當相對風險不能具體計算時，比值比為病例-對照研究中估計相對風險的一種方法。雖然當疾病罕見時它是準確的，但當該疾病常見時，這種逼近就沒那么可靠了。預(yù)測值有助于解釋臨床環(huán)境下測試的結(jié)果。過程的診斷價值通過其靈敏度、特異性、預(yù)測值和有效性來定義。任何測試方法都會產(chǎn)生真陽性(TP)、假陰性(FN)、假陽性(FP) 和真陰性(TN)。測試的“靈敏度”是具有疾病表現(xiàn)或確實反應(yīng)的具有陽性測試的全部患者的百分比即(TP/TP+FN)X100%。測試的“特異性”是沒有疾病或確實無反應(yīng)的具有陰性測試的全部患者的百分比即(TN/FP+TN)X100%。測試的“預(yù)測值”或“PV”是所述值(陽性或陰性)為真值的次數(shù)的測量值(％ )，即作為真陽性的全部陽性測試的百分比是陽性預(yù)測值 (PV+)或(TP/TP+FP)X100%。“陰性預(yù)測值”(PV-)是無反應(yīng)的具有陰性測試的患者的百分比即(TN/FN+TN) X100%。試驗的“準確性”或“有效性”是與總測試數(shù)相比該測試給出正確答案的次數(shù)的百分比即(TP+TN/TP+TN+FP+FN)X100(%?！罢`差率”根據(jù)預(yù)測有反應(yīng)但實際無反應(yīng)的那些患者和預(yù)測無反應(yīng)但反應(yīng)的患者算出，也就是(FP+FN/TP+TN+FP+FN) X 100%。 整體測試“特異性”是靈敏度的準確性的量度，并且測試的特異性不隨群體中疾病的整體可能性變化而變化，而預(yù)測值則確實變化。PV隨醫(yī)師臨床評估給定患者中疾病的存在或不存在或臨床反應(yīng)的存在或不存在而變化。生物標記物的“減低水平”或“較低水平”指可量化地小于稱作“臨界值”的預(yù)定值且高于定量下限(LLOQ)的水平。這種確定的“臨界值”對與患者取樣和治療狀況相關(guān)的算法和參數(shù)是特定的。生物標記物的“較高水平”或“升高水平”指可定量地高于稱作“臨界值”的預(yù)定值的水平。這種“臨界值”對與患者取樣和治療狀況相關(guān)的算法和參數(shù)是特定的。如本文所用，術(shù)語“人TNF α ”(本文縮寫為hTNFa或簡略為TNF)用來指作為17kD 分泌形式和^kD膜相關(guān)形式存在的人細胞因子，其生物活性形式由非共價結(jié)合的17kD分子的三聚體構(gòu)成。術(shù)語“人TNF α ”用來包括重組的人TNF α (rhTNF α )，其可通過標準重組表達方法制備或商購獲得(R&D Systems,目錄號210-TA，Minneapolis，Minn.)?！翱筎NF α，，或簡略為“抗TNF”療法或治療意指將能夠阻斷、抑制、中和、防止受體結(jié)合或防止TNFR被TNF α激活的生物分子(生物藥劑)施用至患者。此類生物藥劑的例子是針對TNFa的中和單克隆抗，包括但不限于在通用名英夫利昔單抗、阿達木單抗和戈利木單抗下銷售的那些抗體，以及處于臨床開發(fā)階段的抗體。還包括能夠結(jié)合TNFa的非抗體構(gòu)建體例如稱為依那西普的TNFR免疫球蛋白嵌合體。該術(shù)語涵蓋本文描述的抗TNF α人抗體和抗體部分以及在美國專利Nos. 6，090，382 ；6, 258，562 ；6, 509，015和美國專利申請 kr. Nos. 09/801185和10/302356中描述的那些。在一個實施例中，用于本發(fā)明中的TNF α 抑制劑是抗TNF α抗體或其片段，包括英夫利昔單抗(Remicade ，Johnson and Johnson ； 在以引用方式并入本文的美國專利No. 5，656，272中描述)、⑶P571 (人源化單克隆抗 TNF- α IgG4抗體)、CDP 870 (人源化單克隆抗TNF α抗體片段)、抗TNF dAb (Peptech)、 CNTO 148(戈利木單抗；WO 02/12502 和 US7, 250, 165)和阿達木單抗(Humira Abbott Laboratories，人抗TNF mAb，在美國專利No. 6，090，382中記為D2E7)?？梢杂糜诒景l(fā)明中的額外 TNF 抗體在美國專利 Nos. 6，593，458 ；6，498，237 ；6，451，983 ；和 6，448，380 中描述， 所述專利每一篇均以引用方式并入本文。在另一個實施例中，TNFa抑劑為TNF融合蛋白， 例如，依那西普(Enbrel ，Amgen ；在以引用方式并入本文的WO 91/03553和WO 09/406476 中描述)。在另一個實施例中，TNFa抑制劑是重組TNF結(jié)合蛋白(r_TBP_I) (Serono)。
“樣品”或“患者的樣品”意指這樣的標本，所述標本是從疑似患有或已經(jīng)表現(xiàn)出與 TNFa相關(guān)疾病有關(guān)的癥狀的患者中提取、產(chǎn)生、采集、或以其他方式獲得的細胞、組織、或流體或它們的部分。鍵近期在技術(shù)(例如蛋白質(zhì)組學)上的進展向病理學家提出了挑戰(zhàn)，要求將用高通量方法產(chǎn)生的新信息與基于臨床病理學相關(guān)性并通常涵蓋組織病理學發(fā)現(xiàn)的當前診斷模型整合在一起。醫(yī)療信息學和生物信息學領(lǐng)域的并行發(fā)展為以合理方式解決這些問題提供了技術(shù)和數(shù)學方法，從而向從業(yè)者和病理學家或其他醫(yī)學專家提供了多變量多學科診斷預(yù)后模型形式的新工具，進而有希望提供更加準確的、個性化的基于患者的信息。循證醫(yī)學 (EBM)和醫(yī)療決策分析(MDA)屬于這類學科，它們使用定量方法來評估信息的價值并將所謂的最佳證據(jù)整合到多變量模型中用于評估預(yù)后、治療反應(yīng)和可能影響個體患者護理的化驗方法的選擇。本文公開并要求保護的主題包括幾個方面，如1.使用血清或其他樣品類型來識別與PsA患者中對抗TNF(如戈利木單抗)治療有反應(yīng)或無反應(yīng)的相關(guān)的生物標記物；2.在開始抗TNF療法之前，用來自PsA確診患者的血清或其他樣品類型中存在的生物標記物來預(yù)測對抗TNF a Mab (如戈利木單抗)治療有反應(yīng)或無反應(yīng)的能力；3.用于預(yù)測接受抗TNF療法的PsA患者的治療結(jié)果的算法；a.在抗TNF療法開始之前，可以在使用PsA確診患者的血清或其他樣品類型中存在的生物標記物評估時(第0周)預(yù)測PsA患者在第14周或稍后隨訪時對抗TNF α的臨床反應(yīng)或無反應(yīng)。b.可以使用生物標記物距治療開始前(第0周)和治療開始后在第4周所獲得的基線值的變化，預(yù)測PsA患者在第14周或之后隨訪時對抗TNF α治療的臨床反應(yīng)或無反應(yīng)。c.可以使用生物標記物距治療開始前(第0周)所獲得的基線值的變化聯(lián)合治療開始后在第4周的生物標記物變化，預(yù)測PsA患者在第14周或之后隨訪時對抗TNF α治療的臨床反應(yīng)或無反應(yīng)；以及4.裝置、系統(tǒng)和套盒，其包括使用本發(fā)明標記物來預(yù)測PsA患者對抗TNF α療法有反應(yīng)或無反應(yīng)的裝置。為了判定可用于建立基于標記物濃度的預(yù)測算法的標記物，從用戈利木單抗治療的患者獲得血清。可在治療的基線(第0周)、第4周和第14周或其他的居中時間點的或更長的時間點獲得血清。對血清樣品中的許多生物標記物作了分析，并對基線濃度以及治療后生物標記物濃度的變化作了測定。然后使用生物標記物表達的基線和變化來確定生物標記物表達是否與治療開始后第14周或其他限定時間點的治療結(jié)果相關(guān)，如通過ACR20或臨床反應(yīng)的另一度量標準進行評估。在一個實施例中，用于定義與PsA患者對抗TNFa療法臨床反應(yīng)相關(guān)的標記物和建立用于預(yù)測有反應(yīng)或無反應(yīng)的算法的過程使用了逐步分析法，所述算法涉及這些標記物的血清濃度，其中初始相關(guān)性通過邏輯回歸分析法完成，所述邏輯回歸分析法將每個患者在第0周、第4周和第14周的每種生物標記物的值與該患者在第14周和第M周的臨床評估結(jié)果相關(guān)聯(lián)，并且一旦確定標記物能夠在多個臨床終點與治療反應(yīng)顯著相關(guān)，則使用如本文所述的或本領(lǐng)域所知的CART或其他合適的分析方法，建立基于所限定的標記物或標記物組的血清值的獨特算法。除了本文所公開的其他標記物，數(shù)據(jù)集標記物可選自一個或多個臨床指標，例如年齡、種族、性別、血壓、身高和體重、身體質(zhì)量指數(shù)、CRP濃度、吸煙、心率、空腹胰島素濃度、 空腹葡萄糖濃度、糖尿病狀態(tài)、使用其他藥物、以及特定的功能或行為評估結(jié)果和/或基于放射學或其他圖像的評估結(jié)果，其中數(shù)值被應(yīng)用于各個度量方法或產(chǎn)生總體的數(shù)值評分。 通常會評估臨床變量，并且將所得的數(shù)據(jù)在算法中與上文描述的標記物組合。在輸入到分析過程之前，通常以三份或多重三份測量各標記物的值，從而收集每個數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)?？蓪?shù)據(jù)進行操作，例如原始數(shù)據(jù)可使用標準曲線變換，并且用三份測量值的平均值來計算每個患者的平均值和標準偏差。這些值可在用于模型前進行變換，例如，對數(shù)變換、Box-Cox 變換(參見 Box and Cox (1964) J. Royal Stat. Soc, Series B, 26 211-212 ;1964)，或本領(lǐng)域已知或?qū)嵭械钠渌儞Q。這些數(shù)據(jù)然后被輸入具有確定參數(shù)的分析過程。然后讓這樣獲得的與蛋白質(zhì)標記物和其他數(shù)據(jù)集組件相關(guān)的定量數(shù)據(jù)經(jīng)歷具有使用學習算法事先確定的參數(shù)的分析過程，即，輸入預(yù)測模型中，如本文所提供的實例(實例1- 中那樣。分析過程的參數(shù)可以是本文所公開的那些或者使用本文所述的指導(dǎo)得出的那些。將學習算法例如線性判別分析法、遞歸特征排除法、微陣列預(yù)測分析、邏輯回歸法、 CART、FlexTree、LART、隨機森林法、MART、或另一種機器學習算法應(yīng)用于合適的基準或訓練數(shù)據(jù)，以確定適用于PsA反應(yīng)或無反應(yīng)分類的分析過程的參數(shù)。該分析過程可設(shè)定用來確定樣品屬于給定類別的概率的閾值。概率優(yōu)選地為至少 50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或更高。在其他實施例中，該分析過程確定所得數(shù)據(jù)集和參考數(shù)據(jù)集之間的比較是否產(chǎn)生統(tǒng)計學上顯著的差異。如果是這樣，那么該數(shù)據(jù)集所源自的樣品被歸類為不屬于參考數(shù)據(jù)集類。相反地，如果該比較與參考數(shù)據(jù)集沒有統(tǒng)計學上顯著的差異，那么該數(shù)據(jù)集所源自的樣品被歸類為屬于參考數(shù)據(jù)集類。—般來講，該分析過程在形式上為通過統(tǒng)計學分析方法例如線性算法、二次算法、 多項式算法、決策樹算法、投票算法產(chǎn)生的模型。/ mmMmm^m^Mfrmmmm采用合適的基準或者說訓練數(shù)據(jù)集通過任何合適的學習算法來確定用于分類 (即建立預(yù)測模型)的分析過程的參數(shù)。待使用的基準即訓練數(shù)據(jù)集將取決于待確定的想要的PsA分類，例如反應(yīng)者或無反應(yīng)者。數(shù)據(jù)集可包括來自兩個、三個、四個、或更多個類別的數(shù)據(jù)。例如，為了使用受監(jiān)督的學習算法來確定用于分析過程(其用來預(yù)測對抗TNF α 療法的反應(yīng))的參數(shù)，使用包含對照樣品和發(fā)病樣品的數(shù)據(jù)集作為訓練集。作為另外一種選擇，受監(jiān)督的學習算法將用來建立PsA病療法的預(yù)測模型。統(tǒng)計分析以下為統(tǒng)計分析方法的類型的例子，這些方法可供本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用，以幫助實施本發(fā)明所公開的方法。統(tǒng)計分析可被應(yīng)用于兩個任務(wù)中的一者或兩者。首先，可使用這些和其他統(tǒng)計學方法來識別標記物和其他指標的優(yōu)選子集，這些優(yōu)選子集將形成優(yōu)選數(shù)據(jù)集。此外，可使用這些和其他統(tǒng)計學方法來生成分析過程，其應(yīng)用于數(shù)據(jù)集以得到結(jié)果。本文介紹的或以其他方式在本領(lǐng)域獲得的統(tǒng)計學方法中的若干方法可同時完成這兩個任務(wù)，并且產(chǎn)生適合用作分析過程的模型以實施本文所公開的方法。在一個具體實施例中，生物標記物和它們對應(yīng)的特征(例如，表達水平或血清水平)用來建立一個分析過程或多個分析過程，所述分析過程區(qū)分患者類別，例如，對于抗 TNF療法的反應(yīng)者和無反應(yīng)者一旦使用這些示例性數(shù)據(jù)分析算法或本領(lǐng)域已知的其他方法建立了分析過程，則該分析過程可用來將測試受試者分類到兩個或多個表型分類之一(例如預(yù)測對抗TNF α療法有反應(yīng)的患者或無反應(yīng)的患者)。這通過將分析過程應(yīng)用于從測試受試者獲得的標記物特征圖來實現(xiàn)。因此，此類分析過程具有作為診斷指標的價值。在一個方面，所公開的方法為相對于得自訓練群體的標記物特征圖來評價得自測試受試者的標記物特征圖創(chuàng)造了條件。在一些實施例中，得自訓練群體的受試者以及測試受試者的每種標記物特征圖包括多種不同標記物各自的特征。在其他的實施例中，這種比較通過如下方式實現(xiàn)(i)使用得自訓練群體的標記物特征圖，建立分析過程，并且(ii)將該分析過程應(yīng)用于得自測試受試者的標記物特征圖。如此，在本文所公開的方法的一些實施例中應(yīng)用的分析方法用來確定測試PsA患者是否被預(yù)測為對抗TNF α療法有反應(yīng)或無反應(yīng)的患者。因此，在一些實施例中，上述二元決策情形中的結(jié)果具有4種可能結(jié)局(i)真實反應(yīng)者，其中該分析過程表明受試者將是抗TNF α療法的反應(yīng)者并且該受試者在有限時間段期間對抗TNF α療法有反應(yīng)(真陽性，TP) ； (ii)虛假反應(yīng)者，其中該分析過程表明受試者將是抗TNF α療法的反應(yīng)者并且該受試者在有限時間段期間對抗TNF α療法無反應(yīng)(假陽性，F(xiàn)P) ； (iii)真實無反應(yīng)者，其中該分析過程表明受試者將不是抗TNF α療法的反應(yīng)者并且該受試者在有限時間段期間對抗TNF α療法無反應(yīng)(真陰性，TN)；或(iv)虛假無反應(yīng)者，其中該分析過程表明受試者將不是抗TNF α療法的反應(yīng)者并且事實上該受試者在有限時間段期間確實對抗TNF α療法有反應(yīng)(假陰性，F(xiàn)N)。用于建立分析方法的相關(guān)數(shù)據(jù)分析算法包括(但不限于)判別分析，包括線性、 邏輯以及更靈活的判別方法(參見，例如，Gnanadesikan，1977，Methods for Statistical Data Analysis of Multivariate Observations, New York :ffiley 1977,^ ! ] : 以引用方式全文并入本文)；基于樹的算法，例如分類與回歸樹(CART)及變型(參見，例
Breiman,1984, Classification and Regression Trees, Belmont, Calif. ；Wadsworth International Group)；廣義相加模型(參見，例如，Tibshirani，1990，Generalized Additive Models，London Chapman and Hall)；以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(參見，例如，Neal，1996， Bayesian Learning for Neural Networks, New York Springer-Verlag ；以及 Insua， 1998，F(xiàn)eedforward neural networks for nonparametric regression In Practical Nonparametric and Semiparametric Bayesian Statistics，第 181-194 頁，New York Springer0這些參考文獻據(jù)此以引用方式全文并入。在具體的實施例中，本發(fā)明的數(shù)據(jù)分析算法包括分類與回歸樹(CART)、多重累計回歸樹(MART)、微陣列預(yù)測分析(PAM)或隨機森林分析。此類算法對來自生物材料(例如血樣)的復(fù)雜譜圖進行分類，以將受試者分類為正?；蚍诸悶榫哂斜碚魈囟膊顟B(tài)的生物標記物表達水平。在其他實施例中，本發(fā)明的數(shù)據(jù)分析算法包括ANOVA和非參數(shù)等同物、線性判別分析法、邏輯回歸分析法、最近鄰分類器分析法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法、主成分分析法、二次判別分析法、回歸分類法和支持向量機法。雖然此類算法可用來生成分析過程和/或增加分析方法應(yīng)用的速度和效率以及避免研究者偏倚，然而本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會體會到無需基于計算機的裝置來實施使用本發(fā)明的預(yù)測模型的方法。CART分析的結(jié)果在本發(fā)明的一個方面，診斷患有I^sA的患者的血清標記物的分析以生物標記物基線值與對抗TNFa療法的反應(yīng)之間的顯著相關(guān)為重點。在本發(fā)明的另一個方面，診斷患有 PsA的患者的血清標記物中從基線(抗TNF α療法之前)至治療后第4周的血清標記物變化的分析結(jié)果與該患者在之后的時間(第14周)的臨床反應(yīng)或無反應(yīng)相關(guān)。在本發(fā)明的一個特定實施例中，發(fā)現(xiàn)VEGF的基線濃度可以是用于預(yù)測如ACR20對用戈利木單抗治療的患者評價的第14周結(jié)果的初始分類器。在一個替代實施例中，其他基線標記物例如脂連蛋白、PAP和SGOT可以用作預(yù)測在第14周或第M周或其他時間點的結(jié)果的初始分類器，如ACR20、DAS28、或PCS、PASI、或活動性疾病的其他評分方法那樣對于用戈利木單抗治療的患者作出評估。醫(yī)師可利用該信息來確定誰會受益于戈利木單抗治療， 以及同樣重要的，來識別那些不能受益于此類治療的患者。作為另外一種選擇，使用DAS28作為該模型的臨床結(jié)果構(gòu)成部分，并且基線處的 VEGF、基線處的脂連蛋白、基線處的PAP、或基線處的SGOT或其變化是分類的初始標記物。 已表明與第14周或第M周臨床反應(yīng)中至少一者相關(guān)的其他基線標記物水平包括IL-8、脫氧吡啶啉(deoxypyridinoline)、S_100 (由單核細胞產(chǎn)生的急性期蛋白質(zhì)并且在來自RA和 PsA患者的血清和SF中升高)、透明質(zhì)酸、骨堿性磷酸酶、IL-6 (血清)和VEGF (血清)?；€生物標記物預(yù)測對抗TNF α療法的反應(yīng) 當從僅包含基線生物標記物血清濃度值并且與用抗TNF α治療劑治療的PsA患者在多于一種臨床反應(yīng)評估方法(例如ACR20和DAS28)中的臨床反應(yīng)相關(guān)的數(shù)據(jù)集建立預(yù)測算法時，標記物包括VEGF、PAP和脂連蛋白。圖1中的CART模型使用3種標記物以將患者分類為反應(yīng)者或無反應(yīng)者。對于每種標記物，使用單一閾值(例如，對于VEGF，該閾值是8.08幻。在這種模型中通過使用患者的生物標記值對患者分類，從決策樹的頂部進行到底部。一旦到達該樹底部的節(jié)點，則該患者的分類由節(jié)點標簽決定(Yes或No分別指反應(yīng)者和無反應(yīng)者)。作為一個實例，考慮患者具有以下值VEGF = 9. 00前列腺酸性磷酸酶(PAP) = 1.00脂連蛋白=1.00在該樹的頂部，第一標記物是VEGF，并且閾值是8. 082。由于VEGF值在本實例中是9. 00，沿著該樹的右分支而下。下一個標記物是PAP，值1. 00大于-2.觀7，故再次采用右分支。最后，脂連蛋白的值是1.00，小于閾值1.35，故采用左分支。最終結(jié)果是患者的值將它們置入“No”倉中，于是該受試者被分類為無反應(yīng)者。注意，在一些情況下，由于CART模型的層級性，可以僅基于最高水平標記物對患者進行分類(例如，如果VEGF <小于8. 082， 將該受試者分類為無反應(yīng)者，無論該模型中其余兩個標記物的值是多少)。
如本文中所示，分析在基線(第0周，在治療之前)從PsA患者獲得的血清中的生物標記物，通過多重測定法定量，最佳CART模型包括VEGF作為初始分類器(圖1)并且包括PAP作為第二分類器，同時以脂連蛋白作為第三分類器，此時PAP大于或等于患者中的閾值水平，所述患者具有大于或等于閾值水平的VEGF。模型靈敏度是53%，并且模型特異性是 95%。這些結(jié)果提示，可以在治療前由醫(yī)師測量生物標記物的基線水平，以確定哪些用戈利木單抗治療的患者會對該治療有反應(yīng)或無反應(yīng)。牛物標記物變化作為結(jié)局的早期預(yù)測物當比較PsA患者在第4周的基線血清水平變化時，與安慰劑治療組相比，戈利木單抗治療的患者組表現(xiàn)出顯著不同的血清生物標記物水平。變化的生物標記物包括 α -1-抗胰蛋白酶、CRP、ENRAGE、結(jié)合珠蛋白、ICAM-I、IL-16、IL-18、IL-lra, IL_8、MCP_1、 MIP-I β、MMP-3、綠過氧物酶、血清淀粉樣蛋白P、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、TNFRII和VEGF。為分析在基線和第4周從PsA患者獲得的血清中與第14周主要臨床終點(ACR20) 相關(guān)的生物標記物，該生物標記物模型使用MDC的變化作為初始分類器，隨后使用脂蛋白A 的變化和β 2-微球蛋白的變化進行再次分類(圖2)。本文所述的用于產(chǎn)生可用于預(yù)測PsA患者對抗TNF α療法有反應(yīng)或無反應(yīng)的算法的具體實例表明，多種標記物與PsA過程相關(guān)并且迄今尚未充分確立每種特定生物標記物在診斷或預(yù)測治療反應(yīng)的定量解釋。本申請人證實，算法可以通過對基于所定義的特定標記物的患者數(shù)據(jù)的取樣來生成。在使用本發(fā)明標記物的一種方法中，使用計算機輔助的裝置來捕獲患者數(shù)據(jù)并且進行必要的分析。在另一方面，計算機輔助的裝置或系統(tǒng)可以使用本文提供的數(shù)據(jù)作為“訓練數(shù)據(jù)集”，以產(chǎn)生所需的分類器信息來應(yīng)用預(yù)測性分析。用于講行分析的儀器、試劑和套念可以在臨床或研究實驗室或者醫(yī)院或醫(yī)院外地點的中央實驗室中，使用本文所述的標準免疫化學和生物物理方法進行用于預(yù)測PsA確診患者對于抗TNF療法的反應(yīng)的血清標記物測量。標記物的定量可與例如其他標準測量法如WBC計數(shù)、血小板和ESR同時進行。 該分析可使用商購套盒或使用多重分析對單個患者樣品分別或分批進行。在本發(fā)明的一個方面，在一個或多個步驟中使用單個和成組試劑來確定患者樣品中生物標記物或生物標記物組的相對量或絕對量。可用試劑來捕獲生物標記物，例如對生物標記物具有免疫特異性的抗體，該抗體形成配體生物標記物對，可通過間接測定例如酶聯(lián)免疫特異性分析來測定?？蛇M行單一分析物EIA或多重分析。多重分析為這樣的技術(shù)， 通過該技術(shù)可使用單個血清樣品進行多個同時的基于EIA的分析?？捎糜谠诜浅Ｐ〉臉悠敷w積中定量大量生物標記物的平臺是Rules Based Medicine (Austin, Texas) (Luminex Corporation所有)采用的xMAP 技術(shù)，該技術(shù)將光學分類方案、生化檢測、流式細胞儀和先進的數(shù)字信號處理硬件和軟件整合在一起，實現(xiàn)了在單個反應(yīng)容器中運行多達100路的基于微球的分析。在該技術(shù)中，多路復(fù)用通過為每個分析物特異的分析指定一個帶有獨特熒光標記的微球組來完成。多重分析在流式裝置中分析，該裝置在每個微球通過紅色和綠色激光時對每個微球進行單獨詢問。作為另外一種選擇，可使用方法和試劑來處理樣品，以便檢測以及使用直接的物理測量(例如質(zhì)量、電荷或組合，例如通過SELDI測量)進行可能的定量。也已經(jīng)開發(fā)了定量質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測分析，例如NextGen Sciences (Ann Arbor,MI)提供的那些。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，用來評價PsA狀態(tài)的生物標記物的檢測需要使來自受試者的樣品與其上具有捕獲試劑的底物(例如，探針)在允許生物標記物和該試劑間結(jié)合的條件下接觸，然后通過合適方法檢測與吸附劑結(jié)合的生物標記物。檢測標記物的一個方法是氣相離子譜，例如質(zhì)譜?？捎糜诖四康牡钠渌麢z測范例包括光學方法、電化學方法(伏安法、電流分析法或電致化學發(fā)光技術(shù))、原子力顯微鏡法以及射頻方法，例如多極共振分光法。除了顯微鏡法(共焦和非共焦)外，示例性的光學方法為熒光、發(fā)光、化學發(fā)光、吸光度、反射率、透射比和雙折射率或折射率的測定方法(例如，表面等離子體共振、橢圓光度法、共振鏡法、波導(dǎo)光柵耦合器法或干涉測量法)、以及酶偶聯(lián)比色法或熒光法。將檢測方法應(yīng)用于處理過的標本或樣品之前，來自患者的標本可能需要處理，例如但不限于濃縮、純化標記物、或?qū)擞浳锱c標本的其他組分分開。例如，通常允許血樣凝固，隨后離心以產(chǎn)生血清，或用抗凝劑處理，并且在經(jīng)歷檢測分析物濃度的方法之前移去細胞組分和血小板。作為另外一種選擇，可通過連續(xù)處理系統(tǒng)完成檢測，該處理系統(tǒng)可以并入完成此類濃縮、分離或純化步驟的材料或試劑。在一個實施例中，該處理系統(tǒng)包括使用捕獲試劑。一種類型的捕獲試劑為“色譜吸附劑”，其為通常用于色譜法的材料。色譜吸附劑例如包括離子交換材料、金屬螯合劑、固定化金屬螯合物、疏水相互作用吸附劑、親水相互作用吸附劑、染料、簡單生物分子(例如，核苷酸、氨基酸、單糖和脂肪酸)、混合模式吸附劑(例如，疏水吸引/靜電排斥吸附劑)?！吧锾禺愋浴辈东@試劑是生物分子類型的捕獲試劑，所述生物分子例如，核苷酸、核酸分子、氨基酸、多肽、多糖、脂質(zhì)、類固醇或這些物質(zhì)的綴合物 (例如，糖蛋白、脂蛋白、糖脂)。在某些情況下，生物特異性吸附劑可以是大分子結(jié)構(gòu)，例如多蛋白復(fù)合體、生物膜或病毒。示例性生物特異性吸附劑為抗體、受體蛋白和核酸。生物特異性吸附劑與色譜吸附劑相比通常具有對目標分析物更高的特異性。因此，根據(jù)本發(fā)明，生物標記物的檢測和定量可通過使用特定的選擇性條件(例如，吸附劑或洗滌溶液)來增強。洗滌溶液是指這樣的試劑(通常為溶液)，其用來影響或改變吸附劑表面對分析物的吸附性和/或從表面去除未結(jié)合的材料。洗滌溶液的洗脫特性取決于例如PH、離子強度、疏水性、離液序列度、洗滌劑強度和溫度。在本發(fā)明的一個方面，樣品以多路復(fù)用方式進行分析，這意味著來自患者樣品的標記物的處理幾乎同時進行。在一個方面，用含有多種捕獲試劑(代表獨特的特異性)的底物接觸樣品。捕獲試劑通常為免疫特異性的抗體或其片段。底物可為單個元件例如“生物芯片”，該術(shù)語表示這樣的固體底物，其具有總體上平坦的表面，其上附著捕獲試劑；或者捕獲試劑分隔于多個底物之間，例如結(jié)合于單個球形底物(微珠)。通常，生物芯片的表面包括多個可尋址位點，每個位點上都結(jié)合有捕獲試劑。生物芯片可適于與探針接口接合，并且因此作為氣相離子譜(優(yōu)選地為質(zhì)譜)中的探針發(fā)揮作用。作為另外一種選擇，本發(fā)明的生物芯片可安裝于另一個底物上來形成可插入到光譜儀中的探針。就微珠而言，單個微珠可在暴露于待測樣品后分隔或分類。根據(jù)本發(fā)明，多種用于捕獲和檢測生物標記物的生物芯片可得自商業(yè)來源， 例如 Ciphergen Biosystems(Fremont, CA)、Perkin Elmer(Packard BioScience Company (Meriden CT)、Zyomyx (Hayward, CA)禾口 Phylos (Lexington，MA)、GE Healthcare， Corp. (Sunnyvale, CA)。這些生物芯片的示例是在美國專利No. 6，225，047 (上文)和 No. 6, 329, 209 (Wagner 等人)并且在 WO 99/51773 (Kuimelis 和 Wagner)、WO 00/56934 (Englert等人)中描述的那些生物芯片，并且特別是使用了檢測分析物標記在樣品中的存在或含量的電化學方法和電化學發(fā)光方法的那些生物芯片，如Wohlstadter等人、W098/12539和美國專利No. 6，066, 448中教導(dǎo)的那些多特異性、多陣列。將具有生物特異性捕獲和/或檢測試劑的底物與樣品(含有例如血清)接觸一段時間，該段時間足以允許可能存在的生物標記物與試劑結(jié)合。在本發(fā)明的一個實施例中，將多于一種類型的其上具有生物特異性捕獲或檢測試劑的底物與生物樣品接觸。孵育一段時間后，洗滌底物以去除未結(jié)合的材料?？墒褂萌魏魏线m的洗滌溶液，優(yōu)選地使用水溶液。結(jié)合到底物上的生物標記物在解吸后直接通過使用氣相離子譜儀(例如飛行時間質(zhì)譜儀)進行檢測。生物標記物通過離子源(例如激光)離子化，產(chǎn)生的離子通過離子光學組件收集，然后質(zhì)量分析器分散并分析通過的離子。然后檢測器將檢測到的離子的信息轉(zhuǎn)換成質(zhì)荷比。生物標記物的檢測通常會涉及到信號強度的檢測。因此，生物標記物的數(shù)量和質(zhì)量均可測定。此類方法可用于發(fā)現(xiàn)生物標記物以及在某些情況下用于生物標記物的定量。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法是能夠使得例如在US 5，571，410和US RE36350中教導(dǎo)的用于液相分析的液體樣品處理和分析裝置微型化的微流體裝置，所述微流體裝置可用于檢測和分析液相中的小和/或大分子溶質(zhì)，任選地采用色譜分離方法、電泳分離方法、電色譜分離方法、或它們的組合。該微流體裝置或“微裝置”可以包括排列成可以分開分析物流體的多個通道，使得生物標記物可以在該裝置內(nèi)的可尋址位置捕獲并且 (任選地)檢測(US5, 637，469、US6, 046，056 和 US6, 576，478)。由生物標記物檢測產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可用可編程數(shù)字計算機進行分析。計算機程序?qū)?shù)據(jù)進行分析以指示檢測到的標記物的數(shù)量和信號的強度。數(shù)據(jù)分析包括測定生物標記物的信號強度以及去除偏離預(yù)定統(tǒng)計分布的數(shù)據(jù)的步驟。例如，數(shù)據(jù)可相對于某個基準歸一化。 計算機可將所得的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成各種格式，以用于顯示(如果需要)或用于進一步的分析。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在一些實施例中，使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)?？舍槍λx定的標記物組來構(gòu)造神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為二階回歸或分類模型。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有層狀結(jié)構(gòu)，其包括通過權(quán)重層與輸出單元層連接的輸入單元(和偏置)層。對于回歸，輸出單元層通常只包括一個輸出單元。然而，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能夠以無縫方式處理多個定量性反應(yīng)。在多層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，有輸入單元(輸入層)、隱單元(隱藏層)和輸出單元(輸出層)。此外，還有單個的偏置單元，其連接到除輸入單元外的每個單元。關(guān)于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的描述見于如下文獻Duda et al，2001，Pattern Classification, Second Edition, John Wiley &amp ；Sons，Inc.，New York ；以及 Hastie et al, 2001, The Elements of Statistical Learning，Springer-Verlag, New York0使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的基本方法是從未訓練的網(wǎng)絡(luò)開始，向輸入層提供訓練模式，例如， 訓練數(shù)據(jù)集中的來自患者的標記物特征圖，并使信號通過網(wǎng)絡(luò)并且在輸出層確定輸出，例如，訓練數(shù)據(jù)集中的患者的預(yù)后。然后，將這些輸出與目標值(例如，訓練數(shù)據(jù)集中的患者的實際結(jié)果)進行比較；并且差異對應(yīng)于誤差。該誤差或準則函數(shù)是權(quán)重的某種標量函數(shù)并且當網(wǎng)絡(luò)輸出與所需輸出匹配時被最小化。因此，調(diào)整權(quán)重以減少這種誤差的量。對于回歸，此誤差可為誤差平方和。對于分類，此誤差可為平方誤差或交叉熵(偏差)。參見例如文獻Hastie et al，2001，The Elements of Statistical Learning，Springer-Verlag， New York。三種常用的訓練方案為隨機、分批和在線。在隨機訓練中，從訓練集中隨機選擇模式并且對各模式表示更新網(wǎng)絡(luò)權(quán)重。經(jīng)梯度下降法(例如隨機反向傳播)訓練的多層非線性網(wǎng)絡(luò)在用網(wǎng)絡(luò)拓撲定義的模型中進行權(quán)重值的極大似然估計。在批訓練中，所有模式在學習開始前提供給網(wǎng)絡(luò)。通常，在批訓練中，通過訓練數(shù)據(jù)完成幾次通過。在線訓練中，各模式被提供給網(wǎng)絡(luò)一次且僅為一次。在一些實施例中，考慮了權(quán)重的起始值。如果權(quán)重接近零，則常用于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)隱藏層的S型函數(shù)的操作部分(參見例如文獻Hastie et al,2001, The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag, New York)大致呈線形，并且神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)因此塌縮成近似線性的模型。在一些實施例中，權(quán)重的起始值選擇為接近零的隨機值。因此，模型開始時幾乎呈線性，并隨著權(quán)重的增加變?yōu)榉蔷€性。各個單元局限于各處，并在需要的地方引入非線性。使用精確零權(quán)重可導(dǎo)致零導(dǎo)數(shù)和完美的對稱，并且算法不會變動。作為另外一種選擇，從較大權(quán)重開始常常得到劣解。由于輸入量的縮放決定了底層中權(quán)重的有效縮放，這可對最終解的質(zhì)量有重大影響。因此，在一些實施例中，在開始時將所有表達式數(shù)值標準化成平均值為0并且標準偏差為1。這使得所有輸入在規(guī)則化過程中被同等處理，并允許為隨機起始權(quán)重選擇有意義的范圍。在標準化輸入的情況下，通常取得在σ-0.7，+0.7Ο范圍內(nèi)的隨機均一權(quán)重。在使用具有隱藏層的網(wǎng)絡(luò)時經(jīng)常發(fā)生的問題是在網(wǎng)絡(luò)中使用的隱單元的最優(yōu)數(shù)。 網(wǎng)絡(luò)的輸入和輸出數(shù)由待求解問題確定。對于本文公開的方法，給定神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入數(shù)可為所選標記物組中的標記物數(shù)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出個數(shù)通常僅為一個“是”或“否”。然而，在某個實施例中使用多于一個的輸出，以使得該網(wǎng)絡(luò)可以定義多于兩種狀態(tài)。用來分析數(shù)據(jù)的軟件可以包括代碼，所述代碼將算法應(yīng)用于信號的分析以確定該信號是否代表對應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的生物標記物的信號峰值。該軟件也可將與觀察到的生物標記物信號有關(guān)的數(shù)據(jù)用于分類樹或ANN分析，以確定是否存在指示患者疾病的診斷或狀態(tài)的生物標記物或生物標記物組合的信號。因此，該過程可分成學習階段和分類階段。在學習階段，學習算法被應(yīng)用于包括意欲加以分類的不同類別成員的數(shù)據(jù)集，例如來自診斷為PsA并且對抗TNF α療法有反應(yīng)的患者的多個樣品的數(shù)據(jù)和來自具有陰性結(jié)果的患者(對抗TNFa療法無反應(yīng)的PsA患者)的多個樣品的數(shù)據(jù)。用來分析數(shù)據(jù)的方法包括(但不限于)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法、支持向量機法、遺傳算法和自組織映射圖法、以及分類與回歸樹(CART)分析法。這些方法記載于 (例如)2001年5月3日提交的W001/31579 (Barnhill等人)；2002年1月M日提交的 1002/068 (Hitt等人)和2002年5月30日提交的W002/42733 (Paulse等人)。所述學習算法可產(chǎn)生適應(yīng)于數(shù)據(jù)元素如特定標記物和標記物的特定濃度(通常結(jié)合在一起)的分類算法，所述分類算法可以將未知的樣品分類為兩個類別之一，例如，反應(yīng)者或無反應(yīng)者。該分類算法最終用于預(yù)測性檢驗。容易獲得軟件(不管是免費軟件還是專有軟件)來分析數(shù)據(jù)的模式并按任何預(yù)定的成功標準設(shè)計另外的模式。套盒在另一方面，本發(fā)明提供用于確定哪些I^sA患者將對抗TNFa劑(例如戈利木單抗)治療有反應(yīng)或無反應(yīng)的套盒，所述套盒用來檢測根據(jù)本發(fā)明的血清標記物。所述套盒篩查在PsA患者中差異性存在的血清標記物和標記物組合的存在。在一個方面，套盒包括用于采集樣品的裝置，例如造成皮膚“戳孔”的柳葉刀或穿刺工具。套盒也可以任選地含有探針，如毛細管或用于從戳孔采集血液的血液采集管。在一個實施例中，套盒包括具有一種或多種生物特異性捕獲試劑的基片，這些生物特異性捕獲試劑用來結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的標記物。套盒可包括多于一種類型的生物特異性捕獲試劑，每種試劑存在于相同或不同的基片上。在另一個實施例中，此種套盒可包括標簽或單獨插頁形式的有關(guān)合適操作參數(shù)的說明書。例如，說明書可告知消費者如何采集樣品或者如何清空或洗滌探針。在另一個實施例中，套盒可包括一個或多個含有生物標記物樣品的容器，這些生物標記物樣品用作校準的標準品。在使用本發(fā)明算法預(yù)測PsA患者對于抗TNF療法的反應(yīng)的方法中，在抗TNF療法前并在所述療法開始后的特定時間段從患者獲得血液或其他流體。所述血液可以經(jīng)處理以提取血清或血漿部分或可全血使用。血液或血清樣品可被稀釋成例如1 2、1 5、1 10、 1 20,1 50或1 100，或不稀釋直接使用。在一種格式中，將血清或血液樣品涂敷在預(yù)制的測試條或棒上，并在室溫下溫育特定時間，例如1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、1小時或更長的時間。在規(guī)定的測定時間段后，可從測試條直接讀出樣品和結(jié)果。例如，結(jié)果顯示為不同色調(diào)的彩色或灰色帶，表示一種或多種標記物的濃度范圍。測試條套盒會提供說明，解釋基于一種或多種標記物的相對濃度得出的結(jié)果。作為另外一種選擇，可提供能夠檢測條上標記物檢測體系的色彩飽和度的裝置，所述裝置可基于合適的診斷算法為該標記物系列任選地給出測試解釋的結(jié)果。使用本發(fā)明的方法本發(fā)明提供了一種通過分析診斷患有I^sA的患者中檢測到的生物標記物來預(yù)測對于用抗TNFa劑(例如戈利木單抗)治療的反應(yīng)的方法。在本發(fā)明的方法中，患者首先由富有經(jīng)驗的專家使用主觀和客觀標診斷患有ΜΑ。銀屑病關(guān)節(jié)炎是一種慢性、炎性、通常類風濕因子(RF)陰性的與銀屑病相關(guān)的關(guān)節(jié)炎。銀屑病在普通白種人群體中的流行率為約2% (Boumpas等人，2001)。大約6%至 39%的銀屑病患者發(fā)生I^sA (Sibeeb等人，2000 ；Leonard等人，1978)。男性和女性的發(fā)病率相等，PsA在30至55歲達到高峰(Boumpas等人，2001)。銀屑病關(guān)節(jié)炎牽涉外周關(guān)節(jié)、中軸骨骼、骶髂關(guān)節(jié)、指/趾甲和肌腱端，并且與銀屑病性皮膚損害相關(guān)(Gladman等人，1987， Boumpas等人，2001)。PsA的表現(xiàn)可以劃分成5個重疊的臨床類型，其包括在大約22%至 37%患者中的寡關(guān)節(jié)炎；在36%至41%患者中的多關(guān)節(jié)炎；在最多20%患者中的遠端指節(jié)間(DIP)關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎；影響大約7%至23%患者的脊柱炎；和在大約4%患者中的毀形關(guān)節(jié)炎(Gladman等人，1987 ；Torre Alonso等人，1991)。超過三分之一的PsA患者還發(fā)生指/ 趾炎和肌腱骨止點炎(Gladman等人，1987 ；Soko 11和Helliwell, 2001)。指炎是整個指頭因指關(guān)節(jié)炎癥和腱鞘炎引起的疼痛性腫脹。
肌腱骨止點炎是腱、韌帶或關(guān)節(jié)囊插入骨中所致的炎癥。多于一半的PsA患者可能具有X光膠片上的侵蝕證據(jù)，并且最多40%的患者發(fā)生嚴重的侵蝕性關(guān)節(jié)病(Torre Alonso等人，1991 ；Gladman等人，1987)。銀屑病關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致功能障礙、生活質(zhì)量降低和死亡率增加(Torre Alonso 等人，1991 ；Sokoll 和 Helliwell，2001 ；Wong 等人，1997 ；Gladman 等人，1998)。目前用于I^sA的大部分療法根據(jù)類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者群體中的經(jīng)驗改造而成。盡管PsA的進行性和潛在致殘性質(zhì)，并且與RA對照，僅有幾個隨機、對照試驗查驗了傳統(tǒng)的病情緩解性抗風濕藥(DMARD)在治療PsA中的作用(Dougados等人，1995 Jones等人， 1997 ；Salvarani等人，2001 ；Kaltwasser等人，2004)。在這些研究中，甲氨蝶呤(MTX)、環(huán)胞菌素、柳氮磺吡啶和來氟米特在這種病癥的治療中顯示功效，盡管所述治療與治療開始和在關(guān)節(jié)炎或銀屑病中的臨床顯著反應(yīng)(MTX、環(huán)孢菌素)之間的幾周時滯相關(guān)，或僅對皮膚產(chǎn)生不太大的功效(柳氮磺吡啶、來氟米特)。由于一旦停藥就出現(xiàn)嚴重銀屑病暴發(fā)，皮質(zhì)類固醇幾乎不用來治療I^sA。臨床評估方法銀屑病關(guān)節(jié)炎是風濕病癥(關(guān)節(jié)疾病)，并且經(jīng)常連同發(fā)紅、干燥和鱗片狀的皮膚 (銀屑病性皮膚損害)一起見到。銀屑病關(guān)節(jié)炎是也可以在除皮膚之外遠離關(guān)節(jié)的身體組織中如眼、心臟、肺和腎中引起炎癥的的全身性風濕疾病。銀屑病關(guān)節(jié)炎與數(shù)種其他的關(guān)節(jié)炎病癥如強直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎(前稱Reiter綜合征)和與克羅恩氏病及潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的關(guān)節(jié)炎共有許多特征。全部這些病癥都可以在脊柱與其他關(guān)節(jié)和眼、皮膚、嘴、 及多種器官中引起炎癥。鑒于它們引起脊柱炎癥的相似性和傾向，這些病癥被總稱為“脊柱關(guān)節(jié)病”。往往通過評估腫脹和疼痛的關(guān)節(jié)和如下文所述的某些血清標記物作出PsA的診斷。PsA 一旦確診，醫(yī)師通常縱向監(jiān)測臨床結(jié)果以確定面臨疾病惡化風險的患者。ACR反應(yīng)被作為多種疾病評估標準的數(shù)值化改善量來示出。例如，將ACR 20反應(yīng) Orison等人，Arthr Rheum 38(6) :727-735,1995)定義為以下方面的彡20%的改善量1.腫脹關(guān)節(jié)數(shù)(66個關(guān)節(jié))和壓痛關(guān)節(jié)數(shù)(68個關(guān)節(jié))；以及2.以下5項評估中3項的彡20%的改善量a.患者對疼痛的評估(VAS)b.患者對疾病活動性的總體評估(VAS)c.醫(yī)師對疾病活動性的總體評估(VAS)d.患者對如HAQ所測量的身體功能的評估e.CRP類似地定義ACR 50和ACR 70，不過在這些標準方面分別存在彡50%或彡70%的
改善量。ACR-N 改善指數(shù)(Schiff 等人，1999 Arthritis Rheum. 42 (Supp 1 9) :S81 ；Bathon 等人，2000 N Engl J Med. 343(22) :1586-1593 ;Siegel 和 Zhen，2005Arthritis Rheum 52(6) :1637-1641)被定義為以下3項中的最小值1.壓痛關(guān)節(jié)數(shù)方面從基線算起的改善百分比
2.腫脹關(guān)節(jié)數(shù)方面從基線算起的改善百分比3.以下5個評估項的從基線算起的中位數(shù)改善百分比a.患者對疼痛的評估(VAS)b.患者對疾病活動性的總體評估(VAS)c.醫(yī)師對疾病活動性的總體評估(VAS)d.患者對如HAQ所測量的身體功能的評估e. CRP疾病活動指數(shù)評分^(DAS28)是以統(tǒng)計方法得到的指數(shù)，該指數(shù)合并了壓痛關(guān)節(jié) ( 個關(guān)節(jié))、腫脹關(guān)節(jié)( 個關(guān)節(jié))、CRP和總體健康(GH) (van der Linden，2004，可得自互聯(lián)網(wǎng))DAS^是連續(xù)參數(shù)并且定義如下DAS28 = 0. 56*SQRT(TEN28)+0. 28*SQRT(SW28)+0. 36*Ln(CRP+1)+0. 014*GH+0. 96TEN28是針對壓痛的觀關(guān)節(jié)數(shù)。SW28是針對腫脹的觀關(guān)節(jié)數(shù)。這組觀關(guān)節(jié)數(shù)依據(jù)于左側(cè)與右側(cè)肩部、肘部、腕部、上肢的掌指骨(MCP) 1、MCP2、MCP3、MCP4、MCP5、近端指節(jié)間(PIP) 1、PIP2、PIP3、PIP4、 PIP5關(guān)節(jié)和下肢的左側(cè)與右側(cè)膝關(guān)節(jié)。Ln(CRP+1)是(CRP 值+1)的自然對數(shù)。GH是用VAS IOOmm評價的患者對疾病活動性的總體評估。要被分類為DAS^反應(yīng)者，受試者應(yīng)當具有良好或適度反應(yīng)。DAS^反應(yīng)標準在下表 1 中定義(van Riel，van Gestel 和 kott，2000 EULAR Handbook of Clinical Assessments in Rheumatoid Arthritis. Alphen Aan Den Rijn, The Netherlands :Van Zuiden Communications B. V.；第 40 章)。表權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)測銀屑病關(guān)節(jié)炎患者對抗TNF α療法的反應(yīng)的方法，所述方法包括 測定選自脂連蛋白、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、MDC、SGOT、VEGF、脂蛋白A和β _2_微球蛋白的至少一種血清標記物的濃度；以及將所述濃度與臨界值進行比較，所述臨界值通過分析來自被診斷患有銀屑病關(guān)節(jié)炎的患者的所述標記物的血清濃度值集確定，所述患者接受抗TNF α療法并且基于一個或多個臨床終點被分類為反應(yīng)者或無反應(yīng)者。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中測定至少兩種血清標記物的所述濃度并且與所述標記物的各個臨界值的濃度進行比較。
3.一種用于預(yù)測銀屑病關(guān)節(jié)炎患者對抗TNF α療法的反應(yīng)的方法，所述方法包括a)從抗TNFα療法開始之后在指定時間點施用抗TNF α劑之前的患者獲得樣品；b)測定每個時間點的所述樣品中MDC、脂蛋白A和β-20-微球蛋白的濃度；以及c)將所述樣品中MDC的濃度的變化與MDC臨界值進行比較，從而，如果確定所述濃度大于或等于所述MDC臨界值，則基于所述樣品中脂蛋白A值的變化對所述患者進一步分類，并且如果所述變化低于所述脂蛋白A臨界值，則基于血清中β -2-微球蛋白水平在治療前的樣品和治療后的樣品之間的變化對所述患者進一步分類；從而通過使用臨床評估測量所述值能夠用來預(yù)測所述患者是否為對抗TNF α的無反應(yīng)者。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述樣品是血清。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中將血清MDC的所述變化進行對數(shù)變換并且所述臨界值是-0. 12。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中將血清中脂蛋白A的濃度進行對數(shù)變換并且脂蛋白A臨界值的所述變化是-0. 23。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中將血清中β-2-微球蛋白的濃度進行對數(shù)變換并且β-2-微球蛋白臨界值的所述變化是-0. 11。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述測定步驟同時進行。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述測定步驟由計算機輔助裝置執(zhí)行。
10.一種用于預(yù)測銀屑病關(guān)節(jié)炎患者對抗TNF α療法的反應(yīng)的方法，所述方法包括a)測定來自所述患者的血液或血清樣品中VEGF、前列腺酸性磷酸酶和脂連蛋白的濃度；以及b)將所述血液或血清樣品中所述VEGF濃度與VEGF臨界值進行比較，從而，如果確定所述VEGF濃度小于所述臨界值，則預(yù)測所述患者是抗TNF α療法的無反應(yīng)者；c)將所述患者的樣品中所述前列腺酸性磷酸酶濃度與前列腺酸性磷酸酶臨界值進行比較，如果VEGF的血清值大于或等于所述臨界值，其中前列腺酸性磷酸酶的濃度小于前列腺酸性磷酸酶臨界值，則預(yù)測所述患者是TNF α治療劑的反應(yīng)者，并且如果所述PAP值大于或等于所述PAP臨界值，則使用所述樣品中的所述脂連蛋白值對所述患者進一步分類；其中d)如果所述脂連蛋白值小于脂連蛋白臨界值，則預(yù)測所述患者為無反應(yīng)者，并且如果脂連蛋白值大于或等于臨界值，則將所述患者分類為被預(yù)測對TNFa中和治療劑有反應(yīng)者ο
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述樣品是血清。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中將血清中所述VEGF濃度進行對數(shù)變換并且所述 VEGF臨界值是約8. 08。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中將血清中前列腺酸性磷酸酶的濃度進行對數(shù)變換并且所述前列腺酸性磷酸酶臨界值是2.四。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中將血清中脂連蛋白的濃度進行對數(shù)變換并且所述脂連蛋白臨界值是1.35。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述測定步驟同時進行。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述測定步驟由計算機輔助裝置執(zhí)行。
17.一種基于計算機的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)將預(yù)測算法應(yīng)用于從銀屑病關(guān)節(jié)炎患者獲得的數(shù)據(jù)集，所述銀屑病關(guān)節(jié)炎患者有待用抗TNF α治療劑治療并且在治療后使用一個或多個臨床終點進行評估，所述系統(tǒng)包括用于接收并處理計算機可讀格式的患者數(shù)據(jù)集的計算站，所述計算站包括用于處理所述患者數(shù)據(jù)集并且產(chǎn)生輸出分類的受訓神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，其中所述受訓神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通過用于預(yù)處理患者數(shù)據(jù)集的方法訓練，所述方法還包括a)選擇與PsA相關(guān)的患者生物標記物，b)基于臨床終點以統(tǒng)計和/或計算方式檢驗所選擇的患者生物標記物各自在線性和/ 或非線性組合下指示患者有反應(yīng)或無反應(yīng)的辨別能力，c)將用于推導(dǎo)二次輸入的統(tǒng)計學方法應(yīng)用于所述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，所述二次輸入是原初或變換的所述生物標記物的線性或非線性組合，d)僅選擇那些表現(xiàn)出辨別能力的患者生物標記物或推導(dǎo)的二次輸入；以及e)使用預(yù)處理的所述患者生物標記物或推導(dǎo)的二次輸入，訓練基于計算機的所述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的基于計算機的系統(tǒng)，其中所述輸出分類是所述患者是否會對抗TNF α療法有反應(yīng)或無反應(yīng)，并且所述臨床終點是ACR20 JsARC、或DAS28，并且所述生物標記物是脂連蛋白、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、MDC、SGOT、VEGF、脂蛋白A和β _2_微球蛋白中的至少二者。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的基于計算機的系統(tǒng)，其中，另外還測量基線脫氧吡啶啉、 S-100、透明質(zhì)酸、骨堿性磷酸酶α-1-抗胰蛋白酶中的至少一者的水平；并測量來自診斷患有 I3SA 的患者的樣品中 CRP、ENRAGE、結(jié)合珠蛋白、ICAM-I、IL-16、IL-18、IL-lra, IL-8、 MCP-U MIP-I β、ΜΜΡ-3、綠過氧物酶、血清淀粉樣蛋白P、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、TNFRII和 VEGF從基線至第4周水平的變化，并且用于所述預(yù)測中。
20.一種裝置，所述裝置用于預(yù)測有待用抗TNFa治療劑治療的銀屑病關(guān)節(jié)炎患者是否會對治療有反應(yīng)或無反應(yīng)，所述反應(yīng)通過一個或多個臨床終點評估，所述裝置包括a)測試條，所述測試條包含針對與PsA患者對抗TNFα療法有反應(yīng)或無反應(yīng)相關(guān)的標記物特異的抗體和用可檢測標簽標記的第二抗體，所述標記物選自脂連蛋白、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、MCD、SGOT, VEGF、脂蛋白A和β -2-微球蛋白；b)使用能夠處理所述信號的讀出器檢測所述標簽產(chǎn)生的所述信號；以及c)將得自所述信號的處理的所述數(shù)據(jù)處理成結(jié)果，所述結(jié)果指示所述標記物在所述樣品中的預(yù)定濃度。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的裝置，其中所述讀出器是人。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，其中所述讀出器是反射計。
23.一種用于預(yù)測有待用抗TNF α治療劑治療的被診斷為患有銀屑病關(guān)節(jié)炎的患者是否會對治療有反應(yīng)或無反應(yīng)的預(yù)后檢測套盒，所述反應(yīng)通過一個或多個臨床終點評價，所述預(yù)后檢測套盒包括制備的底物，所述底物能夠?qū)⒒颊邩悠分羞x自脂連蛋白、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、MCD、SGOT, VEGF、脂蛋白A和β -2-微球蛋白的一種或多種標記物的存在量化。
全文摘要
本發(fā)明提供用于尤其在用抗TNFα劑治療開始之前管理診斷患有銀屑病關(guān)節(jié)炎的患者的工具。所述工具是特定的標記物和算法，其中使用血清標記物濃度，所述標記物和算法基于標準臨床主要和次要終點預(yù)測治療反應(yīng)。在一個實施例中，使用VEGF、前列腺酸性磷酸酶和脂連蛋白的基線水平來預(yù)測治療開始后在第14周的反應(yīng)。在另一個實施例中，使用治療4周后血清蛋白質(zhì)生物標記物(如MDC、脂蛋白a和β2-微球蛋白)的變化。
文檔編號G01N33/53GK102576015SQ201080044717
公開日2012年7月11日 申請日期2010年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日
發(fā)明者C·沃納, S·維斯瓦納桑 申請人:詹森生物科技公司