一類調(diào)控ccr5和cxcr4基因的融合蛋白及方法
【專利摘要】一種類轉(zhuǎn)錄激活因子(Transcription?Activator?Like?Effectors，TALE)，其特征在于所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)能夠與人類CCR5基因活性區(qū)域或者CXCR4基因活性區(qū)域中的DNA片段識別并結(jié)合，所述人類CCR5基因活性區(qū)域一共有3個，所述CXCR4基因活性區(qū)域一共有2個。TALE與核酸內(nèi)切酶連接形成融合蛋白TALEN，利用該TALEN對CCR5基因或者CXCR4基因的特定位點進行剪切，可以使得進行基因調(diào)控后的細胞具備抵御HIV病毒的能力。
【專利說明】—類調(diào)控CCR5和CXCR4基因的融合蛋白及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及對人CCR5和CXCR4基因改變的方法，及該方法中用到的融合蛋白，特別涉及包括類轉(zhuǎn)錄激活因子(Transcription Activator Like Effectors,TALE)和核酸內(nèi)切酶/部分核酸內(nèi)切酶的融合蛋白，以及用該融合蛋白改變?nèi)薈CR5和CXCR4基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)2011年中國衛(wèi)生部、UNAIDS和WHO對中國艾滋病疫情進行的聯(lián)合評估，截至2011年底，估計中國存活艾滋病病毒感染者和艾滋病病人78萬人(62~94萬人)，其中新發(fā)HIV感染者4.8萬人(4.1~5.4萬人)，艾滋病已成為我國嚴重的公共衛(wèi)生問題。 [0003]在艾滋病發(fā)展過程中，HIV與人類自身免疫系統(tǒng)的較量一刻都沒有停止過，但至今還沒有一例感染者能夠自發(fā)地清除HIV。這是因為隨著病毒持續(xù)復制而導致其基因序列的不斷變化，使HIV的生物學特征及其對免疫反應的敏感性發(fā)生變化。例如，通過對其進入細胞的第二受體選擇性的變化可以加速病情發(fā)展，通過產(chǎn)生大量的病毒突變體，以達到逃逸自身免疫系統(tǒng)的監(jiān)控。另外，HIV病毒還能以DNA的形式整合在宿主細胞的基因組中，巧妙地儲藏在不明的細胞場所或解剖學場所，稱之為病毒儲藏庫。病毒儲藏庫的建立和清除是一個動態(tài)過程，從開始感染的第一天，病毒儲藏庫就開始建立。病毒儲藏庫是根治艾滋病的最大障礙之一。HIV病毒的這些特征，使得開發(fā)能夠有效控制HIV感染、復制、突變、釋放、潛藏等方面的藥物成為了必然。
[0004]通過三十多年對HIV生物學和人體抗HIV免疫應答進行的系統(tǒng)研究，研發(fā)出三十余種抗HIV藥物。這些藥物主要分為I)病毒進入抑制劑；2)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑；3)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑；4)整合酶抑制劑；5)蛋白酶抑制劑。目前臨床廣泛使用的抗HIV/AIDS治療方案，是至少三種藥物的組合，常用的一線推薦方案是二種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑加上一種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、或有利托那韋激動的蛋白酶抑制劑、或整合酶抑制劑。這些治療方案可以將HIV抑制到在血漿、精液等檢測不到的水平，維持或恢復受損的人體免疫功能，延長患者壽命、提高生活質(zhì)量，減少HIV傳播。1995年提出的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HighlyActive Antiretroviral Therapy, HAART)方案，通過對這些藥物的優(yōu)化組合，使艾滋發(fā)病率和死亡率持續(xù)降低了 70%，從而使一種被早期醫(yī)學宣判為死刑的疾病轉(zhuǎn)為一種可治療和可控制的慢性疾病。
[0005]但是目前抗病毒治療無法根治艾滋病，主要原因是對潛藏的HIV不具有抑制和清除作用。一旦治療中斷，病毒數(shù)量就會迅速反彈。其主要原因是HIV整合到易感細胞的染色體上，潛藏在人體的細胞內(nèi)，巧妙地躲過了人體免疫系統(tǒng)和抗HIV藥物的識別；同時,這些被感染的細胞可以長期潛伏，形成HIV的病毒儲藏庫。所以現(xiàn)有的藥物根本無法把HIV從體內(nèi)根本清除，達不到“根本的治愈”。從艾滋病和HIV發(fā)現(xiàn)到今天，雖然對艾滋病的防治取得了很大成績，但艾滋病仍然無法根治，有效的艾滋病疫苗研制成功離我們?nèi)匀贿b遙無期，艾滋病的預防和治療研究一度進入瓶頸期。
[0006]然而“柏林病人”的出現(xiàn)，提示人們“修飾”HIV的共受體基因CCR5可以達到對艾滋病的“功能性治愈”，為我們有效地控制潛藏的HIV提供了一個新的治療方法。HIV的“功能性治愈”是指雖然整合的HIV病毒無法清除，但可以通過增加CCR5受體缺陷的對HIV病毒不易感的細胞，來達到對HIV的抵抗作用，從而在根本上恢復感染者的免疫功能，達到功能治愈的目的?！鞍亓植∪恕本褪且晃籋IV感染者，他通過接受HIV第二受體基因CCR5缺陷的供者骨髓，其中的細胞因為不能被HIV感染破壞而正常復制及行使功能，繼而漸漸取代已被HIV感染的T淋巴細胞，包括潛藏有HIV基因組的HIV易感細胞，從而達到“功能性治愈”。這一現(xiàn)象提示我們可以通過人工方法模擬天然的CCR5受體缺失的細胞，把CCR5/CXCR4缺失的免疫T細胞回輸給病人，從而達到艾滋病“功能性治愈”的目的。
[0007]過去幾年在染色體及其修飾技術(shù)上有了突破性的研究進展，其中鋅指蛋白核酸酶(ZincFinger Nuclease, ZFN)為其中的代表。美國的研究小組正在利用ZFN開展CCR5敲除等研究，并在HIV感染者中進行臨床研究，取得了非?？上驳倪M展，相關(guān)的研究工作已進入了二期臨床優(yōu)化ZFN對CCR5等位基因修飾效率和提高回輸細胞中CCR5-modified⑶4T cell 比例的研究階段。最近研發(fā)的 TALEN(transcription activator-like effectornuclease,類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶)比ZFN在特異性、設(shè)計合成等方面具有明顯的優(yōu)勢，為TALEN應用于臨床提供了更堅實的基礎(chǔ)。
[0008]TALE (Transcription Activator Like Effectors)首先是植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas) 上發(fā)現(xiàn)的,特異性地結(jié)合到DNA,在該病原菌感染過程中對植物基因進行調(diào)控。TALE蛋白可以穿過核膜進入細胞核內(nèi)與特定的DNA結(jié)合域結(jié)合，調(diào)控植物基因組中與疾病和抵抗力相關(guān)基因的表達。簡單講，TALE是由4個或以上特異性識別DNA的串聯(lián)“蛋白模塊”和兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成，而每個“蛋白模塊”包含34個氨基酸，其中第12和13位氨基酸是靶向識別的關(guān)鍵位點，被稱作重復可變的雙氨基酸殘基(repeatvariablediresidue,或者RVDs)。TALE識別DNA的機制在于DNA祀點上的一個核苷酸被一個重復序列上的RVD識別。
[0009]理論上，針對A、T、G、C任何一個堿基，都能找到與之特定結(jié)合的RVDs。因此，對任何一段DNA序列，我們可以方便的設(shè)計、合成出對應蛋白模塊組成的TALE。需要指出的問題是，D雖然針對A、T、G、C都可以設(shè)計出對應的RVD，但是，它們之間的對應關(guān)系還有待于進一步優(yōu)化；2)設(shè)計合成的TALE能否高效地靶向結(jié)合基因組上的預期位置，還決定于很多其它因素；3)蛋白模塊的組成也有進一步優(yōu)化的空間。
[0010]雖然TALE還有很多問題有待于深入研究加以解決，但是這并不妨礙它的應用。一個最大的應用前景是TALEN。TALEN是一個融合蛋白，由與某段DNA序列特異性識別TALE與能在DNA序列上產(chǎn)生雙鏈斷裂(double strand break, DSB)的內(nèi)切核酸酶(Nuclease)融合而成。TALEN是異源二聚體分子(即兩單位的TALE-Nuclease共同作用)，能夠在兩個相隔較近的特異識別序列間切割DNA。
[0011]TALEN產(chǎn)生的DSB能夠通過以下兩種途徑進行修復:1)非同源末端連接(NonHomologousEnd Joining,NHEJ):NHEJ是以自然修復機制,能被用來引入核苷酸缺失以便失活或敲除一個特異性的祀基因；2)同源重組(Homologous Recombination,HR):DSB促進同源重組，在一個DNA模版存在下，能夠產(chǎn)生特異性DNA序列改變，也能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因整合到DNA序列上。NHEJ途徑可以用于基因沉默，而HR可用于修改基因(Gene Editing)，或者基因敲入(GeneKnock-1n)。無論是哪種途徑,TALEN產(chǎn)生的修復與單純依賴于同源重組相比,基因發(fā)生重組的效率大大提高，這為我們從事基因組訂制化(genome customization)提供方便的技術(shù)手段，為開發(fā)出更簡易的新型基因組靶向修飾技術(shù)帶來了新希望。
[0012]TALE技術(shù)已經(jīng)開始在生命科學領(lǐng)域嶄露頭角。2011年，法國和美國兩個小組合作，利用TALEN技術(shù)，在大鼠中敲除失活I(lǐng)gM功能，效率高達60 %。2011年，包括中國在內(nèi)的幾個小組，利用TALEN技術(shù)，在斑馬魚中，敲除失活hey2等基因，效率也達到了 30%以上。
[0013]TALE具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，包括氮端(N端)分泌信號、中央的DNA結(jié)合域、和核定位序列(Nuclear localization signal,NLS)和碳端(C端)的激活域。DNA結(jié)合域中，幾乎所有已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TALE蛋白都是有數(shù)量不同(12~30)、高度保守的重復單元組成，這些重復單元(一般含有33~35個氨基酸)中，除了第12和13位氨基酸不近相同之外，其他組成部分都十分保守。其中第12和13位可變的氨基酸被稱為重復序列可變的雙氨基酸殘基RVD (repeat variable d1-residues)。TALE主要是通過重復單兀中的RVD識別DNA序列。目前已經(jīng)報道的RVD共有14種。NT(氨基酸名稱)特異性識別A，HD(氨基酸名稱)特異性識別C，NN(氨基酸名稱)可以識別G和A，NK(氨基酸名稱)特異性識別G，NS(氨基酸名稱)可以識別G、A、C和T，NG (氨基酸名稱)特異性識別T，NH(氨基酸名稱)特異性識別G，N* (氨基酸名稱)可以識別T、C、G和A，NP (氨基酸名稱)可以識別T、A和C，HN(氨基酸名稱)可以識別G和A，NT (氨基酸名稱)可以識別G和A，SN(氨基酸名稱)特異性識別G，SH(氨基酸名稱)特異性識別G。
[0014]TALE技術(shù)的主要部分是在TALE蛋白碳端融合進入功能分子，例如轉(zhuǎn)錄激活因子(Activation Domain, AD)核酸酶、甲基化酶、去甲基化酶、重組酶等等。在TALE融合蛋白特異性識別DNA序列并結(jié)合之后，它碳端的功能集團發(fā)揮作用，從而達到對功能蛋白調(diào)控的效果?，F(xiàn)在有關(guān)TALE的相關(guān)技術(shù)應用的報道中一般都是通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒侵染或者注射信使的RNA的方法直接表達TALE融合蛋白，讓其發(fā)揮作用。
[0015]由于 TALEN(transcription activator-like effector nuclease,類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶)比ZFN在特異性、設(shè)計合成等方面具有明顯的優(yōu)勢，本專利利用TALEN對基因進行定點敲除，篩選并優(yōu)化特異性針對HIV的CCR5/CXCR4受體基因的TALEN，達到安全、高效、準確的定點敲除病人的CCR5/C`XCR4受體基因的目的，從而抑制病毒對人體免疫系統(tǒng)的入侵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]定義:
[0017]為消除歧義，對本發(fā)明中的下列術(shù)語進行定義。
[0018]剪切或切割:是指在特定條件下DNA分子共價主鏈(covalent backbone)的斷裂。剪切或切割可以通過(但不限于)以下方法進行:磷酸二酯鍵的酶解或化學水解。DNA的單鏈斷裂和雙鏈斷裂都是有可能的，雙鏈斷裂有可能由于兩條單鏈的斷裂導致。
[0019]多聚核苷酸:生物大分子物質(zhì)，包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類。
[0020]核酸酶(英語Juclease):是以核酸為底物，催化磷酸二酯鍵水解的一類酶。以作用部位分為核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶。
[0021]核酸內(nèi)切酶:是一種酵素，可切割聚核苷酸鏈內(nèi)部的磷酸雙酯鍵，與核酸外切酶相對應。從對底物的特異性來看，可分為DNase 1.DNase II等分解DNA的酶；RNase、RNaseTl等分解RNA的酶。一般來說，大都不具堿基特異性，但也有諸如脾臟RNaSe、RNaSeTl等或限制性內(nèi)切酶那種能夠識別并切斷特定的堿基或堿基序列的酶。
[0022]部分核酸酶:部分核酸酶是一段多肽，當其與另一段多肽(相同或不同)結(jié)合時，形成具有核酸剪切活性(特別是雙鏈剪切活性)的二聚體復合物(即核酸酶)。
[0023]核酸酶剪切功能域(cleavage domain):是核酸酶中具有DNA或RNA剪切作用的結(jié)構(gòu)域(domain)。
[0024]TALEN (transcription activator-like effector nuclease,類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶)=TALEN是一個融合蛋白，由與某段DNA序列特異性識別的TALE與能在DNA序列上產(chǎn)生雙鏈斷裂(double strand break, DSB)的核酸內(nèi)切酶(Nuclease)或部分核酸內(nèi)切酶融合而成，本發(fā)明中的 “TALE-1-L” -Fok1、“TALE-1 ’ -L” -Fok1、“TALE-1-L” -核酸內(nèi)切酶、“TALE-1，-L”-核酸內(nèi)切酶都屬于TALEN。
[0025]為了表述更加簡明，下面將從最優(yōu)選的技術(shù)方案開始對本發(fā)明進行詳細的說明。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，人CCR5和CXCR4基因中存在一些活性區(qū)域，若對這些活性區(qū)域中的某些DNA片段進行切除，則待基因修復之后，HIV病毒將不能再攻擊這些基因修復之后的細胞，從而達到功能治愈艾滋病的目的。這些活性區(qū)域一共有5個，其中CCR5基因中有3個，其核苷酸序列分別為 :活性區(qū)域I):
【權(quán)利要求】
1.一種類轉(zhuǎn)錄激活因子(Transcription Activator Like Effectors, TALE),其特征在于所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)能夠與人類CCR5基因活性區(qū)域或者CXCR4基因活性區(qū)域中的DNA片段識別并結(jié)合，所述人類CCR5基因活性區(qū)域一共有3個，其核苷酸序列分別為:活性區(qū)域 I):tgcacagggtggaacaagatggattatcaagtgtcaagtccaatctatgacatcaattattatacatcggagccctgccaaaaaatcaatgtgaagcaaatcgcag,活性區(qū)域 2):caacatgctggtcatcctcatcctgataaactgcaaaaggctgaagagcatgactgacatctacctg,活性區(qū)域 3):tcttcattacacctgcagctctcattttccatacagtcagtatcaattctggaagaatttccagacattaaagatag ;所述 CXCR4 基因活性區(qū)域一共有2個，其核苷酸序列分別為:活性區(qū)域I’ ):TAACTACACCGAGGAAATGGGCTCAGGGGACTATGACTCCATGAAGGAACCCTGTTTCCGTGAAGAAAATGCTAATTTCAATAAAA,活性區(qū)域 2’):TAAAATCTTCCTGCCCACCATCTACTCCATCATCTTCTTAACTGGCATTGTGGGCMTGGATTGGTCATCCTGGTCATGGGTTACCAGAAGAAACTGAGAAGCATGACGGACAAGTACAGGCTGCA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)，其特征在于所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域1)，其核苷酸序列為5’ -TATGACATCAATTATTAT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域I)的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -TGCTTCACATTGATTTTTT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域I)，其核苷酸序列為 5’ -TGGAACAAGATGGATTAT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域I)的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -TAATTGATGTCATAGAT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域1)，其核苷酸序列為 5’ -TATCAAGTGTCAAGTCCAAT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域I)的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -TGGCAGGGCTCCGATGTATAAT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2)，其核苷酸序列為 5’ -TGCTGGTCATCCTCAT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2)的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -TCATGCTCTTCAGCCTT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2)，其核苷酸序列為 5’ -TGGTCATCCTCATCCT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2)的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -TCAGTCATGCTCTTCAGC-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2)，其核苷酸序列為 5’ -TGCTGGTCATCCTCATC-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域3)，其核苷酸序列為 5’ -TACACCTGCAGCTCTCAT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域3)的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -TGGAAATTCTTCCAGAAT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)，其核苷酸序列為 5’ -CTTCCTGCCCACCATCT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -GCCCACAATGCCAGTT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域1’)，其核苷酸序列為 5’ -ACACCGAGGAAATGGGCTCA-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域1')的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -CACGGAAACAGGGTTCCTT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域1’)，其核苷酸序列為 5’ -ATGACTCCATGAAGGAAC-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域1')的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -ATTGAAATTAGCATTTT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)，其核苷酸序列為 5’ -CCTGCCCACCATCTACT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -CCTGCCCACCATCTACT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)，其核苷酸序列為 5’ -CTACTCCATC ATCTT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -GACCAATCCATTGCCC-3’。 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)，其核苷酸序列為 5，-ATCCTGGTCATGGGTT-3’ ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)的反義鏈，其核苷酸序列為 5’ -ACTTGTCCGTCATGCTT-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)，其特征在于所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域1)，其核苷酸序列為5’ -TATGACATCAATTATTAT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氛基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-NI NGNN NI HD NI NG HD NI NING NG NI NG NG NI NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為“TALE-1-L”； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域I)的反義鏈，其核苷酸序列為5’-TGCTTCACATTGATTTTTT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N 端-NN HD NG NG HD NI HD NI NG NG NN NI NG NG NG NG NG NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為“TALE-1-R”； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域1)，其核苷酸序列為5’ -TGGAACAAGATGGATTAT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-NNNN NI NI HD NI NI NN NI NG NN NN NI NG NG NI NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-2-L” ；或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域I)的反義鏈，其核苷酸序列為5’ -TAATTGATGTCATAGAT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N 端-NI NI NG NG NN NI NG NN NG HD NI NG NI NN NI NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-2-R”; 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域1)，其核苷酸序列為5’ -TATCAAGTGTCAAGTCCAAT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-NI NG HD NI NI NN NG NN NG HD NI NI NN NG HD HD NI NI NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-3-L” ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域I)的反義鏈，其核苷酸序列為5’ -TGGCAGGGCTCCGATGTATAAT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N 端-NN NN HD NI NN NNNN HD NG HD HD NN NI NG NN NG NI NG NI NI NG -C端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為“TALE-3-R”； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2)，其核苷酸序列為5’ -TGCTGGTCATCCTCAT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-NNHD NG NN NN NG HD NI NG HD HD NG HD NI NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為“TALE-4-L”； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2)的反義鏈，其核苷酸序列為5’ -TCATGCTCTTCAGCCTT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N 端-HD NI NG NN HD NG HD NG NG HD NI NN HD HD NG NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-4-R”；` 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2)，其核苷酸序列為5’ -TGGTCATCCTCATCCT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-NNNN NG HD NI NG HD HD NG HD NI NG HD HD NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為“TALE-5-L”； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2)的反義鏈，其核苷酸序列為5’ -TCAGTCATGCTCTTCAGC-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N 端-HD NI NN NG HD NI NG NN HD NG HD NG NG HD NI NN HD-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-5-R” ; 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2)，其核苷酸序列為5’-TGCTGGTCATCCTCATC-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-NNHD NG NN NN NG HD NI NG HD HD NG HD NI NG HD-C端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為“TALE-6-L”； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域3)，其核苷酸序列為5’ -TACACCTGCAGCTCTCAT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-NIHD NI HD HD NG NN HD NI NN HD NG HD NG HD NI NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-7-L” ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域3)的反義鏈，其核苷酸序列為5’ -TGGAAATTCTTCCAGAAT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N 端-NN NN NI NINI NG NG HD NG NG HD HD NI NN NI NI NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-7-R” ; 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)，其核苷酸序列為5’-CTTCCTGCCCACCATCT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-HDNG NG HD HD NG NN HD HD HD NI HD HD NI NG HD NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-1 ’ -L”; 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’ )的反義鏈，其核苷酸序列為5’-GCCCACAATGCCAGTT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N 端-NN HD HD HD NI HD NI NI NG NN HD HD NI NN NG NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-1 ’ -R” ; 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域I’)，其核苷酸序列為5’ -ACACCGAGGAAATGGGCTCA-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-NI HD NI HD HD NN NI NN NN NI NI NI NG NN NN NN HD NG HD N1-C端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為“TALE-2，-L” ; 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2‘)的反義鏈，其核苷酸序列為5’-CACGGAAACAGGGTTCCTT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N 端-HD NI HD NN NN NI NI NI HD NI NN NN NN NG NG HD HD NG NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為“TALE-2，-R” ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)，其核苷酸序列為5’ -ATGACTCCATGAAGGAAC-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-NI NG NN NI HD NG HD HD NI NG NN NI NI NN NN NI NI HD-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-3，-L” ; 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)的反義鏈，其核苷酸序列為5’-ATTGAAATTAGCATTTT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue,RVD)序列為:N端-NI NG NG NN NI NI NI NG NG NI NN HD NI NG NG NG NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-3，-R” ; 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)，其核苷酸序列為5’-CCTGCCCACCATCTACT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-HDHD NG NN HD HD HD NI HD HD NI NG HD NG NI HD NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-4，-L” ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)的反義鏈，其核苷酸序列為5’-GCCCACAATGCCAGT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-NN HD HD HD NI HD NI NI NG NN HD HD NI NN NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-4，-R”; 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)，其核苷酸序列為5’-CTACTCCATCATCTT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-HDNG NI HD NG HD HD NI NG HD NI NG HD NG NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為“TALE-5，-L” ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’ )的反義鏈，其核苷酸序列為5’-GACCAATCCATTGCCC-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合， 其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N 端-NN NI HD HD NI NI NG HD HD NI NG NG NN HD HD HD-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-5，-R”。 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)，其核苷酸序列為5’ -ATCCTGGTCATGGGTT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N端-NING HD HD NG NN NN NG HD NI NG NN NN NN NG NG-C端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為“TALE-6，-L” ； 或者所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合的DNA片段來自活性區(qū)域2’)的反義鏈，其核苷酸序列為5’ -ACTTGTCCGTCATGCTT-3’，所述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)與上述核苷酸序列單鏈識別并結(jié)合，其重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidue, RVD)序列為:N 端-NIHD NG NG NN NG HD HD NN NG HD NI NG NN HD NG NG-C 端，上述類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)記為 “TALE-6’ -R”。
4.一種融合蛋白，其特征在于該融合蛋白包括權(quán)利要求1-3的任一項所述的類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)以及至少一個完整核酸酶剪切功能域(cleavage domain)或部分核酸酶剪切功能域。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于所述部分核酸酶剪切功能域是野生型限制性內(nèi)切酶FokI具有剪切功能結(jié)構(gòu)域的一半。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于所述部分核酸酶剪切功能域是人工改造型限制性內(nèi)切酶FokI具有剪切功能結(jié)構(gòu)域的一半。
7.一種試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括2個如權(quán)利要求5或6所述的融合蛋白，上述2個融合蛋白分別與目標核苷酸序列識別并結(jié)合以后，2個融合蛋白上的部分核酸酶處于接近的位置，形成一個具有剪切DNA功能的核酸內(nèi)切酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述2個融合蛋白分別為“TALE-l-L”-FokI 和“TALE_l-R”-FokI ;或者分別為“TALE-2_L”-FokI 和“TALE_2-R”-FokI ；或者分別為 “TALE-3-L” -FokI 和 “TALE-3-R” -FokI ;或者分別為 “TALE-4-L” -FokI 和“TALE-4-R”-FokI ;或者分別為 “TALE-5-L”-FokI 和 “TALE-5-R”-FokI ;或者分別為“TALE-6-L”-FokI 和“TALE_4-R”-FokI ;或者分別為 “TALE-7_L”-FokI 和“TALE_7-R”-FokI ；或者分別為 “TALE-1' -L”-FokI 和 “TALE-1，-R”-FokI ;或者分別為 “TALE-2，_L”-FokI和 “TALE-2，-R”-FokI ;或者分別為 “TALE-3，_L”-FokI 和 “TALE-3，-R”-FokI ；或者分別為 “TALE-4，-L，，-FokI 和 “TALE-4，-R” -FokI ;或者分別為 “TALE-5，-L，，-FokI 和“TALE-5，-R”-FokI ;或者分別為 “TALE-6，_L”-FokI 和 “TALE-6，-R”_FokI。
9.一種試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括I個如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，上述融合蛋白能與目標核苷酸序列識別并結(jié)合以后，核酸內(nèi)切酶能在特定位點行使DNA剪切功倉泛。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述融合蛋白為“TALE-1-L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-1-R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-2-L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-2-R” -核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-3-L” -核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-3-R” -核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-4-L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-4-R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-5-L” -核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-5-R” -核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-6-L” -核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE -7-L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-7-R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-1' -L” -核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-1' _R”_核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-2’ _L”_核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-2’ -R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-3’ -L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-3’ -R”_核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-4’ _L”_核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-4’ -R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-5’ -L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-5’ -R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-6’ -L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-6’ -R”-核酸內(nèi)切酶。
11.一種多聚核苷酸，其特征在于所述多聚核苷酸編碼權(quán)利要求1-3之一的TALE蛋白、或者編碼權(quán)利要求4-6之一的融合蛋白、或者編碼權(quán)利要求7-10之一的試劑盒所包括的融合蛋白。
12.—種基因載體，其特征在于所述基因載體包括權(quán)利要求9或11所述的多聚核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的基因載體，其特征在于所述基因載體是腺病毒載體。
14.一種游離細胞，其特征在于所述游離細胞被導入過權(quán)利要求1-3之一的TALE、或者權(quán)利要求4-6的任一項所述的融合蛋白、或者權(quán)利要求7-10之一所述試劑盒所包括的融合蛋白、或者權(quán)利要求11所述多聚核苷酸、或者權(quán)利要求12-13之一所述基因載體。
15.調(diào)控細胞內(nèi)CCR5或CXCR4基因的方法，其特征在于所述方法包括:a)在細胞中引入第一段核酸序列，所述第一段核酸序列編碼第一段多肽，所述第一段多肽包括權(quán)利要求4-6的任一項所述的融合蛋白(稱為第一融合蛋白)，從而當?shù)谝欢魏怂嵝蛄性诩毎斜磉_為第一段多肽之后，第一段多肽中的類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合人類CCR5或CXCR4基因活性區(qū)域中的DNA片段(稱為第一 DNA片段)，第一段多肽具有剪切CCR5或CXCR4基因的功能。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，進一步包括:b)在細胞中引入第二段核酸序列，所述第二段核酸序列編碼第二段多肽，所述第二段多肽包括權(quán)利要求4-6的任一項所述的融合蛋白(稱為第二融合蛋白)，上述第二融合蛋白不同于第一融合蛋白，從而當?shù)诙魏怂嵝蛄性诩毎斜磉_為第二段多肽之后，第二段多肽中的類轉(zhuǎn)錄激活因子(TALE)識別并結(jié)合人類CCR5或CXCR4基因活性區(qū)域中的DNA片段(稱為第二 DNA片段)，上述第二 DNA片段不同于第一 DNA片段，第二段多肽與第一段多肽能一起剪切CCR5或CXCR4基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一多肽為“TALE-1-L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-1-R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-2-L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-2-R” -核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-3-L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-3-R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-4-L” -核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-4-R” -核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-5-L” -核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-5-R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-6-L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-7-L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-7-R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-1` -L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-1` -R”_核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-2’ -L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-2’ -R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-3’ -L核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-3’ -R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-4’ -L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-4’ -R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-5’ -L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-5’ -R”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-6’ -L”-核酸內(nèi)切酶；或者為“TALE-6’ -R”-核酸內(nèi)切酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中第一多肽為“TALE-l-L”-FokI，第二多肽為“TALE-l-R” -FokI ;或者第一多肽為“TALE-2-L” -FokI，第二多肽為“TALE-2-R” -FokII ；或者第一多肽為“TALE-3-L” -FokI，第二多肽為“TALE-3-R” -FokI ;或者第一多肽為“TALE-4-L” -FokI，第二多肽為 “TALE-4-R” -FokI ;或者第一多肽為 “TALE-5-L” -FokI，第二多肽為“TALE-5-R” -FokI ;或者第一多肽為“TALE-6-L” -FokI，第二多肽為“TALE-4-R”-FokI ;或者第一多肽為 “TALE-7-L”-FokI，第二多肽為 “TALE-7-R”-FokI ；或者第一多肽為“TALE-`1-L”-FokI，第二多肽為“TALE-1`-R" -FokI ;或者第一多肽為“TALE-2，-L”-FokI，第二多肽為“TALE-2，-R”_FokI ;或者第一多肽為“TALE-3，-L”_FokI，第二多肽為“TALE-3’ -R” -FokI ;或者第一多肽為“TALE-4’ -L” -FokI,第二多肽為“TALE-4，-R，，-FokI ;或者第一多肽為“TALE-5，-L”_FokI，第二多肽為“TALE-5，-R”_FokI ；或者第一多肽為 “TALE-6’ -L”-FokI，第二多肽為 “TALE-6’ -R”_FokI。
19.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法,其中第一段多肽和第二段多肽由同一核酸載體編碼產(chǎn)生。
20.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中第一段多肽和第二段多肽由兩個不同核酸載體分別編碼產(chǎn)生。
21.根據(jù)權(quán)利要求15-18的任一項所述的方法，進一步包括c)在細胞中引入一段多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包括第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域與CCR5或CXCR4基因雙鏈斷裂區(qū)域上游的一段基因序列相同，所述第二區(qū)域與CCR5或CXCR4基因雙鏈斷裂區(qū)域下游的一段基因序列相同。
22.根據(jù)權(quán)利要求15-21的任一項所述的方法，其中第一段核酸、第二段核酸和多聚核苷酸負載在基因載體上。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述基因載體是腺病毒載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述腺病毒載體是Ad5/F35載體。
25.根據(jù)權(quán)利要求15-25的任一項所述的方法，其中所述細胞選自造血干細胞、T細胞、巨噬細胞、樹突細胞、抗原呈遞`細胞、間充質(zhì)干細胞或ghost(3)X4/R5細胞系。
【文檔編號】C12N15/861GK103724410SQ201210385677
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月12日
【發(fā)明者】張林琦, 莊峰鋒, 史宣玲, 石冰潔, 李娟 , 李紹路 申請人:清華大學, 北京唯尚立德生物科技有限公司