專利名稱：：一種用于副溶血性弧菌分子分型的分子馬達(dá)生物傳感器試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于一種對(duì)副溶血性弧菌的致病性進(jìn)行快速分子分型判斷的試劑盒，具體地說是用試劑盒中的FtlF1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh>Chro-toxR對(duì)副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的種特異性基因tlh、toxR和毒力基因tdh、trh進(jìn)行檢測(cè),從而對(duì)V.parahaemolyticus是否具有致病性做出判斷。
背景技術(shù)：
：V.parahaemolyticus是沿海地區(qū)常見的一種食源性致病菌,可導(dǎo)致患者腹灣、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反應(yīng)。近年來，其引發(fā)的食物中毒的發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)。因此，V.parahaemolyticus的危害性不容忽視。盡管大多數(shù)的V.parahaemolyticus不會(huì)導(dǎo)致人類生病，但仍有一定特征的V.parahaemolyticus可以引起人類的疾病。已有研究表明，致病性的V.parahaemolyticus都能產(chǎn)生一種溶血素，即耐熱性溶血毒素(Thermostabledireethemolysin,TDH)或TDH相關(guān)溶血毒素(TDHrelatedhemolysin,TRH)或兩者都有，分別由tdh和trh基因編碼。分子流行病學(xué)證據(jù)支持tdh、trh與腸胃炎的關(guān)系,證明tdh、trh都是V.parahaemolyticus的毒力基因。因此，對(duì)這兩種基因的檢測(cè)研究對(duì)于了解V.parahaemolyticus的流行趨勢(shì)、預(yù)防與治療食物中毒具有重要意義。另外，不耐熱溶血素基因tlh及toxR普遍存在于臨床和環(huán)境中的V.parahaemolyticus中，很多研究將其作為檢測(cè)V.parahaemolyticus的種特異性基因。為了便于進(jìn)行臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、食品中微生物檢測(cè)及醫(yī)院感染監(jiān)控，微生物的分型與檢測(cè)研究是必不可少的內(nèi)容。目前，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及與流行病學(xué)的密切結(jié)合，分子分型技術(shù)以其敏感性高、特異性強(qiáng)、分型率和分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，在流行病學(xué)調(diào)查、食物中毒的預(yù)警和溯源、食源性疾病的診斷以及微生物的檢測(cè)等方面發(fā)揮了重要的作用，并逐步替代了傳統(tǒng)的生化分型和血清學(xué)分型技術(shù)，如重復(fù)序列PCR(rep-PCR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析技術(shù)(RAPD)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)、多位點(diǎn)序列分析(MLST)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)等。然而，上述方法操作起來都比較繁瑣，程序比較復(fù)雜。因此，在上述分子分型方法的優(yōu)點(diǎn)基礎(chǔ)上，開發(fā)一種操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉的分子分型方法將具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明以V.parahaemolyticus毒力基因tdh、trh和種特異性基因tlh、toxR為革巴基因設(shè)計(jì)4個(gè)探針，通過“ε亞基抗體-鏈霉素-生物素-探針”系統(tǒng)將探針與FtlF1-ATPase分子馬達(dá)連接構(gòu)建FtlF1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器，進(jìn)而與相應(yīng)輔助試劑配套構(gòu)建分子馬達(dá)生物傳感器分子分型試劑盒，對(duì)致病性V.parahaemolyticus進(jìn)行分型及檢測(cè)研究,從而建立致病性V.parahaemolyticus的分子馬達(dá)分子分型方法，為V.parahaemolyticus的快速分型和溯源提供技術(shù)基礎(chǔ)。本發(fā)明所米用的技術(shù)方案為以V.parahaemolyticus毒力基因tdh、trh和種特異性基因tlh、toxR為靶基因設(shè)計(jì)4個(gè)探針，首先將生物素標(biāo)記的ε亞基抗體結(jié)合在FtlF1-ATPase的ε亞基上，然后用鏈霉親和素(Sti^ptavidin)與ε亞基抗體上的生物素結(jié)合，最后將生物素標(biāo)記的探針與鏈霉親和素結(jié)合，構(gòu)建FtlF1APase分子馬達(dá)生物傳感器，對(duì)目標(biāo)V.parahaemolyticus的DNA進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)V.parahaemolyticus的致病性做出快速判斷。一方面，對(duì)種特異性基因tlh和toxR的檢測(cè)可以對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行鑒定；另一方面，對(duì)tdh和trh的檢測(cè)可以對(duì)目標(biāo)菌的致病性做出判斷。利用F0F1-ATPase作為載體對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。在FtlF1-ATPase分子馬達(dá)上連接特異的核酸探針，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因快速、高特異性、高通量的檢測(cè)。本發(fā)明涉及的V.parahaemolyticus的分子馬達(dá)生物傳感器分子分型試劑盒,包括以下試劑副溶血性弧菌分子分型試劑盒組成權(quán)利要求1.一種基于分子馬達(dá)生物傳感器技術(shù)的副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)分子分型試劑盒，其特征在于包括以下組分2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的V.parahaemolyticus的分子馬達(dá)生物傳感器分子分型試劑盒，其特征在于分子馬達(dá)生物傳感器的構(gòu)建，包括(1)載色體(Chromatophore)的制備從玫瑰紅嗜熱菌(Thermomicrobiumroseum)中提取載色體，F(xiàn)tlF1-ATPase存在于載色體上。FtlF1-ATPase—般由8個(gè)亞基組成，分別為α3β3γδεab2cn，是一種可旋轉(zhuǎn)分子馬達(dá)。(2)F-DHPE標(biāo)記載色體F-DHPE是一種脂染料探針，可以嵌入到磷脂分子層中。同時(shí)F-DHPE也是一種pH指示劑，將其嵌入磷脂雙分子層可以用來測(cè)量磷脂層外面的PH變化。在pH7.0-9.O范圍內(nèi)，F(xiàn)-DHPE的熒光強(qiáng)度與pH值呈正相關(guān)。本發(fā)明將F-DHPE標(biāo)記到分子馬達(dá)載色體磷脂分子層中用以指示FtlF1-ATPase合成ATP的效率。(3)生物素標(biāo)記ε亞基抗體用生物素(biotin-AC5-Sulfo_0s)標(biāo)記ε亞基抗體N端。(4)探針合成及標(biāo)記以V.parahaemolyticus種特異性基因tlh、tdh和毒力基因trh、toxR為模板設(shè)計(jì)探針，并用生物素(biotin-AC5-Sulfo-0s)標(biāo)記探針5’端。一方面，對(duì)種特異性基因tlh和toxR的檢測(cè)可以對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行鑒定；另一方面，對(duì)tdh和trh的檢測(cè)可以對(duì)目標(biāo)菌的致病性做出判斷。探針序列如下表V.parahaemolyticus毒力基因及種特異性基因探針序列3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的V.parahaemolyticus的分子馬達(dá)生物傳感器分子分型試劑盒，應(yīng)用其進(jìn)行分子分型，其特征是依次包括以下步驟(1)細(xì)菌的培養(yǎng)及DNA的提取(2)用分子馬達(dá)生物傳感器進(jìn)行分子分型①取4個(gè)I.5mLEP管，各加入待測(cè)樣本10μL。將EP管放入沸水浴中加熱3min，然后立即轉(zhuǎn)移到冰上至完全冷卻；②分別取2μLChro-tlh、Chro-tdh>Chro-trh>Chro-toxR,用合成buffer稀釋到一定的倍數(shù)。取稀釋后的生物傳感器分別加入上述EP管；③陰性對(duì)照用10μL無菌水代替DNA提取液進(jìn)行。另取I個(gè)EP管加入10μL無菌水，沸水浴中加熱3min,然后立即轉(zhuǎn)移到冰上至完全冷卻，再加入10μL合成buffer作為本底對(duì)照，短暫振蕩使反應(yīng)體系混勻；④向上述EP管中分別加入30μL啟動(dòng)buffer(由ADP和上述合成buffer配置，體積比I:3)，振蕩使反應(yīng)體系混勻，然后立即短暫離心以除去管蓋內(nèi)壁上的水珠；⑤將上述反應(yīng)體系放入37°C恒溫?fù)u床中溫育30min，然后將EP管從搖床中取出，分別加入450μLPBS緩沖液，振蕩使體系混勻；⑥取一塊干凈的96孔板，將各管中的最終反應(yīng)體系加入其中，每個(gè)體系加3孔，每孔加樣50μL,然后對(duì)每個(gè)加樣孔分別加入30μL已配置好的熒光素酶溶液(將熒光素酶/熒光素重組緩沖液加入裝有熒光素酶/熒光素的棕色玻璃瓶中，蓋上瓶塞，反復(fù)顛倒幾次混勻，不可振蕩。使用前應(yīng)將混合液在室溫放置Ih)，用槍反復(fù)吹打幾次使體系混勻；⑦將96孔板上機(jī)檢測(cè)，讀取各孔熒光值，對(duì)各組數(shù)據(jù)取平均值，然后用樣本數(shù)值減去本底數(shù)值即為樣本的實(shí)際熒光值；⑧將樣本熒光值絕對(duì)值與H2O的陰性對(duì)照熒光值絕對(duì)值進(jìn)行單因素方差分析，若差異顯著(P<0.05)表示檢出該基因；(3)分型判斷檢出種特異性基因tlh和toxR，可判斷該菌為副溶血性弧菌；檢出tdh或trh，或者兩者都檢出，可判斷該菌攜帶毒力基因，具有致病性。全文摘要本發(fā)明屬于一種對(duì)副溶血性弧菌的致病性進(jìn)行快速分子分型判斷的試劑盒，具體地說是用試劑盒中的F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR對(duì)副溶血性弧菌的種特異性基因tlh、toxR和毒力基因tdh、trh進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)副溶血性弧菌是否具有致病性做出判斷。一方面，對(duì)種特異性基因tlh和toxR的檢測(cè)可以對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行鑒定；另一方面，對(duì)tdh和trh的檢測(cè)可以對(duì)目標(biāo)菌的致病性做出判斷。方法包括試劑盒中F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器的構(gòu)建、用F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器進(jìn)行分子分型，最后根據(jù)分型結(jié)果對(duì)副溶血性弧菌的致病性做出判斷。其優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、快速、操作簡(jiǎn)單、成本低廉。文檔編號(hào)C12R1/63GK102936625SQ20121040608公開日2013年2月20日申請(qǐng)日期2012年10月23日優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日發(fā)明者張捷,李兆杰,王靜,張惠媛,汪琦,張昕,顧德周,尚士進(jìn),陸琳,王佩榮,陳廣全,樂加昌申請(qǐng)人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局,威海出入境檢驗(yàn)檢疫局