專利名稱：一種重組菌絲霉素及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組菌絲霉素及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
近年來(lái)由于經(jīng)濟(jì)與利益的驅(qū)使，濫用抗生素和超標(biāo)使用抗生素的現(xiàn)象普遍存在。隨著抗生素廣泛而長(zhǎng)期的使用，其負(fù)面作用日益凸顯，細(xì)菌的耐藥性與藥物殘留嚴(yán)重威脅著人類健康，尋求抗生素替代品勢(shì)在必行。我國(guó)現(xiàn)已開(kāi)發(fā)了抗菌肽、益生素、糖萜素、低聚糖、中草藥、酶制劑、酸化劑等綠色添加劑以替代抗生素?？咕氖撬拗髅庖呦到y(tǒng)產(chǎn)生的一類非特異性的抵抗外界病原體感染的免疫應(yīng)答 產(chǎn)物，廣泛存在于昆蟲、植物、動(dòng)物及人體內(nèi)?？咕囊蚱浞N類多，來(lái)源安全，抗菌活性高，抗菌譜廣，靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因，被認(rèn)為是替代抗生素的理想藥物。菌絲霉素是從腐生子囊菌假黑盤菌(Pseudoplectania nigrella)分泌的一種抗菌肽，又稱假黑盤菌抗菌肽，由于其獨(dú)特的殺菌機(jī)制，使菌絲霉素具有細(xì)胞毒性和溶血性等危害，具有很大的藥用潛力。然而，假黑盤菌中菌絲霉素的表達(dá)量低、分子小，分離困難，化學(xué)合成菌絲霉素成本高，所以利用分子生物學(xué)技術(shù)重組表達(dá)外源基因是獲取目標(biāo)蛋白的有效途徑。申請(qǐng)?zhí)?01010115167. 4，發(fā)明名稱一種菌絲霉素基因及其原核融合基因工程菌的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種重組菌絲霉素的制備方法及應(yīng)用，該菌絲霉素的分子量為4401. 9Da，其核苷酸編碼序列如該申請(qǐng)中SEQ ID NO. I所示。管韜等，“菌絲霉素的串聯(lián)表達(dá)及其菌內(nèi)抑菌活性分析”，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43 (4):620-626公開(kāi)了重組菌絲霉素的串聯(lián)表達(dá)菌株，表達(dá)的融合蛋白的分子量為30、35和40KD，核苷酸編碼序列的大小為135、261和387bp。王楠，“假黑盤菌素和T4溶菌酶微生物高效表達(dá)系統(tǒng)的建立”，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文，2010年10期公開(kāi)了在畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)和生產(chǎn)重組菌絲霉素的方法，其制備得到的穩(wěn)定表達(dá)重組菌絲霉素的工程菌株P(guān)lel，在發(fā)酵條件優(yōu)化的前提下，中試規(guī)模(50L發(fā)酵體系)時(shí),重組菌絲霉素的表達(dá)量?jī)H為O. 14g/L,即140μ g/ml?，F(xiàn)有技術(shù)中，研究者用不同的基因工程方法表達(dá)得到了重組菌絲霉素，但是表達(dá)水平均較低，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的重組抗菌肽一重組菌絲霉素，以及編碼該重組抗菌肽的核苷酸序列，包含該核苷酸序列的重組載體、工程菌，還提供了該重組抗菌肽的制備方法和用途。本發(fā)明重組抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述重組抗菌肽的其核苷酸編碼序列如SEQ ID NO. 2。本發(fā)明SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。本發(fā)明重組載體，它包括SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。所述的重組載體優(yōu)選為pET30a重組載體。本發(fā)明重組菌，它包括前述的重組載體。所述重組菌優(yōu)選為重組大腸桿菌。本發(fā)明重組菌絲霉素的制備方法，它包括如下步驟( I)取前述重組菌，在大腸桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，離心，得菌體和發(fā)酵上清液；(2)取步驟(I)所得菌體裂解，離心，得裂解上清液，與步驟(I)所得發(fā)酵上清液合并，分離純化，即得。優(yōu)選地，所述步驟(I)中，大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，培養(yǎng)的條件是37°C、pH6.0、300r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為3 18h，誘導(dǎo)表達(dá)使用的誘導(dǎo)劑是濃度為1.0M的IPTG0進(jìn)一步優(yōu)選地，所述培養(yǎng)時(shí)間為10h。
優(yōu)選地,步驟(2)所述分離純化采用GSTrap FF柱層析。本發(fā)明最后提供了前述重組抗菌肽在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明從天然菌絲霉素出發(fā)，用基因工程的方法制備得到了重組抗菌肽，該重組抗菌肽抗菌活性高，為臨床抗菌藥物提供了一種新的選擇，并且，且本發(fā)明重組抗菌肽的制備方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高，是現(xiàn)有重組菌絲霉素產(chǎn)量的12. 8倍以上，經(jīng)濟(jì)效益巨大，工業(yè)應(yīng)用前景良好。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖I質(zhì)粒pMD19-T-AP2雙酶切結(jié)果，MiDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000) ;1 :質(zhì)粒PMD19-T-AP2酶切鑒定結(jié)果；2 :質(zhì)粒pMD19_T_AP2酶切鑒定結(jié)果；圖2重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a_AP2酶切鑒定結(jié)果，MiDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；(DL4500) ；1 pET30a-AP2酶切鑒定結(jié)果；2 pET30a-AP2酶切鑒定結(jié)果；圖3本發(fā)明工程菌鑒定結(jié)果，M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL10000) ；1 :工程菌的質(zhì)粒酶切
鑒定結(jié)果;圖4本發(fā)明重組抗菌肽的表達(dá)與純化，M:Protein marker; 1，2: 二聚體重組菌細(xì)胞總蛋白；3: 二聚體抗菌肽純化結(jié)果；圖5重組大腸桿菌30L誘導(dǎo)培養(yǎng)下菌體增殖與抗菌肽生產(chǎn)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和蒸餾水；GSTrap FF 柱層析，市售。菌絲霉素由上海吉爾生化使用Apex 396多肽合成儀及固相合成法合成，氨基酸序列與天然菌絲霉素序列一致，抗菌效果與天然的菌絲霉素相同。
實(shí)施例I本發(fā)明重組抗菌肽的制備一、重組抗菌肽基因工程菌的構(gòu)建I、目標(biāo)基因片段的克隆(I)假黑盤菌(P. nigrella)總 RNA 提取采用Takara 公司 RNAiso Plus 總 RNA 提取試劑盒(D9108A).(2)用RT-PCR及定點(diǎn)突變技術(shù)擴(kuò)增出菌絲霉素編碼序列，引物 (下劃線為酶切位點(diǎn)，斜體部分為突變堿基)和反應(yīng)條件如下正向引物(F):5，-GAATTCGGATCCATTGAAGGCCGCGGCTTTGGCTGCAATGGC-3，反向引物(R):5，-AGCGGCCGCGTCGACTTAATAGCATTTGCACACAAAGCCGCCTTTCGCGCAATAGCC-3，反應(yīng)條件為
94 '.'C4 min
94 V40 s59 C50 s L 35 cycles
72 V.Imin J
72 0CIOmin(3) DNA片段回收割取含目的基因的膠條，用小量柱式凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收；(4) 二聚體克隆質(zhì)粒的構(gòu)建將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制酶酶切后進(jìn)行DNA連接反應(yīng)，得T載體,條件如下
反應(yīng)組分組分含量
pMD19-T Simple0.5 μL VectorAP(抗菌肽)片段4.5卟
Ligation Mix5.0 μL
Toni10.0 ^iL檢測(cè)取T載體，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。電泳結(jié)果如圖I所示，得到含有大小為267bp的目的基因片段AP2 ;根據(jù)測(cè)序譜圖，讀出目的基因片段的序列如SEQ ID NO. 2所示。2、構(gòu)建重組表達(dá)載體含目的基因AP2 (P. nigrella抗菌肽基因)的T克隆載體與表達(dá)載體ρΕΤ30 α均用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切；酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后回收備用(膠回收純化試劑盒，購(gòu)自天根生物公司)。雙酶切體系如下
權(quán)利要求
1.一種重組抗菌肽，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組抗菌肽，其特征在于其核苷酸編碼序列如SEQID NO. 2所示。
3.SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
4.一種重組載體，其特征在于它包括SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于它是重組pET30a載體。
6.一種重組菌，其特征在于它包括權(quán)利要求4或5所述的重組載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于它為重組大腸桿菌。
8.一種制備權(quán)利要求I或2所述重組抗菌肽方法，其特征在于它包括如下步驟 (1)取權(quán)利要求6或7所述的重組菌，在大腸桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，離心，得菌體和發(fā)酵上清液； (2)取步驟(I)所得菌體，裂解，離心，得裂解上清液，與步驟(I)所得發(fā)酵上清液合并，分離純化，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，培養(yǎng)的條件是37°C、pH6. 0、300r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為3 18h，誘導(dǎo)表達(dá)使用的誘導(dǎo)劑是濃度為I. OM的IPTG。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)時(shí)間為10h。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，分離純化采用GSTrapFF柱層析。
12.權(quán)利要求I或2所述的重組抗菌肽在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；本發(fā)明公開(kāi)了編碼該重組抗菌肽的核苷酸序列，以及包含該核苷酸序列的重組載體和重組菌，以及該重組抗菌肽的制備方法和抗菌用途。本發(fā)明重組抗菌肽抗菌活性強(qiáng)，制備重組抗菌肽的方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102898512SQ201210447668
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者何軍, 陳代文, 余冰, 鄭萍, 毛湘冰 申請(qǐng)人:何軍