專利名稱：四種致腹瀉性大腸桿菌的多重pcr檢測(cè)方法及其引物組的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種基于多重PCR技術(shù)快速檢測(cè)四種致腹瀉性大腸桿菌的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
食品安全是全球性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，已報(bào)道的食源性疾病致病因子有250多種，其中腸道致病菌是食源性疾病中最常見的生物致病因素。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，全球毎年因食源性微生物污染引起的腹瀉病例達(dá)數(shù)億起，死亡的(Γ15歲兒童約170萬(wàn)人。目前致腹瀉性大腸桿菌仍是引起腹瀉的重要病原之一，特別是嬰幼兒腹瀉，在我國(guó)及國(guó)外腹瀉患者中致腹瀉性大腸桿菌檢出率、構(gòu)成比、優(yōu)勢(shì)類型及血清型不同，給臨床診斷帶來(lái)不便。
大腸埃希菌{Escherichiacoli, Ε· coif)俗稱大腸桿菌，由 Escherich 于 1885年首次發(fā)現(xiàn)，起初一直被認(rèn)為是腸道菌群的正常組成部分，屬于條件致病菌。20世紀(jì)中葉，人們認(rèn)識(shí)到某些特殊血清型大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性，尤其對(duì)嬰兒和幼畜，常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥。與人類疾病有關(guān)的大腸桿菌，統(tǒng)稱為致腹瀉性大腸桿菌(diarrheogenicE. cWi)，根據(jù)生物學(xué)特性主要分為四類產(chǎn)腸毒性大腸桿菌(ETEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)和腸出血性大腸桿菌(EHEC)。致腹瀉性大腸桿菌作為人畜共患性致病菌，具有重要的公共衛(wèi)生意義。ETEC主要感染兒童和旅游者，發(fā)展中國(guó)家尤為嚴(yán)重，被污染的水和食物是主要傳染來(lái)源，主要致病因素是大腸桿菌腸毒素LT或ST，感染的臨床癥狀輕度時(shí)為溫和性腹瀉，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為霍亂樣腹瀉癥狀；EPEC是嬰兒腹瀉的主要病原菌，具有高度傳染性，嚴(yán)重者可致死，病原菌主要感染腸上皮細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞表面形成特征性的組織病理學(xué)損傷；EIEC主要引起大齡兒童和成年人腹瀉，曾爆發(fā)流行，臨床癥狀為水樣腹瀉，有時(shí)呈現(xiàn)痢疾癥狀；EHEC主要血清型是0157:H7，引起散發(fā)性或暴發(fā)性出血性結(jié)腸炎，可產(chǎn)生志賀毒素樣細(xì)胞毒素。目前我國(guó)針對(duì)致腹瀉性大腸桿菌的檢測(cè)方法主要以傳統(tǒng)檢測(cè)方法為主，具體操作流程為待檢樣品一增菌一分離培養(yǎng)一革蘭染色鏡檢/生化及菌落觀察/生化反應(yīng)試驗(yàn)/腸毒素檢查等，操作復(fù)雜繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，完成整個(gè)檢測(cè)程序需要5 10d，且檢測(cè)目標(biāo)單一。在此情況下，采用多重PCR方法一次性檢測(cè)出単一病原感染或混合感染，對(duì)保障食品安全和人類健康具有現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明根據(jù)選取的4種致腹瀉性大腸桿菌靶基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)合成了 4對(duì)特異性PCR引物，通過(guò)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了ー步反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)4種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR方法。實(shí)踐證實(shí)，本發(fā)明方法比常規(guī)的細(xì)菌分離鑒定敏感度高且檢測(cè)快速，可用于臨床病例的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查，具有一定的實(shí)用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的一歩反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)腸出血性大腸桿菌0157:H7、腸侵襲性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌和腸毒素性大腸桿菌4種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的分別選擇腸出血性大腸桿菌0157:H7 O-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌LT基因、腸致病性大腸桿菌/基因和腸侵襲性大腸桿菌invasionplasmid基 因?yàn)榘谢?，通過(guò)基因序列的比對(duì)分析，選取靶基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)合成引物，建立多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)4種致腹瀉性大腸桿菌進(jìn)行定性檢測(cè)。一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測(cè)引物組，核苷酸序列為
腸出血性大腸桿菌O157 = H7引物對(duì)為
OF 5/ -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3',
OR 5/ -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'；
腸毒素性大腸桿菌引物對(duì)為
LF 5/ -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3',
LR 5/ -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'；
腸致病性大腸桿菌引物對(duì)為
BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'，
BR 5/ -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'；
腸侵襲性大腸桿菌引物對(duì)為
IF 5/ -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，
IR 5/ -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3。本發(fā)明還具有如下特征
I、所述的引物對(duì)的添加摩爾比為OF/OR: LF/LR: BF/BR: IF/IR為I: I: I: I. 3。2、一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測(cè)用陽(yáng)性對(duì)照品的制備PCR擴(kuò)增引物組，核苷酸序列為
腸出血性大腸桿菌O157 = H7陽(yáng)性對(duì)照品的制備PCR擴(kuò)增引物
EHEC-F 5/ -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3',
EHEC-R 5/ -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'；
腸毒素性大腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照品的制備PCR擴(kuò)增引物
ETEC-F 5/ -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3;，
ETEC-R 5/ -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'；
腸致病性大腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照品的制備PCR擴(kuò)增引物
EPEC-F 5/ -AAATCATGAATAAGAAATACG-3',
EPEC-R 5/ -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'；
腸侵襲性大腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照品的制備PCR擴(kuò)增引物
EIEC-F 5/ -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3;，
EIEC-R 5/ -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'。3、一種非診斷或治療目的的四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟
(I)PCR模板的制備
參照天根TIANamp Bacteria DNA Kit說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的提取和純化；(2)設(shè)計(jì)PCR引物
選擇腸出血性大腸桿菌O157 = H7的Ο-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌的LT基因、腸致病性大腸桿菌的^基因和腸侵襲性大腸桿菌的invasion plasmid基因作為祀基因，設(shè)計(jì)合成以下引物進(jìn)行靶基因的擴(kuò)增
腸出血性大腸桿菌O157 = H7 Ο-antigen基因的PCR擴(kuò)增引物
EHEC-F 5/ -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3',
EHEC-R 5/ -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'；
腸毒素性大腸桿菌LT基因的PCR擴(kuò)增引物
ETEC-F 5/ -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3;，
ETEC-R 5/ -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'；
腸致病性大腸桿菌/基因的PCR擴(kuò)增引物
EPEC-F 5/ -AAATCATGAATAAGAAATACG-3',
EPEC-R 5/ -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'；
腸侵襲性大腸桿菌invasion plasmid基因的PCR擴(kuò)增引物
EIEC-F 5/ -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3;，
EIEC-R 5/ -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'；
利用設(shè)計(jì)合成的靶基因PCR引物，分別以腸出血性大腸桿菌O157 = H7 (ATCC 35150)、腸毒素性大腸桿菌(ATCC 35401)、腸致病性大腸桿菌(ATCC 11775)和腸侵襲性大腸桿菌(ATCC 43893)的基因組DNA為模板擴(kuò)增靶基因，將擴(kuò)增的靶基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，分別選取每種致腹瀉性大腸桿菌靶基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)合成了 4對(duì)特異性多重PCR鑒定引物
腸出血性大腸桿菌O157 = H7
OF 5/ -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3',
OR 5/ -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'；
腸毒素性大腸桿菌
LF 5/ -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3',
LR 5/ -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'；
腸致病性大腸桿菌
BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'，
BR 5/ -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'；
腸侵襲性大腸桿菌
IF 5/ -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，
IR 5/ -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3;；
(3)陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的制備
采用PCR法分別擴(kuò)增腸出血性大腸桿菌0157:H7 Ο-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌LT基因、腸致病性大腸桿菌ΑφΑ基因和腸侵襲性大腸桿菌invasion plasmid基因，分別將PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD-19-T vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，獲得陽(yáng)性重組菌，參照華舜小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒說(shuō)明書制備陽(yáng)性質(zhì)粒；
(4)PCR反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)對(duì)不同組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較分析，確定了最佳的單重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，相應(yīng)的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖I。單重PCR反應(yīng)體系，如下表
權(quán)利要求
1.一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測(cè)用引物組，其特征在于，核苷酸序列為 腸出血性大腸桿菌O157 = H7引物對(duì)為OF :5' -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3', OR :5' -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'； 腸毒素性大腸桿菌引物對(duì)為L(zhǎng)F :5' -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3', LR :5' -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'； 腸致病性大腸桿菌引物對(duì)為BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'， BR :5' -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'； 腸侵襲性大腸桿菌引物對(duì)為IF :5' -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，IR :5' -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測(cè)用引物組，其特征在于所述的引物對(duì)的添加摩爾比為OF/OR: LF/LR: BF/BR: IF/IR為I: I: I: I. 3。
3.一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測(cè)用陽(yáng)性對(duì)照品的制備PCR擴(kuò)增引物組，其特征在于，核苷酸序列為 腸出血性大腸桿菌O157 = H7陽(yáng)性對(duì)照品的制備PCR擴(kuò)增引物EHEC-F :5' -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3', EHEC-R :5' -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'； 腸毒素性大腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照品的制備PCR擴(kuò)增引物ETEC-F :5' -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3'， ETEC-R :5' -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'； 腸致病性大腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照品的制備PCR擴(kuò)增引物EPEC-F :5' -AAATCATGAATAAGAAATACG-3', EPEC-R :5' -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'； 腸侵襲性大腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照品的制備PCR擴(kuò)增引物EIEC-F :5' -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3'， EIEC-R :5' -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'。
4.一種非診斷或治療目的的四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)PCR模板的制備 參照天根TIANamp Bacteria DNA Kit說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的提取和純化； (2)設(shè)計(jì)PCR引物 選擇腸出血性大腸桿菌O157 = H7的0-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌的LT基因、腸致病性大腸桿菌的基因和腸侵襲性大腸桿菌的invasion plasmid基因作為祀基因，設(shè)計(jì)合成以下引物進(jìn)行靶基因的擴(kuò)增 腸出血性大腸桿菌O157 = H7 0-antigen基因的PCR擴(kuò)增引物EHEC-F :5' -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3',EHEC-R :5' -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'； 腸毒素性大腸桿菌LT基因的PCR擴(kuò)增引物ETEC-F :5' -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3'，ETEC-R :5' -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'； 腸致病性大腸桿菌6//7A基因的PCR擴(kuò)增引物EPEC-F :5' -AAATCATGAATAAGAAATACG-3',EPEC-R :5' -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'； 腸侵襲性大腸桿菌invasion plasmid基因的PCR擴(kuò)增引物EIEC-F :5' -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3'，EIEC-R :5' -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'； 利用設(shè)計(jì)合成的靶基因PCR引物，分別以腸出血性大腸桿菌O157 = H7 (ATCC 35150)、腸毒素性大腸桿菌(ATCC 35401)、腸致病性大腸桿菌(ATCC 11775)和腸侵襲性大腸桿菌(ATCC 43893)的基因組DNA為模板擴(kuò)增靶基因，將擴(kuò)增的靶基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，分別選取每種致腹瀉性大腸桿菌靶基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)合成了 4對(duì)特異性多重PCR鑒定引物 腸出血性大腸桿菌O157 = H7 OF :5' -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3',OR :5' -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'； 腸毒素性大腸桿菌LF :5' -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3',LR :5' -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'； 腸致病性大腸桿菌BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'，BR :5' -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'； 腸侵襲性大腸桿菌IF :5' -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，IR :5' -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3'； (3)陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的制備 采用PCR法分別擴(kuò)增腸出血性大腸桿菌0157:H7 0-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌LT基因、腸致病性大腸桿菌基因和腸侵襲性大腸桿菌invasion plasmid基因，分別將PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD-19-T vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，獲得陽(yáng)性重組菌，參照華舜小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒說(shuō)明書制備陽(yáng)性質(zhì)粒； (4)PCR反應(yīng)體系 單重PCR反應(yīng)體系，如下表
5.一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測(cè)用試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求I所述的引物組。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于多重PCR技術(shù)快速檢測(cè)四種致腹瀉性大腸桿菌的方法及其專用引物。分別選擇腸出血性大腸桿菌O157:H7O-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌LT基因、腸致病性大腸桿菌bfpA基因和腸侵襲性大腸桿菌invasionplasmid基因?yàn)榘谢?，通過(guò)基因序列的比對(duì)分析，選取靶基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)合成引物，具體引物如序列表SEQ ID No.1-8所示，建立多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)4種致腹瀉性大腸桿菌進(jìn)行定性檢測(cè)。本發(fā)明方法具有較強(qiáng)的檢測(cè)特異性。本發(fā)明還涉及到檢測(cè)用試劑盒，還具有快速簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，靈敏度好的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851384SQ20121035672
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者徐義剛, 李丹丹, 劉忠梅, 吳巖, 劉新亮, 李蘇龍 申請(qǐng)人:黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心