專利名稱：一種高粱抗草甘膦5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)和植物遺傳工程學(xué)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及修飾以抗草甘膦的I型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶。使用植物遺傳工程學(xué)方法修飾I型5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶DNA和其編碼的蛋白，并將這些分子轉(zhuǎn)入農(nóng)藝學(xué)重要的植物中。更具體的說，本發(fā)明包含來源于高粱的抗草甘膦的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的DNA和蛋白組合物，以及含有這些組合物的玉米組織,含有這些組合物的玉米對草甘膦具有耐受性，方便農(nóng)田中的雜草清除。本發(fā)明可以運用于玉米的育種、玉米細胞培養(yǎng)的篩選。
背景技術(shù)：
N-膦酰甲基甘氨酸，也稱草甘膦，是使用最為廣泛的廣譜除草劑，具有對人畜無毒，自然條件下雜草和農(nóng)作物難以對其產(chǎn)生抗性，低土壤殘留量、易于被微生物分解等特點，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，成為目前世界上生產(chǎn)量最大的除草劑品種。然而由于草甘膦無選擇性的殺死雜草和作物，限制了其只能在作物出苗前或非作物種植區(qū)使用，這便制約了其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。為了獲得抗草甘膦作物，從上世紀80年代，人們便開始培育抗草甘膦農(nóng)作物，其中最成功的例子是將改良的草甘膦靶標酶EPSP合酶導(dǎo)入植物中，以提高轉(zhuǎn)基因植物對草甘膦的抗性。草甘膦是通過抑制芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，該酶催化莽草酸代謝途徑倒數(shù)第二個反應(yīng)。正常情況下EPSPS催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與3-磷酸莽草酸(S3P)反應(yīng)生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和無機磷。由于草甘膦與PEP結(jié)構(gòu)相似，在植物和微生物體內(nèi)可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦復(fù)合物，阻截PEP與酶的結(jié)合，從而阻斷芳香族氨基酸的合成。該酶只在植物和微生物中存在，在動物體中不存在。在一些極端環(huán)境下，如長期噴灑草甘膦的農(nóng)田、草甘膦工廠的廢液池以及人為的加大對某植株草甘膦的選擇壓力等，發(fā)現(xiàn)了部分對草甘膦具有耐受能力的細菌和植物。如Amrhein等人通過逐漸增加草甘膦的濃度，分離到一個耐受草甘膦的矮牽牛細胞系；Baers0n等人在長期噴灑草甘膦的果園中發(fā)現(xiàn)了一株耐受草甘膦的牛筋草，經(jīng)過后期實驗證明這些抗性的產(chǎn)生均為EPSPS基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致了其與草甘膦的結(jié)合能力降低，并且保證了正常的催化能力。植物可以通過轉(zhuǎn)化對草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而獲得抗草甘膦的能力。根癌農(nóng)桿菌CP4、突光假單胞菌G2和Salmonella typhimuriumCT7的EPSPS已經(jīng)在植物中得到廣泛的驗證和應(yīng)用。在某些植物和某些細菌中發(fā)現(xiàn)的I型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)對草甘膦具有抗性。在植物中草甘膦的抗性可以通過表達與草甘膦具有較低親和力的修飾I型EPSPS而獲得，存在草甘膦時此酶也仍然保持其催化活性(ZL200480009843和ZL200380105147)。植物對草甘膦耐受或?qū)Σ莞熟⒕哂锌剐允侵赣貌莞熟⒊輨﹪娛┲参锖螅参锟梢哉ＩL發(fā)育。
現(xiàn)已被確定EPSP合成酶分為兩個家族(Ming He等2001)，家族I包括來源于大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的EPSP合成酶；家族II包括來源于根癌農(nóng)桿菌CP4、無色桿菌LBAA、假單胞菌PG2982。家族II的EPSP合成酶多克隆抗體與家族I的EPSP合成酶不發(fā)生交叉反應(yīng)，且兩者間的氨基酸同源性低于50%。在天然的植物EPSPS基因中，葉綠體轉(zhuǎn)運肽區(qū)域包含在天然的編碼序列中(例如CTP2, Klee 等，Mol. Gen. Genet. 210 :47-442,1987)，CTP 在葉綠體膜上從 EPSPS 酶上裂解下來，產(chǎn)生成熟的EPSPS。葉綠體轉(zhuǎn)運肽對EPSPS酶行使正常功能是必須的，在蛋白結(jié)構(gòu)及功能一致的前提下，如果去掉信號肽，雖然整個植物組織EPSPS蛋白表達量一致，但是植株確不具有草甘膦抗性，不同來源的信號肽對EPSPS蛋白在不同轉(zhuǎn)化受體中行使功能的效率存在差異(Guy della Cioppal988, Guy della Cioppal986)。耐除草劑農(nóng)作物的開發(fā)已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的主要突破，為農(nóng)場主提供了新的雜草防除方法。一種成功被設(shè)計為耐受抑制劑除草劑的酶是I型EPSPS。國內(nèi)外已經(jīng)分離了大量抗草甘膦的 I 型 EPSPS 變體(Pro-Ser, US4769061 ；Gly-Ala, US4971908 ；Gly-Ala,Gly-Asp，美國專利 5310667 ;Gly-Ala、Ala_Thr，US58866775)。然而許多 EPSPS 變體不能表現(xiàn)對草甘膦有足夠高的Ki，或者對磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km太高而不能有效的作為草甘膦抗性酶在植物中使用(padgette等，“Herbicide-resistant Crop”中，4章53-83頁，Stephen Duke 編,Lewis Pub, CRC Press Boca Raton, F11996)。一種成功耐受草甘勝的EPSPS變體，不單單取決于變化發(fā)生的位點，還取決于變體的來源，目前商品化最為廣泛的CP4EPSPS來源于農(nóng)桿菌CP4菌株，其變化的位點在第100位的Ala轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly，而將大腸桿菌或肺炎鏈球菌相應(yīng)的Ala轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly確不能賦予EPSPS變體草甘膦抗性(Eschenburg，
S.等2002 ;Sost，D.等1990 ；Todd Funke等2006)。由此可見選擇恰當(dāng)來源的EPSPS進行相應(yīng)位點的改變，獲得對草甘膦具有足夠抗性的EPSPS蛋白起到關(guān)鍵的作用。目前國內(nèi)外雖然獲得了大量對草甘膦具有一定抗性的EPSPS變體，然而能夠應(yīng)用到生產(chǎn)中的確非常少，主要原因在于沒有選擇合適來源的EPSPS變體，而達不到生產(chǎn)的要求(Zhou Min等2002，Sun Yicheng 等 2005)。在植物分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)需要可提供陽性選擇標記表型的各種基因。具體地說，草甘膦耐受可在植物中廣泛地用作陽性選擇標記，并且用在農(nóng)作物生產(chǎn)中是很有價值的表型。當(dāng)使用不同的陽性選擇標記基因時，擴展了現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因性狀與新開發(fā)性狀的堆積和組合。標記基因提供了不同的表型如抗生素或草甘膦耐受，或者通過DNA檢測方法可區(qū)別的分子差異。通過多重抗生素或除草劑耐受分析，或通過DNA檢測方法檢測新型DNA分子的存在，可以篩選疊加性狀的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明提供了抗草甘膦變體I型EPSP合酶的DNA和蛋白組合物。本發(fā)明也提供了用于植物的DNA構(gòu)建和展示草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供了分離后修飾的高粱EPSPS DNA分子，它編碼的耐受草甘膦的EPSPS蛋白在60位為天冬酰胺、71位為纈氨酸、106位具有絲氨酸、161位為異亮氨酸、313位為谷氨酰胺、345位為天冬酰胺。本發(fā)明的另一方面是包含啟動子的DNA構(gòu)建物，此啟動子在植物細胞中有功能，有效與修飾的高粱EPSPS DNA分子連接，該修飾EPSPS DNA分子編碼的耐受草甘膦的EPSPS蛋白在60位為天冬酰胺、71位為纈氨酸、106位具有絲氨酸、161位為異亮氨酸、313位為谷氨酰胺、345位為天冬酰胺。本發(fā)明的又一方面提供了包含DNA構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因玉米，其中此轉(zhuǎn)基因玉米耐受草甘膦除草劑，耐受能力達到1200克/畝。本發(fā)明的另一方面是一個制備轉(zhuǎn)基因玉米的方法，包括提供具有修飾高粱EPSPS基因的植物表達載體，該修飾高粱EPSPS基因編碼的耐受草甘膦的EPSPS蛋白在60位為天冬酰胺、71位為纈氨酸、106位具有絲氨酸、161位為異亮氨酸、313位為谷氨酰胺、345位為天冬酰胺；在允許植物表達載體能被受體玉米細胞攝取的條件下，將受體玉米細胞與植 物表達載體接觸；選擇包含植物表達載體的受體玉米細胞；從選擇的受體玉米細胞再生植物；鑒定耐受草甘膦的轉(zhuǎn)基因玉米。本發(fā)明的另一方面是可育的草甘膦耐受的轉(zhuǎn)基因玉米，它包含具有修飾高粱EPSPS基因的植物表達載體，該修飾高粱EPSPS基因編碼的耐受草甘膦的EPSPS蛋白在60位為天冬酰胺、71位為纈氨酸、106位具有絲氨酸、161位為異亮氨酸、313位為谷氨酰胺、345位為天冬酰胺；將此轉(zhuǎn)基因玉米與其他玉米雜交，以提供耐受草甘膦的子代玉米。本發(fā)明的另一方面提供了在玉米田地中雜草防除的方法，其中玉米田地用有效量的含草甘膦除草劑處理，并且田間玉米包含具有修飾EPSPS基因的植物表達載體，該修飾EPSPS基因編碼的耐受草甘膦的EPSPS蛋白在60位為天冬酰胺、71位為纈氨酸、106位具有絲氨酸、161位為異亮氨酸、313位為谷氨酰胺、345位為天冬酰胺。附圖簡述圖I.修飾后高粱EPSPS基因的原核表達載體圖2.耐受草甘膦的牛筋草EPSPS植物表達載體圖3.耐受草甘膦的玉米EPSPS植株表達載體圖4.修飾后高粱EPSPS植物表達載體圖5.轉(zhuǎn)牛筋草耐草甘膦EPSPS基因的玉米檢測結(jié)果圖6.轉(zhuǎn)玉米耐草甘膦EPSPS基因的玉米檢測結(jié)果圖7.轉(zhuǎn)修飾后高粱EPSPS基因的玉米檢測結(jié)果圖8.轉(zhuǎn)牛筋草耐草甘膦EPSPS基因的玉米田間抗性鑒定結(jié)果圖9.轉(zhuǎn)玉米耐草甘膦EPSPS基因的玉米田間抗性鑒定結(jié)果

圖10.轉(zhuǎn)修飾后高粱EPSPS基因的玉米田間抗性鑒定結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體實施步驟參考(Sambrook 等人，分子克隆實驗指南，New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，所用術(shù)語和縮寫均是本領(lǐng)域技術(shù)人員通用的術(shù)語和縮寫。實施例I、高粱5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的定向誘變。I、定向誘變體的選擇—種成功耐受草甘膦的EPSPS變體，不單單取決于變化發(fā)生的位點，還取決于變體的來源，目前商品化最為廣泛的CP4EPSPS來源于農(nóng)桿菌CP4菌株，其變化的位點在第100位的Ala轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly，而將大腸桿菌或肺炎鏈球菌相應(yīng)的Ala轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly確不能賦予EPSPS變體草甘勝抗性(Eschenburg, S.等 2002 ；Sost, D.等 1990 ；Todd Funke 等 2006)。造成這種原因主要取決于兩點1、EPSPS變體對草甘膦的Ki是否足夠高，2、對磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km足夠低。玉米的EPSPS變體(P106S) SEQ ID NO 2雖然對磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km足夠低(Km-PEP = 17. 1±2·8μΜ)但對草甘膦的 Ki 卻不夠高(Ki-glyp = 1·0±0· I μ Μ)而達不到在生產(chǎn)上的應(yīng)用(ZL200480009843. 2)，牛筋草的EPSPS變體(P106S)SEQ ID NO:I對磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km足夠低(Km-PEP = 8. 9± I. O μ M)但對草甘膦的Ki卻不夠高(Ki-glyp = 1.04±0. 138 μ Μ)從而至今沒有相關(guān)應(yīng)用到實際生產(chǎn)中的報道(ScottR. BaersOn2002)。我們利用玉米和牛筋草的EPSPS變體(P106S)轉(zhuǎn)化玉米獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行田間鑒定時也驗證了上述結(jié)果。為此我們選擇了與玉米有一定親緣關(guān)系的高粱EPSPS基因作為誘變體，來驗證經(jīng)過誘變的高粱EPSPS基因在玉米中所表現(xiàn)的抗草甘膦效果O2、高粱EPSP合酶cDNA全長的克隆根據(jù)http://www. phytozome. net中高粱EPSP合酶的cDNA全序列，我們分析了該基因的結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果認為，高粱EPSPS基因5’端的62個氨基酸為葉綠體信號肽，第63個至第506個氨基酸為EPSPS功能區(qū)域。我們以高粱BTX623為材料，提取幼苗總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模版，5’ gaagcagacaaagttgccaaaaga 3’ 為上游引物、5’ATCCCGCTGCGTGGTAGTATATCAC 3’ 為下游引物擴增EPSPS部分功能域，同時人工合成EPSPS 5’端序列，將合成的序列與擴增序列分別連接，獲得修飾后高粱EPSPS基因(P106S)功能域的核苷酸序列，SEQ ID N0:5所示，我們將其命名為L38 ;修飾后高粱EPSPS基因(P106S)的核苷酸序列，SEQ ID N0:6所示，我們將其命名為CL38。RNA提取方法及RT-PCR參考分子克隆實驗指南(第三版)，核苷酸合成在北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行。對修飾后高粱EPSPS基因(P106S)功能域的氨基酸序列與耐草甘膦牛筋草EPSPS(P106S)及玉米EPSPS(P106S)的同源性分析結(jié)果顯示，其同源性分別為97%和99%。3、修飾后高粱EPSPS酶活性檢測正常情況下EPSPS催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與3_磷酸莽草酸(S3P)反應(yīng)生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和無機磷。由于草甘膦與PEP結(jié)構(gòu)相似，在植物和微生物體內(nèi)可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦復(fù)合物，阻截PEP與酶的結(jié)合，從而阻斷芳香族氨基酸的合成。耐草甘膦的EPSPS酶不僅需要其較野生型EPSPS酶對草甘膦有更高的Ki，這樣會賦予其耐受草甘膦的表型，同時一個耐受草甘膦的變體需要保持與野生型基本一致的對PEP的Km，保持其正常的酶動力學(xué)活性。為此我們構(gòu)建了原核表達載體，具體見圖I.修飾后高粱EPSPS基因(P106S)的原核表達載體，并轉(zhuǎn)化了 EPSPS缺陷型的大腸桿菌，體外驗證了高粱EPSPS變體的酶活，具體實驗流程參考Scott R. Baerson2002o實驗結(jié)果表明修飾后高粱EPSPS變體(P106S)較牛筋草及玉米的EPSPS變體(P106S)的Km值基本一致，而Ki確明細提高，Ki為120±28 μ Μ，明顯高于牛筋草的I. 04±0. 138 μ M和玉米的1.0±0. ΙμΜ。這表明高粱EPSPS變體更具有在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用前景，這主要取決于野生型高粱EPSPS酶的結(jié)構(gòu)總體特征。實施例2、修飾后高粱EPSPS植物表達載體的構(gòu)建我們將SEQ ID NO 6序列的5，端添加了 BglII的酶切位點，3，端添加了 KpnI的酶切位點，利用BglII、KpnI消化T-easy+CL38，回收CL38目標片段。通過已有的植物表達載體pHM102，分別用BamHI、Kpnl消化pHM102，由于BamHI與BglII酶切后產(chǎn)生的粘性末端相同，因此可以進行連接，將兩個片段連接，得到修飾后高粱EPSPS(P106S)的植物表達載體，命名為PHM-CL38，具體見圖4.修飾后高粱EPSPS植物表達載體。我們利用相同的方法分別構(gòu)建了牛筋草、玉米的EPSPS變體的植物表達載體，具體見圖2.耐受草甘膦的牛筋草EPSPS植物表達載體，命名為pHM+Ei-EPSPS，圖3.耐受草甘膦的玉米EPSPS植株表達載體，命名為 pHM+Zm-EPSPS。實施例3、抗草甘膦基因CL38在玉米中的表達。I、轉(zhuǎn)抗草甘膦基因CL38玉米的獲得轉(zhuǎn)基因玉米的獲得方法為采用基因槍法將插入序列導(dǎo)入受體植株的愈傷組織，經(jīng)100mg/L的除草劑草甘膦篩選后獲得轉(zhuǎn)基因植株。具體方法為(I)、誘導(dǎo)II型愈傷組織a、去除苞葉切除果穗頂端約Icm左右，用鑷子從頂端插入果穗，這樣可以以鑷子當(dāng)作把手，有利與操作，然后把果穗放入含有消毒液的燒杯里，根據(jù)實際需要，可以在同一個燒杯里放4-6個果穗。b、向燒杯里加約700ml的消毒液(50%的漂白劑或5. 25%的次氯酸鈉，并加入一滴TWeen20)用來浸泡果穗，在消毒20分鐘過程當(dāng)中，不時的旋轉(zhuǎn)果穗同時輕輕拍打燒杯以驅(qū)除子粒表面的氣泡，從而達到最佳的消毒效果。消毒結(jié)束后，取出果穗并放入盛滿滅菌水的燒杯里，在水里洗3次，然后準備剝胚。C、把消過毒的果穗一端放在一個大的培養(yǎng)皿上，用大的手術(shù)刀削掉籽粒的頂部(l-2mm)，在這過程當(dāng)中，要勤消毒所用的工具，如手術(shù)刀片、培養(yǎng)皿、剝胚刀等。d、用剝胚刀的刀尖插在胚和胚乳之間，然后輕輕向上撬出幼胚，用小的手術(shù)刀尖輕輕托起幼胚，確保幼胚不受到任何的損傷，把幼胚的胚軸面緊貼放有濾紙的N6E培養(yǎng)基，胚的密度大約是2X2cm (20-25個/皿)。e、新鮮的幼胚大約I. 5-1. 8mm大小，放置在N6E培養(yǎng)基上面，每隔10_15天繼代一次，剛獲得的幼胚容易長出芽狀組織，這樣可以提早去掉該組織，而不用等到10-15天。f、挑選優(yōu)等II型愈傷第二次愈傷繼代時，II型愈傷已經(jīng)開始形成，其特征為顏色米黃，生長速度快，松散易碎，新生愈傷頂端呈現(xiàn)米粒狀顆粒?？梢愿鶕?jù)其特征來進行有針對性的挑選，可以把已經(jīng)分化出的II型愈傷分成麥粒狀大小，每皿(90cm)放20-25塊。g、為了保證愈傷的質(zhì)量，保證每次繼代的時間間隔不能超過15天，同時保證一直有400皿以上的II型愈傷，以便做基因槍轉(zhuǎn)化。(2)、金粉的準備和基因槍轟擊a、稱量15mg金粉并放入滅菌后的I. 5ml的eppendorf離心管當(dāng)中，這樣結(jié)果是IOX的量。b、在超凈臺下，向每個離心管中加入500ul冰凍(_20°C )無水乙醇，震蕩15sec，在超凈臺上收集金粉到離心管底部，靜置30min，直到金粉全部沉淀。C、然后轉(zhuǎn)速3000rpm離心60sec,徹底去除乙醇。再向離心管中加入冰浴的無菌ddH20,用手指輕彈混勻,然后轉(zhuǎn)速3000rpm離心60sec。重復(fù)上述步驟2_3次,最后一次用轉(zhuǎn)速5000rpm離心15sec，然后移去上清，再用500ulddH20懸浮。震蕩15sec，然后快速懸浮混勻，邊混邊分裝。
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d、具體的分裝方法是先把10個離心管放好，用25ul的量分裝，重復(fù)分裝兩次，第一遍從第一個管開始，第二遍從最后一個管開始，這樣每個離心管含有50ul水，I. 5mg金粉。然后蓋上蓋子于-20°C保存。e、上午先把要打槍的愈傷分成小塊，堆積在滲透培養(yǎng)基(N60SM)的中央?yún)^(qū)域，根據(jù)計劃做準備。f、目的DNA的包裹，先把分裝好的金粉(_20°C )(每管I. 5mg并保存在50微升超純水當(dāng)中)放在冰上，同時把CaCL2濃度為2. 5M(4°C )和亞精胺濃度為O. IM(-70°C )也放在冰上融化，其中CaCL2和亞精胺分裝成一次性使用的包裝。g、用手指輕輕彈裝有金粉的離心管使之懸浮起來，然后加入目的DNA^0_200ng)，迅速用手指輕彈使之混勻然后加入50微升CaCL2并用槍頭輕輕吸吐使之混勻,然后加入20微升亞精胺，靜置30秒把離心管放在漩渦振蕩器上面震蕩10分鐘(注意使旋渦液體不要上升太高，同時使液體全部懸浮起來)。h、離心管放到冰上靜置5分鐘(如果震蕩以后有金粉在液體表面漂浮，靜置前再用手指輕彈使之沉淀下來)，2000rpm離心15秒，然后用吸頭吸掉上清加入預(yù)冷(_20°C )的無水乙醇250微升，并用槍頭輕輕(20微升的槍調(diào)到10-13微升)吸吐混勻。重復(fù)以上步驟3-4次，然后加入無水乙醇120-140微升使之平均分成8份并加到宏載片上面開始基因槍轟擊。i、基因槍轟擊以后的1-12小時把愈傷倒至N6E培養(yǎng)基上進行恢復(fù)。(3)、轉(zhuǎn)基因植株的獲得a、在N6E培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織10_14天后，轉(zhuǎn)移到N6S(選擇培養(yǎng)基)上(2. Omg/Lbialaphos),開始選擇含有轉(zhuǎn)化子的細胞,然后用parafilm封口膜封培養(yǎng)皿。b、3周以后，把胚轉(zhuǎn)移到新鮮的N6S培養(yǎng)基上，大約6-8周，就會選到抗草胺膦的克隆。C、把II型愈傷組織每皿轉(zhuǎn)移15片(4mm/片)到再生培養(yǎng)基I上，25度暗培養(yǎng)2_3周，并用通風(fēng)帶封住培養(yǎng)皿。d、2_3周后，把成熟的胞質(zhì)胚轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基II上準備發(fā)芽，同時用通風(fēng)帶封住培養(yǎng)皿，植株將在這個培養(yǎng)基里長葉和根。e、移栽成活的轉(zhuǎn)化植株長出7-8葉時，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測外源基因，轉(zhuǎn)基因植株開花后套袋自交或姊妹交結(jié)實。種子播種在溫室，植株長到4-6葉期時取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測是帶有外源基因。牛筋草及玉米來源的EPSPS變體轉(zhuǎn)化方法同修飾后高粱EPSPS基因。2、轉(zhuǎn)基因植株的檢測根據(jù)修飾后高粱EPSPS (P106S)合酶基因序列和PHM102載體上的序列分別設(shè)計上游和下游引物，引物序列如下:CL38F 5 ’ CGTGGCGTCCTGGAGAGTAAAG 3，，CL38R :5’ CCAATACGCAAACCGCCTCT 3’分別提取通過上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，取O. Iyg基因組DNA為模板，分別在檢測引物F和檢測引物R的引導(dǎo)下，用PCR法鑒定外源基因CL38在基因組上的整合情況，反應(yīng)條件為95°C反應(yīng)5min，95°C反應(yīng)45s，59°C反應(yīng)45s，72°C反應(yīng)lmin，32個循環(huán)，72°C反應(yīng)10min，10°C保持。電泳PCR產(chǎn)物結(jié)果如圖7.轉(zhuǎn)修飾后高粱EPSPS基因的玉米檢測結(jié)果，結(jié)果表明不同的轉(zhuǎn)化事件均有目標基因的整合。
牛筋草EPSPS變體轉(zhuǎn)化玉米的檢測上游引物為5’ GTGGCTTCCTGGAGAGTAAAG 3’，下游引物為5’CCAATACGCAAACCGCCTCT 3’，檢測結(jié)果見圖5.轉(zhuǎn)牛筋草耐草甘膦EPSPS基因的玉米檢測結(jié)果。玉米EPSPS變體轉(zhuǎn)化玉米的檢測上游引物為5’GTGGCTTCCTGGAGAGTAAAG 3’，下游引物為5’CCAATACGCAAACCGCCTCT 3’，檢測結(jié)果見圖6.轉(zhuǎn)玉米耐草甘膦EPSPS基因的玉米檢測結(jié)果。泳道M為MarkerlV，泳道CK-為轉(zhuǎn)化有空載體的陰性對照，空為以ddH20為模版擴增結(jié)果，CK+為質(zhì)粒DNA陽性對照，泳道1-20為不同的轉(zhuǎn)化事件，可以擴增出800bp左右大小特異片段的即為含有SbEPSPS-L38基因的轉(zhuǎn)基因陽性植株，通過PCR結(jié)果可以看出1_20均為陽性植株。3、轉(zhuǎn)基因玉米田間草甘膦抗性檢測對獲得的轉(zhuǎn)基因植株噴施800ml/畝的商品化草甘膦，植株沒有藥害的條件下表明該轉(zhuǎn)基因植株擁有足夠的草甘膦抗性。我們對來源于高粱、玉米、牛筋草的EPSPS基因分別進行了誘變(P106S)，對誘變后的基因構(gòu)建了植物轉(zhuǎn)化載體并轉(zhuǎn)化了玉米，每個誘變體獲得了 20個轉(zhuǎn)化事件，通過對這些轉(zhuǎn)化事件田間抗性鑒定結(jié)果表明玉米及牛筋草來源的EPSPS變體在草甘膦耐受水平?jīng)]有超過800ml/畝，而高粱來源的EPSPS變體每個轉(zhuǎn)化事件草甘膦耐受能力均超過800ml/畝，具體見圖8.轉(zhuǎn)牛筋草耐草甘膦EPSPS基因的玉米田間抗性鑒定結(jié)果，圖9.轉(zhuǎn)玉米耐草甘膦EPSPS基因的玉米田間抗性鑒定結(jié)果，圖10.轉(zhuǎn)修飾后高粱EPSPS基因的玉米田間抗性鑒定結(jié)果，CK-為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，CK+為未噴施除草劑對照，1-5分別為不同的轉(zhuǎn)化事件噴施800ml/畝的草甘膦后的表現(xiàn)，這說明來源于高粱的誘變體更容易獲得有效的轉(zhuǎn)化事件，這主要取決于修飾后高粱EPSPS (P106S)酶對草甘膦有足夠高的Ki，并且對磷酸烯醇丙酮酸(PEP)較低的Km。
權(quán)利要求
1.一種從高粱(Sorghum bicolor)中分離的DNA分子,所述DNA分子編碼抗草甘膦EPSPS蛋白，其中所述抗草甘膦EPSPS蛋白包含多肽序列GTX1X2RS，其中X1、X2為任何氨基酸。
2.—種DNA構(gòu)建物，所述DNA構(gòu)建物包含啟動子，所述啟動子在植物細胞中發(fā)揮功能且有效地與編碼抗草甘膦EPSPS蛋白的DNA分子連接，其中所述抗草甘膦EPSPS蛋白為權(quán)利要求一種所述蛋白。
3.一種制備草甘膦耐受玉米的方法，所述方法包括以下步驟1)將接受植物細胞與權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建物接觸，其中所述DNA構(gòu)建物摻入接受玉米細胞的基因組；2)將接受玉米細胞再生為植株并繁衍后代；3)向所述玉米及其繁衍后代施用有效劑量的草甘膦，所述玉米及其繁衍后代展示出草甘膦耐受表型。
4.一種包含權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化玉米細胞。
5.一種在草甘膦耐受玉米的田地中控制雜草的方法，所述方法包括向所述草甘膦耐受玉米的田地施用有效劑量的含草甘膦除草劑，其中所述草甘膦耐受玉米包含權(quán)力要求2的DNA構(gòu)建物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高粱5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶變體，它較其他物種變體對其合成底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的競爭性抑制劑草甘膦表現(xiàn)出很高的耐受性。本發(fā)明也涉及利用該變體培育抗草甘膦玉米的應(yīng)用。
文檔編號C12N9/10GK102911950SQ201210406178
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者賴錦盛, 趙海銘, 宋偉彬 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)