專利名稱：一種藻類rna提取劑及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種藻類RNA提取劑及使用方法。
背景技術(shù)：
分離獲得高純度、完整的RNA是進行RT-PCR、qRT-PCR、Northern雜交等分生物學(xué)實驗的關(guān)鍵。藻類組織通常富含的多糖、酚類化合物等，可在核酸分離純化時，與RNA相互作用。酚類化合物極易被氧化，生成物(如醌類)能與RNA穩(wěn)定的結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀下來，多糖可以抑制很多酶的活性，因此污染了多糖多酚的RNA無法用于進一步的分子生物學(xué)研究。RNA酶的高穩(wěn)定性是造成RNA極易降解和分離純化失敗的另外一個主要原因。RNA提取過程中污染的RNA酶有兩種來源夕卜源性RNA酶和內(nèi)源性RNA酶。外源性RNA酶來自RNA制備過程中使用的玻璃、塑料制品和試劑及操作人員本身等，而內(nèi)源性RNA酶是組織本身所固有的，當(dāng)細胞破碎后即釋放出來。 因此，能否有效去除多糖、酚類化合物及去除或抑制RNA酶活性是提取高質(zhì)量RNA成敗的關(guān)鍵。目前，現(xiàn)有的RNA提取試劑盒和提取方法主要針對提取微生物、動物和高等植物組織的RNA,而對提取藻類RNA效果不佳。中國專利公布號CN 102191239 A，公布日2011年9月21日，名稱為一種提取荔枝總RNA的方法，該申請案公開了一種提取荔枝總RNA的方法，是將采集的用液氮處理的荔枝葉片樣品經(jīng)研磨后用丙酮進行抽提；在抽提過的植物材料中加入RNA提取液進行提取，離心，將上清液用LiCl進行沉淀，離心后收集沉淀；用LiCl溶液洗滌沉淀，離心，棄上清；待沉淀干燥后，用DEPC滅菌溶劑溶解沉淀，在_80°C中保存?zhèn)溆?。其不足之處在于，現(xiàn)有RNA提取試劑對于藻類RNA的提取效果較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為了解決現(xiàn)有RNA提取試劑盒對藻類RNA提取效果較差的缺陷而提供一種高效高純的藻類RNA提取劑。本發(fā)明的另一目的是為了提供一種高效高純的藻類RNA提取劑的使用方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一種藻類RNA提取劑，所述藻類RNA提取劑由Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB、DTT、和檸檬酸鈉溶于DEPC水溶液中而成；其中，Tris-HCl的終濃度為O. 05-0. 2 mol/L,NaCl的終濃度為 I. 5-2. 5 mo I/LjEDTA 的終濃度為 O. 03-0. 06 mo I/LjCTAB 的終濃度為 O. 05-0. 15 mmol/L，檸檬酸鈉的終濃度為25-30 mmol/L，藻類RNA提取劑的終濃度為30-80 mmol/L。作為優(yōu)選，所述DEPC水溶液的質(zhì)量分數(shù)為0. 1%-0. 2%。一種利用藻類RNA提取劑應(yīng)用于提取藻類RNA的使用方法，所述使用方法包括以下步驟
步驟a)處理樣品將新鮮或超低溫冷凍的藻類，用純凈水沖洗干凈，然后浙干；取浙干后的藻類0. 1-0. 5g，在液氮中研磨至粉末狀；步驟b)配制提取劑向Tris-HCl、NaCl、EDTA, CTAB與檸檬酸鈉中加入質(zhì)量分數(shù)為O. 1-0. 2%的DEPC水溶液，然后在室溫下靜置過夜，在121°C滅菌15_20min，得到提取劑半成品；向提取劑半成品中加入2-4mol/L的DTT至終濃度30-80m mol/L，得到提取劑；其中Tris-HCl的終濃度為O. 05-0. 2 mol/L, NaCl的終濃度為I. 5-2. 5 mol/L, EDTA的終濃度為O. 03-0. 06 mol/L, CTAB 的終濃度為 O. 05-0. 15 mmol/L，檸檬酸鈉的終濃度為 25-30 mmol/L ；
步驟C)抽提將步驟a)的粉末狀樣品倒入盛有2-4mL提取劑的離心管中，渦旋混勻2-4min，將離心管在室溫下放置15_30min，期間每隔5min搖晃離心管一次；然后向離心管中加入2-4mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻2-4min，然后于0_4°C，離心力10000-15000g的條件下離心15-30min ;吸取上清液于另一干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積20%-40%的無水乙醇，渦旋混勻2-4min ;然后向加入了無水乙醇的上清液中加入2_4mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻2-4min，于0_4°C，離心力10000_15000g的條件下離心15_30min ；
步驟d):吸取步驟C)抽提后的上清液于干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積20%-40%的12 mol/L LiCl溶液并渦旋混勻2-4min，-50一-80°C條件下靜置30_60min，得到粗樣品；
步驟e)沉淀將步驟d)靜置后的粗樣品于0-4°C，離心力12500-15000g的條件下，離心20-40 min ;棄上清液，取出沉淀，用0. 5_2mL的體積分數(shù)70%_75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0-4。(^下，離心力12000g,離心10 min ；
步驟f ):將步驟e)中的上清液于于0-4°C，離心力12500-15000g的條件下，離心20-40min，取出沉淀，用0. 5-2mL體積分數(shù)70%_75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0_4 °C下，離心力12000g，離心10 min將該次離心得到的沉淀與步驟e)得到的沉淀合并得到粗沉淀；步驟g):將步驟f)處理后的粗沉淀在10-30°C下風(fēng)干，然后用20-50 μ L的質(zhì)量分數(shù)0. 1%-0. 2%的DEPC水溶液溶解風(fēng)干后的沉淀，用RNase-Free DNase set (50)試劑盒去除樣品總RNA中DNA ；
步驟h):將步驟g)去除DNA后的樣品總RNA移入干凈離心管，加入與樣品總RNA等體積的氯仿與異戊醇混合液進行抽提，0-4 V，離心力12000g的條件下離心10 -25min;取上清液，移入新離心管內(nèi)，加入上清液體積10%-15%的3-5 mol/L的醋酸鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液的PH4-5，然后加入2-3倍上清液體積的無水乙醇，在_70°C冰浴沉淀45_60min ;然后在0_4V,離心力12，OOOg的條件下離心10 min，棄上清液，沉淀即為純化的藻類RNA。在本技術(shù)方案中，由于常用的RNA提取試劑盒對藻類RNA的提取效果不佳且提取后純度較差，故對常用RNA提取劑做出優(yōu)化，Tris-HCl作為一種常用的核酸和蛋白質(zhì)的緩沖液，防止核酸被破壞；EDTA作為絡(luò)合劑；CTAB用于純化RNA，檸檬酸鈉具有良好的pH調(diào)節(jié)劑及緩沖性能。步驟b)中選用DEPC水溶解Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB與檸檬酸鈉，是為了是提取劑里不參雜其他離子；步驟d)使用LiCl使得RNA與DNA沉淀再經(jīng)過高速離心得到沉淀物；步驟g)中選用DEPC水，DEPC水可用于RNA沉淀的溶解；步驟h)是為了將去除DNA后的樣品純化得到RNA。作為優(yōu)選，所述步驟c)與步驟h)中氯仿與異戊醇的體積比為24:1。作為優(yōu)選，所述步驟a)中所用藻類為為紅藻、綠藻或褐藻。紅藻、綠藻或褐藻作為海洋內(nèi)大量存在的生物，其來源廣闊且數(shù)量極多。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明適用于提取藻類RNA，操作步驟簡單，成本低、穩(wěn)定性好，提取RNA產(chǎn)率高(RNA提取率185-240 μ g/1OOmg新鮮藻樣)，純度高(0D260/280值為I. 90-2. 10)，完全滿足 RT-PCR、Real Time PCR 和 RACE-PCR 等實驗的需要。


圖I是綠藻石莼總RNA的甲醛變性膠電泳圖。圖中，泳道I :DL2000 Marker ；泳道2 :提取的綠藻石莼總RNA ；泳道3 :去除DNA的綠藻石莼總RNA。
具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的解釋
本發(fā)明所用試劑均為市售。實施例一
一種藻類RNA提取劑的使用方法，包括以下步驟
步驟a)處理樣品將新鮮綠藻石莼，用純凈水沖洗干凈，然后浙干；取浙干后的綠藻石莼O. lg，在液氮中研磨至粉末狀；
步驟b)配制提取劑向Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB與檸檬酸鈉中加入質(zhì)量分數(shù)為O. 1%的DEPC水溶液，然后在室溫下靜置過夜，在121 °C、高壓滅菌15min，得到提取劑半成品；向提取劑半成品中加入2 mol/L的DTT至終濃度30 mmol/L，得到提取劑；其中Tris-HCl的終濃度為O. 05 mol/L, NaCl的終濃度為I. 5 mol/L, EDTA的終濃度為O. 03 mol/L, CTAB的終濃度為0. 05 mmol/L，檸檬酸鈉的終濃度為25 mmol/L ；
步驟c)抽提將步驟a)的粉末狀樣品倒入盛有2mL提取劑的離心管中，渦旋混勻2min，將離心管在室溫下放置15min，期間每隔5min搖晃離心管一次；然后向離心管中加入2mL的氯仿與異戊醇的混合液，氯仿與異戊醇的體積比為24:1，渦旋混勻2min，然后于(TC，離心力IOOOOg的條件下離心15min ;吸取上清液于另一干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積20%的無水乙醇，渦旋混勻2min ;然后向加入了無水乙醇的上清液中加入2mL的氯仿與異戊醇的混合液，氯仿與異戊醇的體積比為24:1，渦旋混勻2min，于0°C，離心力IOOOOg的條件下離心15min ；
步驟d):吸取步驟c)抽提后的上清液于干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積20%的12 mol/L LiCl并渦旋混勻2min，_50°C條件下靜置30min ；
步驟e)沉淀將步驟d)靜置后的粗樣品于0°C，離心力12500g的條件下，離心20min ；棄上清液，取出沉淀，用0. 5mL的體積分數(shù)70%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于O 1下，離心力12000g,離心 10 min ；
步驟f):將步驟e)中的上清液于于0°C，離心力12500g的條件下，離心20 min，取出沉淀，用0. 5mL體積分數(shù)70%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于O °C下，離心力12000g，離心10min將該次離心得到的沉淀與步驟e)得到的沉淀合并得到粗沉淀；
步驟g):將步驟f)處理后的沉淀在10°C下風(fēng)干，然后用20
μ L的質(zhì)量分數(shù)0. 1%的DEPC水溶液溶解風(fēng)干后的沉淀，用RNase-Free DNase set(50)試劑盒去除樣品總RNA中DNA ；RNase-Free DNase set (50)試劑盒購自德國QIAGEN公司。
步驟h):將步驟g)去除DNA后的樣品總RNA移入干凈離心管,加入與樣品總RNA等體積的氯仿與異戊醇混合液進行抽提，O °C下，12000g，離心10 min;取上清液，移入新離心管內(nèi)，加入上清液體積10%的3mol/L的醋酸鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液pH4，加入2倍上清液體積的無水乙醇，在-70°C冰浴沉淀45min ;然后在O °C下，12000g，離心10 min，棄上清液，沉淀即為純化的綠藻石莼RNA。實施例二
一種藻類RNA提取劑的使用方法，包括以下步驟
步驟a)處理樣品將新鮮斑紫菜，用純凈水沖洗干凈，然后浙干；取浙干后的斑紫菜O. 2g，在液氮中研磨至粉末狀；
步驟b)配制提取劑向Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB與檸檬酸鈉中加入質(zhì)量分數(shù)為O. 2%的DEPC水溶液，然后在室溫下靜置過夜，在121°C滅菌20min，得到提取劑半成品；向提取劑 半成品中加入3mol/L的DTT至終濃度50m mol/L，得到提取劑；其中Tris-HCl的終濃度為O. I mol/L, NaCl的終濃度為2 mol/L, EDTA的終濃度為O. 05 mol/L, CTAB的終濃度為O. lmmol/L，檸檬酸鈉的終濃度為28mmol/L ；
步驟c)抽提將步驟a)的粉末狀樣品倒入盛有3mL提取劑的離心管中，渦旋混勻3min，將離心管在室溫下放置20min，期間每隔5min搖晃離心管一次；然后向離心管中加入3mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻3min，然后于3°C，離心力12000g的條件下離心20min ;吸取上清液于另一干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積30%的無水乙醇，渦旋混勻3min ；然后向加入了無水乙醇的上清液中加入3mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻3min，于2V，離心力12000g的條件下離心20min ；
步驟d):吸取步驟c)抽提后的上清液于干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積30%的12 mol/L LiCl溶液并渦旋混勻3min，_70°C條件下靜置45min，得到粗樣品；
步驟e)沉淀將步驟d)靜置后的粗樣品于2°C，離心力14000g的條件下，離心30 min ；棄上清液，取出沉淀，用ImL的體積分數(shù)72%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于2°C下，離心力12000g,離心 10 min ；
步驟f):將步驟e)中的上清液于于1°C，離心力13000g的條件下，離心30 min，取出沉淀，用ImL體積分數(shù)72%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于3°C下，離心力12000g，離心10 min將該次離心得到的沉淀與步驟e)得到的沉淀合并得到粗沉淀；
步驟g):將步驟f)處理后的粗沉淀在20°C下風(fēng)干，然后用40 μ L的質(zhì)量分數(shù)0. 2%的DEPC水溶液溶解風(fēng)干后的沉淀，用RNase-Free DNase set (50)試劑盒去除樣品總RNA中DNA ；
步驟h):將步驟g)去除DNA后的樣品總RNA移入干凈離心管，加入與樣品總RNA等體積的氯仿與異戊醇混合液進行抽提，0-4 V，離心力12000g的條件下離心15min ;取上清液，移入新離心管內(nèi)，加入上清液體積12%的4 mol/L的醋酸鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH4. 5，然后加入3倍上清液體積的無水乙醇，在_70°C冰浴沉淀50min ;然后在3V’離心力12，OOOg的條件下離心10 min，棄上清液，沉淀即為純化的斑紫菜RNA。實施例三
一種藻類RNA提取劑的使用方法，包括以下步驟
步驟a)處理樣品將超低溫冷凍的羊棲菜，用純凈水沖洗干凈，然后浙干；取浙干后的羊棲菜O. 5g，在液氮中研磨至粉末狀；
步驟b)配制提取劑向Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB與檸檬酸鈉中加入質(zhì)量分數(shù)為O. 2%的DEPC水溶液，然后在室溫下靜置過夜，在121 °C滅菌20min，得到提取劑半成品；向提取劑半成品中加入4mol/L的DTT至終濃度80m mol/L，得到提取劑；其中Tris-HCl的終濃度為O. 2 mol/L, NaCl的終濃度為2. 5 mol/L, EDTA的終濃度為O. 06 mol/L, CTAB的終濃度為O. 15 mmol/L，檸檬酸鈉的終濃度為30 mmol/L ；
步驟c)抽提將步驟a)的粉末狀樣品倒入盛有4mL提取劑的離心管中，渦旋混勻4min，將離心管在室溫下放置30min，期間每隔5min搖晃離心管一次；然后向離心管中加入4mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻4min，然后于4°C，離心力15000g的條件下離心30min ;吸取上清液于另一干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積40%的無水乙醇，渦旋混勻4min ；然后向加入了無水乙醇的上清液中加入4mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻4min，于4°C，離心力15000g的條件下離心30min ；
步驟d):吸取步驟c)抽提后的上清液于干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積40%的12 mol/ L LiCl溶液并潤旋混勻4min, _80°C條件下靜置60min,得到粗樣品；
步驟e)沉淀將步驟d)靜置后的粗樣品于4°C，離心力15000g的條件下，離心40 min ；棄上清液，取出沉淀，用2mL的體積分數(shù)75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于4 °C下，離心力12000g,離心 10 min ；
步驟f):將步驟e)中的上清液于于0-4°C，離心力15000g的條件下，離心40 min，取出沉淀，用2mL體積分數(shù)75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于4 °C下，離心力12000g，離心10min將該次離心得到的沉淀與步驟e)得到的沉淀合并得到粗沉淀；
步驟g):將步驟f)處理后的粗沉淀在30°C下風(fēng)干，然后用50 μ L的質(zhì)量分數(shù)0. 2%的DEPC水溶液溶解風(fēng)干后的沉淀，用RNase-Free DNase set (50)試劑盒去除樣品總RNA中DNA ；
步驟h):將步驟g)去除DNA后的樣品總RNA移入干凈離心管，加入與樣品總RNA等體積的氯仿與異戊醇混合液進行抽提，4 °C，離心力12000g的條件下離心25min;取上清液，移入新離心管內(nèi)，加入上清液體積15%的5 mol/L的醋酸鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH5，然后加入3倍上清液體積的無水乙醇，在_70°C冰浴沉淀60min ;然后在4 V，離心力12，OOOg的條件下離心10 min，棄上清液，沉淀即為純化的羊棲菜RNA。表 I RNA 提取率及 0D260/280 值
編號ENA提取率Ο η Λ 值
U g/l OOmg
實施例I2002.01
實施例22202.02
實施例32402.05
由表中可知，RNA提取率在200 μ g/1OOmg以上，0D260/280值則都大于2。0D260/280值是指核酸所含嘌呤和嘧啶分子具有共軛雙鍵，在260nm波長處有最大吸收峰，蛋白在280nm 波長處有最大吸收峰，故0D260/280值大于2則較好。
權(quán)利要求
1.一種藻類RNA提取劑，其特征在于，所述藻類RNA提取劑由Tris-HCl、NaCl、EDTA,CTAB、DTT、和檸檬酸鈉溶于DEPC水溶液中而成；其中，Tris-HCl的終濃度為0. 05-0. 2 mol/L，NaCl的終濃度為I. 5-2. 5 mol/L, EDTA的終濃度為0. 03-0. 06 mol/L, CTAB的終濃度為.0.05-0.15 mmol/L，檸檬酸鈉的終濃度為25-30 mmol/L，藻類RNA提取劑的終濃度為30-80mmol/L0
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種藻類RNA提取劑，其特征在于，所述DEPC水溶液的質(zhì)量分數(shù)為 0. 1%-0. 2%。
3.—種權(quán)利要求I所述的藻類RNA提取劑應(yīng)用于提取藻類RNA的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步驟 步驟a)處理樣品將新鮮或超低溫冷凍的藻類，用純凈水沖洗干凈，然后浙干；取浙干后的藻類0. 1-0. 5g，在液氮中研磨至粉末狀； 步驟b)配制提取劑向Tris-HCl、NaCl, EDTA, CTAB與檸檬酸鈉中加入質(zhì)量分數(shù)為.0.1-0. 2%的DEPC水溶液，然后在室溫下靜置過夜，在121°C滅菌15-20min，得到提取劑半成品；向提取劑半成品中加入2-4mol/L的DTT至終濃度30-80m mol/L，得到提取劑；其中Tris-HCl的終濃度為0. 05-0. 2 mol/L, NaCl的終濃度為I. 5-2. 5 mol/L, EDTA的終濃度為.0.03-0. 06 mol/L, CTAB 的終濃度為 0. 05-0. 15 mmol/L，檸檬酸鈉的終濃度為 25-30 mmol/L ； 步驟c)抽提將步驟a)的粉末狀樣品倒入盛有2-4mL提取劑的離心管中，渦旋混勻2-4min，將離心管在室溫下放置15_30min，期間每隔5min搖晃離心管一次；然后向離心管中加入2-4mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻2-4min，然后于0_4°C，離心力.10000-15000g的條件下離心15-30min ;吸取上清液于另一干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積.20%-40%的無水乙醇，渦旋混勻2-4min ;然后向加入了無水乙醇的上清液中加入2_4mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻2-4min，于0_4°C，離心力10000_15000g的條件下離心.1.5_30min ； 步驟d):吸取步驟C)抽提后的上清液于干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積20%-40%的12mol/L LiCl溶液并渦旋混勻2-4min，-50一-80°C條件下靜置30_60min，得到粗樣品； 步驟e)沉淀將步驟d)靜置后的粗樣品于0-4°C，離心力12500-15000g的條件下，離心20-40 min ;棄上清液，取出沉淀，用0. 5_2mL的體積分數(shù)70%_75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0-4 "€下,離心力12000g,離心10 min ； 步驟f ):將步驟e)中的上清液于于0-4°C，離心力12500-15000g的條件下，離心20-40min，取出沉淀，用0. 5-2mL體積分數(shù)70%_75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0_4 °C下，離心力12000g，離心10 min將該次離心得到的沉淀與步驟e)得到的沉淀合并得到粗沉淀； 步驟g):將步驟f)處理后的粗沉淀在10-30°C下風(fēng)干，然后用20-50 y L的質(zhì)量分數(shù).0.1%_0. 2%的DEPC水溶液溶解風(fēng)干后的沉淀，用RNase-Free DNase set (50)試劑盒去除樣品總RNA中DNA ； 步驟h):將步驟g) 去除DNA后的樣品總RNA移入干凈離心管，加入與樣品總RNA等體積的氯仿與異戊醇混合液進行抽提，0-4 V，離心力12000g的條件下離心10 -25min;取上清液，移入新離心管內(nèi)，加入上清液體積10%-15%的3-5 mol/L的醋酸鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液的PH4-5，然后加入2-3倍上清液體積的無水乙醇，在_70°C冰浴沉淀45_60min ;然后在0_4V，離心力12，OOOg的條件下離心10 min，棄上清液，沉淀即為純化的藻類RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種藻類RNA應(yīng)用于藻類RNA提取的使用方法，其特征在于，所述步驟c)與步驟h)中氯仿與異戊醇的體積比為24:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的一種藻類RNA應(yīng)用于藻類RNA提取的使用方法，其特征在于，所述步驟a)中所用藻類為紅藻、綠藻或褐藻。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藻類RNA提取劑及使用方法，所述藻類RNA提取劑由Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB、檸檬酸鈉組成；藻類RNA提取劑的使用方法由樣品前處理、抽提、吸取、沉淀、去除DNA等步驟組成。本發(fā)明適用于提取藻類RNA，操作步驟簡單，成本低、穩(wěn)定性好，提取RNA產(chǎn)率高(RNA提取率185-240μg/100mg新鮮藻樣)，純度高(OD260/280值為1.90-2.10)，完全滿足RT-PCR、Real Time PCR和RACE-PCR等實驗的需要。
文檔編號C12N15/10GK102807978SQ20121011147
公開日2012年12月5日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者付萬冬, 廖妙飛, 周宇芳, 楊會成 申請人:浙江省海洋開發(fā)研究院