專利名稱：基于黑麥est序列的黑麥1r和6r染色體特異的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和遺傳育種領域，具體涉及基于黑麥表達序列標簽(expressed sequence tag, EST)序列設計的分子標記，以及這些分子標記在跟蹤檢測黑麥染色體方面的應用。
背景技術：
小麥的近緣種黑麥(Secale cereale L.)具有許多優(yōu)良的性狀，如根系發(fā)達、分蘗強、抗旱、耐瘠薄、耐寒、耐鹽堿和酸性土壤，尤其是抗多種病害，如小麥白粉病(Blumeriagraminis f. sp. tritici)、條鎊病(Puccinia graminis f. sp. tritici)、葉鎊病(P. triticina Eriks.)、桿鎊病(P. graminis Pers. f. sp. tritici)> 渥黑穗病(TilletiaControversaKuhn, TCK)和大麥黃矮病(Barley yellow dwarf virus, BYDV)等。因此，黑麥是對小麥進行遺傳改良，拓寬小麥遺傳基礎，增加小麥栽培品種遺傳變異的重要基因源。黑麥優(yōu)異基因向小麥中轉移的途徑主要是創(chuàng)制一系列小麥/黑麥雙二倍體、附加系、代換系和易位系。通過遠緣雜交和染色體工程等手段將黑麥染色體導入到小麥背景中，之后，還需要對其進行準確的鑒定，才能有效地加以利用。與細胞學技術和生化標記法相比，分子標記法簡單、快速和準確的特點使其廣泛地用于檢測、跟蹤導入小麥背景中的黑麥染色體。然而，目前開發(fā)的黑麥染色體的特異標記，多集中在黑麥的IRS染色體上，如 SSR 標記 Bmac0213 (參考文獻Schneider A and Molnar-Lang Μ. 2008. Polymorphismanalysis usingIRS-specific molecular markers in rye cultivars(Secale cerealeL. )ofvarious origin. Cereal Res Commun, 36:11-19)；SSAP 標記 S10, S20，S17 (參考文獻:Nagy ED and Lelley T.2003. Genetic and physicalmapping of sequencespecific amplified polymorphic (SSAP)markers onthe IRS chromosome arm in awheat background. Theor Appl Genet, 107:1271-1277) ;EST_STS 標記 STSwe3 和 STSwel26(參考文獻Wang CM, Li LH, Zhang XT, Gao Q, Wang RF, and An DG. 2009. Developmentandapplication of EST-STS markers specific to chromosome IRS of Secalecereale.Cereal Research Communications 37:13-21)等。Zhuang 等(2008)報道了 1R,4R，5R 和 7R 染色體特異的 EST-SSR 標記(參考文獻Zhuang LF, Song LX, Feng YG, QianBL, Xu HB, Pei ZY, Qi ZJ.2008. Development and chromosome mapping of new wheatEST-SSRmarkers and application for characterizing rye chromosomes addedinwheat. Acta Agron Sin, 34:926-933)。Lee 等(2009)還報道了 6 個 2RL 染色體特異的 EST 標記(參考文獻Lee TG, Hong MJ, Johnson Jff, Bland DE, Kim DY, Seo Yff. 2009.Development and functionalassessment of EST—derived 2RL_specific markers for2BS. 2RLtranslocations. Theor Appl Genet, 119:663-673)。然而，到目前為止，還沒有人報道來源于黑麥表達序列標簽(EST)序列的一套完整的黑麥IR 7R染色體特異的分子標記，以用來檢測鑒定小麥背景中的IR 7R全部黑麥染色體。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一套基于黑麥EST序列的黑麥IR 7R染色體特異的分子標記，基于黑麥染色體上的EST序列設計開發(fā)出了一套黑麥染色體的特異分子標記，借助這些分子標記能夠用普通PCR技術快速、準確的鑒定小麥遺傳背景中的IR 7R全部黑麥染色體，為黑麥染色體上有益基因轉移到栽培小麥背景中提供了簡便有效的分子鑒定方法。
為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案是基于黑麥EST序列的黑麥IR 7R染色體特異的分子標記，這些分子標記為根據(jù)黑麥染色體上的EST序列而設計的正向引物和反向引物，這些分子標記為用于鑒定黑麥IR 7R染色體的特異標記，其堿基序列見表1，表I.根據(jù)黑麥染色體上的EST序列設計的14對標記引物序列
權利要求
1.基于黑麥EST序列的黑麥IR和6R染色體特異的分子標記，其特征在于該分子標記為根據(jù)黑麥染色體上的表達序列標簽EST序列設計的正向引物和反向引物，該分子標記為用于鑒定黑麥IR和6R染色體的特異標記，其名稱為1-CGG143，其正向引物序列見SEQIDNO :1，其反向引物序列見SEQ ID NO 20
2.應用權利要求I所述的分子標記對小麥背景中的黑麥IR和6R染色體進行鑒定的方法，其特征步驟包括 A、分子標記的選定和制備根據(jù)權利要求I給出的序列合成此標記引物； B、標記引物的稀釋將上步合成的標記引物，先用IXTE緩沖液溶解成100μ mol Γ1的母液放入_20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超純水稀釋成10 μ mol Γ1的工作液待用；其中 IXTE 緩沖液的配方為，IOmmol T1Tris-HCl 與 lmmol T1EDTA, pH=8. O ； C、黑麥染色體的特異標記 C-I、模板DNA的提取取待測物——小麥與黑麥遠緣雜交后代材料，對照物O——不包含待測黑麥染色體的樣品，對照物I——包含待測黑麥染色體的樣品，然后利用常規(guī)DNA提取方法分別提取三者的DNA ； C-2、PCR擴增以C-I所得DNA樣品為模板，利用步驟B所得工作液在PCR擴增儀中分別對待測物、對照物O及對照物I進行擴增； C-3、擴增產物的檢測非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟C-2所得的擴增產物，用銀染法進行染色，并在凝膠成像儀上照相； C-4、結果比對將待測遠緣雜交后代材料的電泳圖譜分別與對照物O、對照物I的電泳圖譜進行比對，如果待測遠緣雜交后代材料和對照物I的電泳圖譜均有特異擴增片段，說明遠緣雜交后代材料中含有待測黑麥染色體；如果待測遠緣雜交后代材料的電泳圖譜與對照物O的電泳圖譜一致，均不含有特異擴增片段，說明遠緣雜交后代材料中不含有待測黑麥染色體。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于步驟C-2中對所述待測物、對照物O及對照物I的DNA模板進行擴增的具體操作為，在體積為O. 2ml的Eppendof管中依次加入30ng的模板 DNA, IXPCRbuffer, I. 5_1 [1MgCl2, 200_1 ΓΜΝΤΡ，正、反向引物各 O. 2 μ molL'O. 5U Taq DNA聚合酶，最后用無菌超純水補充反應體系至10 μ 1，然后將Eppendof管放在GeneAmp9700基因擴增儀上進行擴增反應。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述擴增反應的具體程序為，先94°C預變性5min ;然后94°C變性Imin,根據(jù)標記引物的退火溫度退火lmin,72°C延伸Imin,循環(huán)38次；最后72°C延伸10min，10°C保存；標記引物的退火溫度為50°C。
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于步驟C-3中所述擴增產物的檢測方法具體為，在步驟C-2所得的擴增產物中加入上樣緩沖液2 μ 1，混勻之后取3 μ 1，用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳電壓為150 180V，電泳I 2h。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于黑麥EST序列的黑麥1R和6R染色體特異的分子標記，該分子標記為根據(jù)黑麥染色體上的表達序列標簽而設計的正向引物和反向引物，該分子標記為用于鑒定黑麥1R和6R染色體的特異標記；應用該分子標記對黑麥1R和6R染色體進行鑒定的基本步驟包括A.標記引物的選定和制備；B.標記引物的稀釋；C.黑麥染色體的特異標記C-1.模板DNA的提取；C-2.PCR擴增；C-3.擴增產物的檢測；C-4.結果比對。借助本發(fā)明的分子標記能夠用普通PCR技術快速、準確的鑒定小麥遺傳背景中的1R和6R黑麥染色體，為黑麥染色體上有益基因轉移到栽培小麥背景中提供了簡便有效的分子鑒定方法。
文檔編號C12Q1/68GK102925438SQ20121047907
公開日2013年2月13日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權日2011年4月14日
發(fā)明者安調過, 尹冬冬, 許紅星, 李立會 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所