專利名稱：褐指藻提取物促進(jìn)皮膚細(xì)胞的蛋白酶體活性的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及褐指藻(alga Phaeodactylum)，特別是三角褐指藻(algaPhaeodactylum tricomutum)的提取物作為化妝品的用途，它能促進(jìn)皮膚細(xì)胞，特別是角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞(優(yōu)選人)的蛋白體活性，含有它的化妝品組合物以及化妝品護(hù)理方法。
本發(fā)明進(jìn)一步主要涉及褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物在制造化妝品組合物中的用途，該組合物用于保護(hù)皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化效應(yīng)的出現(xiàn)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在非常多的研究者在致力于尋找在抗人衰老的方法。特別是在化妝品領(lǐng)域中，其中正在進(jìn)行努力防止，或至少延緩明顯皮膚老化效應(yīng)的出現(xiàn)，如皺紋，失去彈性或膚色等。
或多或少長(zhǎng)時(shí)期地暴露于太陽(yáng)輻射，并且主要是紫外線，由于其中期或長(zhǎng)期的有害結(jié)果現(xiàn)在為眾所周知。盡管皮膚的色素形成提供防止UVA(波長(zhǎng)從320納米至400納米)的直接保護(hù)以及防止UVB(波長(zhǎng)從290納米至320納米)的延遲保護(hù)，長(zhǎng)期對(duì)紫外線的暴露會(huì)導(dǎo)致光化性紅斑或日光性彈性纖維病，加速皮膚老化效應(yīng)如皺紋的出現(xiàn)，并且有時(shí)甚至導(dǎo)致皮膚癌的形成。公認(rèn)的，大部分的UVA穿過(guò)表皮，導(dǎo)致氧化種類如自由基，或氧的還原形式的產(chǎn)生，其在皮膚中在各種水平上反應(yīng)而損傷皮膚細(xì)胞，特別是角質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞。這導(dǎo)致炎癥現(xiàn)象或特別地以皺紋形式出現(xiàn)的光化性老化。
已經(jīng)公認(rèn)很長(zhǎng)時(shí)間，皮膚防止UV射線的局部保護(hù)通常是通過(guò)使用在防曬產(chǎn)品或抗衰老產(chǎn)品中的物理過(guò)濾物(filter)和/或化學(xué)過(guò)濾物實(shí)現(xiàn)的。
從Friguet B.等在Ann.N.Y Acad.Sci.2000，908，143-54，標(biāo)題為“Protein degradation by the proteasome and its implication in aging”的出版物中也已知蛋白酶體是一種已知其在細(xì)胞凈化中作用的多催化蛋白復(fù)合體，它的主要功能是將通過(guò)氧化作用被損害的蛋白從細(xì)胞中清除。這個(gè)消除伴隨著多肽的形成，該多肽隨后被細(xì)胞代謝。因此，如由Petropoulos，F(xiàn)riguet等在Journal of Gerontol.Biol.Sci.2000，55A，no.5，B220-B227，標(biāo)題為“Increase of oxidatively modified protein is associated with a decreaseof proteasome activity and content in aging epidermal cells”中所描述，蛋白酶體從細(xì)胞清除出無(wú)用的成分，其通過(guò)積累阻礙細(xì)胞的最優(yōu)機(jī)能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)主要目標(biāo)是解決在提供新型化妝品中存在的新技術(shù)問(wèn)題，該化妝品能夠促進(jìn)皮膚細(xì)胞，特別是優(yōu)選人的角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞的蛋白酶體活性。
本發(fā)明的另一個(gè)主要目標(biāo)是解決在提供新型化妝品中存在的新技術(shù)問(wèn)題，該化妝品能夠保護(hù)皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化效應(yīng)的出現(xiàn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是解決在提供一種方法中存在的技術(shù)問(wèn)題，其互補(bǔ)通過(guò)常規(guī)UV過(guò)濾物(filter)的保護(hù)，特別是通過(guò)參與細(xì)胞的正確機(jī)能，促進(jìn)它們解毒來(lái)輔助它們的作用。
所有的這些技術(shù)問(wèn)題由本發(fā)明第一次以一種簡(jiǎn)單，便宜和可靠的方法解決了，該方法可以在化妝品中工業(yè)化規(guī)模應(yīng)用。
因此，按照第一個(gè)特征，本發(fā)明涉及褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物作為化妝品的用途，它能促進(jìn)皮膚細(xì)胞，特別是角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞(優(yōu)選人)的蛋白酶體活性。
按照第二個(gè)特征，本發(fā)明進(jìn)一步涉及褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物在制造化妝品組合物中的用途，該組合物用于保護(hù)皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化。
按照第三個(gè)特征，本發(fā)明進(jìn)一步包括一種化妝品組合物，該組合物促進(jìn)皮膚細(xì)胞，特別是優(yōu)選人的角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞的蛋白酶體活性，或用于保護(hù)皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化，其特征在于它包括作為其化妝品活性劑之一的褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物，其任選地在化妝品可接受的賦形劑中，皮膚護(hù)理優(yōu)選是在暴露UV線之前的預(yù)防護(hù)理或在暴露UV線之后的恢復(fù)護(hù)理。
按照第四個(gè)特征，本發(fā)明進(jìn)一步包括一種化妝品皮膚護(hù)理的方法，其特征在于它包括有效量的褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物對(duì)需要其的人皮膚的適宜區(qū)域的局部施用，按照局部施用是在暴露UV線之前或之后實(shí)行，目的是獲得預(yù)防或恢復(fù)效果。產(chǎn)生的整體效果是在所述皮膚區(qū)域上的抗衰老效果，特別是通過(guò)改善皮膚的硬度和彈性，延緩皺紋的出現(xiàn)或減少它們的深度。
在本發(fā)明特征之中任何一個(gè)的框架內(nèi)，褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物可在化妝品組合物中存在，基于最終化妝品組合物的總重，其濃度大約為0.01％-10％，特別是約為0.1％-5％。
已指出褐指藻，特別是三角褐指藻是來(lái)源于溫帶氣候的硅藻。該藻因?yàn)槠涓呱L(zhǎng)率而著名，使得某些工業(yè)如農(nóng)業(yè)食品工業(yè)將它作為一種給多種產(chǎn)品增加營(yíng)養(yǎng)的脂類的快速來(lái)源，或還作為一種水產(chǎn)養(yǎng)殖的食物使用。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，提取物是通過(guò)使用極性萃取溶劑和/或非極性萃取溶劑萃取得到。
褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物可以通過(guò)使用極性萃取溶劑和/或非極性萃取溶劑萃取獲得，特別是C1-C6醇或水-醇混合物，C2-C6多羥基醇如乙二醇，氯化的溶劑如氯仿或二氯甲烷，有機(jī)酸的C3-C6酯如乙酸乙酯，C6-C10烷烴如庚烷，C5-C8醚如二異丙基醚。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的變體中，此提取物是通過(guò)使用任選地已經(jīng)呈堿性的醇或水/醇混合物萃取褐指藻，特別是三角褐指藻獲得，所述醇選自異丙醇，乙醇和甲醇。
所選醇優(yōu)選是異丙醇或乙醇。
通常，優(yōu)選在任何萃取操作之前冷凍藻。冷凍優(yōu)選在大約-40℃至-20℃的溫度下實(shí)施并且優(yōu)選大約1-7天時(shí)間。優(yōu)選使用該預(yù)先步驟是為了在與將來(lái)的萃取溶劑接觸時(shí)產(chǎn)生熱沖擊，以促進(jìn)從硅石(來(lái)源于藻細(xì)胞骨架)的傾析。然后讓藻與萃取溶劑接觸。
在一個(gè)優(yōu)選的變體中，冷凍藻直接浸沒(méi)于加熱過(guò)的萃取溶劑中。
在室溫下將藻在萃取溶劑中浸軟(macerated)也是優(yōu)選的。
在一個(gè)優(yōu)選的變體中，在室溫下將藻浸漬優(yōu)選約5-80分鐘的一段時(shí)期，特別優(yōu)選約20-40分鐘的一段時(shí)期。
在另一個(gè)優(yōu)選變體中，萃取是在回流下進(jìn)行。
在除此以外另外一個(gè)優(yōu)選變體中，萃取可在惰性氣氛下，優(yōu)選氮飽和氣氛下進(jìn)行。這使得有可能特別避免明顯的活性分子的氧化降解。
該提取物優(yōu)選在惰性氣體如氮?dú)庀掳b，并且也可以加入抗氧化劑以保護(hù)活性分子。
在以優(yōu)選變體中，每100g藻(以藻的干重表示)使用萃取溶劑的量是大約0.1-20升，優(yōu)選大約2-10升。
在另一個(gè)優(yōu)選變體中，在使用已經(jīng)呈堿性的醇或水-醇混合物萃取的情形中，上述藻提取物是在下列系列步驟以后獲得的，其中的一些上面已經(jīng)描述a)如上所述將藻冷凍并隨后將其浸漬于萃取溶劑中，b)將藻浸軟，c)例如使用氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液使萃取溶劑呈堿性，至pH值為10-14，優(yōu)選13，d)從醇或水-醇相除去不溶物，e)加蒸餾水于醇或水-醇相，f)產(chǎn)生的水-醇溶液用非極性溶劑通過(guò)液-液方法洗滌，該溶劑與醇或水-醇相是不溶混的，例如庚烷，己烷和環(huán)己烷，g)去除含有非極性溶劑的相h)例如使用水性硫酸溶液或水性鹽酸溶液，將除去含非極性溶劑的相之后回收的水-醇相酸化至pH值為1-3，優(yōu)選pH為2，i)酸化后得到的溶液使用非極性溶劑進(jìn)行液-液萃取，該溶劑與醇或水-醇相不混溶，例如庚烷，己烷和環(huán)己烷，j)將水-醇相除去，和k)將除去水-醇相之后回收的含有非極性溶劑的相進(jìn)行蒸發(fā)，產(chǎn)生不含非極性溶劑的油，按照本發(fā)明該油是理想的提取物。
使用已經(jīng)呈堿性并接著被酸化的醇，使得可以獲得具有在化妝品組合物中可接受的視覺(jué)和味覺(jué)特征(黃色和可接受的氣味)的提取物。
在本發(fā)明的第二個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述藻的提取物是通過(guò)用超臨界CO2萃取獲得。使用這種特殊的溶劑意味著藻已經(jīng)預(yù)先凍干。
從下列解釋性的描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)，這些描述是參照本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例和比較活性測(cè)試以及化妝品組合物配方的實(shí)施例給出的，化妝品組合物的配方設(shè)計(jì)是通過(guò)舉例說(shuō)明的方式簡(jiǎn)單地給出，因此不應(yīng)該以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
除非另外說(shuō)明，實(shí)施例中的比例是作為重量百分比表示。溫度是攝氏度并且壓力是大氣壓力。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明實(shí)施例1-褐指藻，特別是三角褐指藻按照本發(fā)明的提取物的制備1.1)通過(guò)第一種方法，用一種極性溶劑如異丙醇(IPA)萃取按照實(shí)施方法的優(yōu)選模式，整個(gè)提取是在惰性氣氛(氮飽和)下進(jìn)行以避免活性分子的明顯降解。
在此實(shí)施例中使用250kg生物量(三角褐指藻)。
將該生物量在-20℃冷凍，然后浸漬于異丙醇(IPA)中，伴隨攪拌在80℃-83℃回流。熱擊使得有可能促進(jìn)從硅石的傾析(來(lái)源于藻細(xì)胞骨架)。
使用溶劑的量為每升包含在生物量中的水10升IPA。這樣，對(duì)于30％的干物質(zhì)比例，上述250kg的生物量是由75kg干物質(zhì)和175kg水組成。在此情形下使用的IPA量為1750kg。
在被冷卻到約50℃之前，整體(生物量+IPA)在大約80℃回流半小時(shí)，同時(shí)攪拌。
在生物量和IPA被冷卻至約50℃后，整體被轉(zhuǎn)移至GUEDU過(guò)濾器，以便將提取過(guò)的生物量和溶解在IPA中的藻提取物分離。
提取液在間歇式反應(yīng)器中濃縮(濃集因數(shù)＝71.5)。濃縮過(guò)的提取物具有油的表觀。
油狀提取物隨后以每kg油10kg溶劑的比例被吸收在冷IPA中。持續(xù)攪拌20分鐘。然后過(guò)濾汁(這使得有可能去除殘遺粘性淤渣)。
通過(guò)加入沸石和活性碳，在室溫下在80升的Schott反應(yīng)器中分兩批進(jìn)行30分鐘的脫色和除臭處理。加入的沸石(ABSENT2000，由UOP提供)量為0.94kg并且加入的活性炭(CXV，由CECA提供)量為1.6kg。木炭對(duì)沸石的比例為1.7。
然后通過(guò)在紙上的過(guò)濾將沸石和活性炭除去。
通過(guò)在IPA中的儲(chǔ)液加入抗氧化劑(DL-α-生育酚終濃度為0.05％重量并且棕櫚酸抗壞血酸酯終濃度為0.05％重量)。
含有抗氧化劑的濾液隨后通過(guò)分批法在惰性氣體如氮?dú)庀聺饪s，直至獲得一種褐色油。
該油此后將被稱為三角褐指藻按照本發(fā)明的提取物E1。1.2)通過(guò)第二種兩步方法萃取，極性溶劑/乙醇，然后液-液萃取，極性溶劑(水-乙醇)，非極性溶劑(庚烷)萃取是從將來(lái)源于250kg的生物量(三角褐指藻)的49.8kg冷凍干物質(zhì)，即大約20％的干物質(zhì)分散于539kg96％的無(wú)水乙醇中開(kāi)始，用9kg的30.5％水性氫氧化鈉溶液使無(wú)水乙醇呈堿性。在乙醇的回流點(diǎn)浸軟30分鐘后，在氮?dú)庀聦⒄w冷卻至18℃。
在氮?dú)庀峦ㄟ^(guò)過(guò)濾分離不溶物并隨后將其去除。
151kg蒸餾水被加入到573.9kg的濾液中。緩慢攪拌該水-醇相10分鐘，然后通過(guò)液-液方法用162kg庚烷洗滌。丟棄液-液分配的庚烷上層相。回收下層相，因?yàn)樗}形式的脂肪酸，這是由于在萃取開(kāi)始時(shí)進(jìn)行的堿化。再重復(fù)兩次庚烷洗滌操作并系統(tǒng)地回收下層相。
通過(guò)加入2.8kg的硫酸酸化以此方式獲得的720kg下層相，直至pH為2.2，從而將脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗岬男问?。在氮?dú)庀聰嚢枵麄€(gè)溶液10分鐘，然后使用非極性溶劑進(jìn)行液-液萃取，所述非極性溶劑在此情形下是158kg庚烷。重復(fù)庚烷洗滌操作5次以回收總共697kg的庚烷相，該相來(lái)源于五種含游離脂肪酸的級(jí)分。此相在旋轉(zhuǎn)式蒸化器上蒸發(fā)至干燥，然后通過(guò)分子蒸餾以表示為0.65kg油的量得到按照本發(fā)明的活性提取物。
產(chǎn)生的油是一種均勻液體并且在顏色上是暗黃。
該油此后將被稱為三角褐指藻按照本發(fā)明的提取物E2。實(shí)施例2-按照本發(fā)明的提取物，即上述實(shí)施例1.2的E2，在UV輻射不存在或存在時(shí)作為促進(jìn)人皮膚細(xì)胞，特別地角質(zhì)細(xì)胞的蛋白酶體活性的試劑的效果評(píng)價(jià)在本實(shí)施例中用到的褐指藻提取物是在通過(guò)上面實(shí)施例1.2上下文中描述的萃取方法得到的提取物E2。
下面描述的研究是在正常人角質(zhì)細(xì)胞(NHK)上進(jìn)行的。
按照本發(fā)明的提取物E2在皮膚細(xì)胞上的作用是以兩種不同方式檢測(cè)，或者基于蛋白酶體三種蛋白水解活性，或者通過(guò)測(cè)定氧化蛋白的量，其在或多或少的程度上作為蛋白酶體活性變異的函數(shù)而積累。
1)檢測(cè)的原理1.1)表征蛋白酶體活性的3種酶活的測(cè)定第一種類型的檢測(cè)涉及三種表征蛋白酶體的活性類胰凝乳蛋白酶活性，后谷氨酸水解酶(postglutamic hydrolase)活性和最后類胰蛋白酶活性。而且它們是通過(guò)3個(gè)不同催化位點(diǎn)承載的。蛋白酶體的每種多肽活性是通過(guò)使用對(duì)于每種活性特異的熒光多肽底物，在對(duì)于蛋白酶體特異的抑制劑的存在和不存在時(shí)測(cè)定的。因而檢測(cè)的原理在于使用分光熒光計(jì)跟蹤熒光隨時(shí)間的增強(qiáng)，這是由于來(lái)源于熒光多肽的熒光團(tuán)的釋放。
1.2)氧化蛋白量的測(cè)定第二種類型的測(cè)量是用作對(duì)酶活測(cè)定的補(bǔ)充，以便通過(guò)一種常規(guī)檢測(cè)方法評(píng)價(jià)氧化蛋白的量。所述量隨蛋白酶體活性反向變化，因此該測(cè)定使得可以衡量按照本發(fā)明的化妝品對(duì)蛋白酶體活性的作用。
用于檢測(cè)氧化蛋白的Oxyblot(Western blot)技術(shù)是以如Leammli U.K.在“Cleavage of structural protein during the assembly of the head of thebacteriophage T4”，Nature，1970，277，680-685中所描述的常規(guī)方式進(jìn)行。
使用了該公知技術(shù)的涉及膜上蛋白免疫檢測(cè)的部分，從與抗體保溫起特別改編。它在2.6)中描述。
在UV暴露的情形下，用劑量分別為10焦耳/cm2和0.05焦耳/cm2的UVA和UVB輻射人角質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。這些數(shù)值對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)是恒定的。
1.3)蛋白(蛋白酶體)量的測(cè)定在通過(guò)Oxyblot進(jìn)行的活性測(cè)定同時(shí)，平行實(shí)施另一個(gè)蛋白檢測(cè)技術(shù)以系統(tǒng)地確定在每個(gè)樣品的每一等分部分中存在的蛋白量。這個(gè)技術(shù)以Bradford方法的名字為人所知。在此它是以一種如Bradford M.在“Arapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding”，Anal.Biochem.72，248(1976)中所描述的常規(guī)方式使用。由于對(duì)于活性檢測(cè)所選擇的實(shí)驗(yàn)方案，系統(tǒng)地實(shí)施該技術(shù)。事實(shí)上，下面描述的實(shí)驗(yàn)是對(duì)具有不同等分體積的恒定量的蛋白進(jìn)行的，隨后將不同等分體積補(bǔ)足至200μl(恒定總體積)。
2)材料和方法2.1)正常人角質(zhì)細(xì)胞(NHK)的培養(yǎng)正常人角質(zhì)細(xì)胞(NHK)的培養(yǎng)物是產(chǎn)生于皮膚樣品。
在第一步中樣品在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水-Sigma)(50ml管)中漂洗4次。隨后通過(guò)在兩個(gè)連續(xù)70％乙醇的浴器中浸泡3秒凈化。當(dāng)已經(jīng)凈化樣品后，將其放置于含PBS的培養(yǎng)皿中。裁剪出1mm寬的長(zhǎng)條，小心去除最大量的脂肪組織和真皮。當(dāng)它們變得可利用時(shí)，將長(zhǎng)條放置于含PBS的培養(yǎng)皿中。為了能夠從表皮上回收角質(zhì)細(xì)胞，在37℃下將長(zhǎng)條放置于胰蛋白酶在PBS中的25％溶液中4小時(shí)。
然后通過(guò)用手術(shù)刀刮削長(zhǎng)條從表皮上分離真皮，獲得的表皮懸浮在含有DMEM(Dulbecco Modified Eagle’s Medium-Gibco)+10％ of FCS(Fetal Calf Serum-Eurobio)的試管中。在懸浮液均化之后，丟棄包含角膜細(xì)胞的表面部分，在篩子上過(guò)濾剩余物。
濾過(guò)部分在176g離心5分鐘。殘余物用NHK-D培養(yǎng)基(DMEM+10％FCS+0.4μg/ml氫化可的松+10ng/ml EGF(表皮生長(zhǎng)因子)+10-9M霍亂毒素)吸收。細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并且隨后以細(xì)胞/瓶的比率接種。
培養(yǎng)24h后，改變培養(yǎng)基，用PBS漂洗細(xì)胞，并且將K-SFM增殖培養(yǎng)基(Gibco)用于剩余的培養(yǎng)。
以完全常規(guī)的方式傳代培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞，但需要在60-70％匯合時(shí)將它們傳代以便它們保持它們的增殖能力。這樣，當(dāng)細(xì)胞是60-70％匯合時(shí)，丟棄維持液并用PBS漂洗細(xì)胞簇。讓細(xì)胞與3ml胰蛋白酶/EDTA溶液接觸；然后，當(dāng)細(xì)胞脫離后，用含10％ FCS(Eurobio)的培養(yǎng)基抑制胰蛋白酶。均化，回收細(xì)胞懸浮液并接著在室溫下20g離心5分鐘。只用培養(yǎng)基吸收產(chǎn)生的殘余物。為了維持，接種是如上以106細(xì)胞/75cm2的比率在保持在上述條件下的通氣燒瓶中進(jìn)行。在大約十天后獲得匯合并且細(xì)胞可以擴(kuò)增6-7代。
在想要檢測(cè)一種物質(zhì)在這些角質(zhì)細(xì)胞上的活性的情形中，試驗(yàn)將在上述的匯合時(shí)刻在含有角質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基上進(jìn)行。
2.2)裂解緩沖液制備裂解緩沖液首先需要制備下列溶液1.5M Tris-HCl，pH＝7.5將45.375g Tris堿(sigma；T1503)溶解于200ml蒸餾水中，用12N的HCl調(diào)節(jié)pH值至7.5，然后補(bǔ)足至250ml。
1M蔗糖溶液(Merck；ref.7654)溶解8.55g蔗糖于25ml蒸餾水中。
2mM MgSO4溶液(Sigma；ref.M7506)溶解0.01g的MgSO4于20ml蒸餾水中。
4％Triton X100溶液(Sigma；ref.X100)溶解0.8g Triton X100于20ml蒸餾水中，然后分成0.5ml等分部分并保存在-20℃。
40mM PMSF溶液(Sigma；ref.P7626)溶解14mg PMSF于2ml無(wú)水乙醇中，分成50μl等分部分并保存在-20℃。
0.5mg/ml亮抑酶肽溶液(Sigma；ref.L2884；-20℃保存)分成50μl等分部分并保存在-20℃。
1M DL-二硫蘇糖醇溶液(Sigma；ref.D0632；4℃保存)將0.154g DL-二硫蘇糖醇溶解于1ml蒸餾水，分成10μl等分并保存在-20℃。
為了制備100ml裂解緩沖液，首先需要制備在表1中描述的所謂的不完全溶液，將其分成4.39ml的等分部分(即將其分為每個(gè)都等于4.39ml的小體積)并在-20℃保存表1制備裂解緩沖液的不完全溶液

裂解緩沖液或所謂的完全溶液在使用前使用4.39ml不完全溶液+500μl4％ Triton 100X+10μlof1M DTT+50μl 0.5mg/ml亮抑酶肽+50μl40mM PMSF即時(shí)制備。
2.3)Bradford法檢驗(yàn)蛋白步驟是常規(guī)的并且要求下列校準(zhǔn)范圍的制劑從BSA儲(chǔ)液50μg/ml(BIORAD；標(biāo)準(zhǔn)蛋白；ref.500-0006)每管中加入200μl考馬斯藍(lán)G250。
所述考馬斯藍(lán)是在使用前通過(guò)稀釋儲(chǔ)液至1/5即時(shí)制備。
為了制備樣品，從裂解緩沖液中回收細(xì)胞，接著在測(cè)定它們的蛋白濃度之前進(jìn)行超聲處理。
如果樣品的蛋白濃度大于3mg/ml，需要將它們稀釋至1/100，然后用700μl水和200μl考馬斯藍(lán)稀釋100μl的細(xì)胞提取液。如果濃度低，則需要取10μl細(xì)胞提取物和790μl水以及200μl考馬斯藍(lán)。樣品被旋渦振蕩。在等待5分鐘后，在BMG FLUOstar分光熒光計(jì)上在595nm處很快地讀出結(jié)果。所述結(jié)果在表2中比較。
表2蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)(Bradford法)校準(zhǔn)

2.4)測(cè)試樣品的制備2.4.1)活性檢測(cè)樣品的制備在說(shuō)明書(shū)結(jié)尾處的圖解1中描述了培養(yǎng)的一般原理，基于提取物E2的處理和使用UVA和UVB的輻射。在不同時(shí)間按照2.1)回收并按照2.2)裂解在培養(yǎng)物中的NHK，這取決于設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，即在用按照本發(fā)明的提取液處理之前或之后和/或在UV輻射之前或之后。試圖分析的蛋白酶體存在于這些細(xì)胞裂解物的上清液中。
不同類型的樣品如下-I1＝參比+只有提取液E2-I2＝參比+提取液E2在UV前-I3＝參比+提取液E2在UV后每次將每一體積的上清液分成三等分并且將同一個(gè)樣品的等分放置于一個(gè)微平板讀數(shù)器上。加入對(duì)于各種活性特異的熒光多肽底物(作為蛋白量的函數(shù))。下面描述的分光熒光計(jì)操作是用恒定總體積，但對(duì)于每個(gè)樣品不同體積Vi的等分部分進(jìn)行的。對(duì)于不同的Vi使用恒定量的蛋白意味著引入的蛋白量必須首先通過(guò)在2.3)中描述的Bradford法檢查。
因而其目的就是記錄引入的每mg蛋白質(zhì)存在蛋白的量。
2.4.2)測(cè)量氧化蛋白量實(shí)驗(yàn)的樣品的制備應(yīng)用的一般培養(yǎng)原則和圖解1中所描述的一樣。Oxyblot(Western blot)技術(shù)，或蛋白質(zhì)電泳，致使樣品Ii在凝膠上遷移。然后將它們轉(zhuǎn)移至膜上，其與期望抗體保溫。為了測(cè)量氧化蛋白的量，與抗-二硝基苯(抗-DNP)多克隆抗體進(jìn)行保溫以檢測(cè)蛋白質(zhì)的羰基基團(tuán)，該基團(tuán)在進(jìn)行活性測(cè)試之前已經(jīng)反應(yīng)。
2.5)蛋白酶體酶活的檢測(cè)a)介紹為了檢測(cè)蛋白酶體的酶活，用PBS漂洗培養(yǎng)的NHK細(xì)胞兩次，然后在對(duì)蛋白酶體特異的抑制劑，即MG132(N-Cbz-Leu-Leu-leucinal)存在或不存在時(shí)，通過(guò)使用對(duì)每種活性特異的熒光多肽底物確定蛋白酶體的各種肽酶活性。多肽底物如下針對(duì)類胰凝乳蛋白酶活性的Leu-Leu-Val-Tyr-氨基甲基香豆素(LLVY-amc)，針于后谷氨酸水解酶(postglutamichydrolase)活性的Leu-Leu-Glu-β-萘胺(LLE-na)和針對(duì)類胰蛋白酶活性的Leu-Ser-Thr-Arg-amc(LSTR-amc)。檢測(cè)的原理在于使用分光熒光計(jì)跟蹤熒光隨時(shí)間的增強(qiáng)，這是由于來(lái)源于熒光多肽的熒光團(tuán)氨基甲基香豆素或β-萘胺(na)的釋放。
為了測(cè)量UV對(duì)蛋白酶體的影響，用恒定劑量的10J/cm2UVA和0.05J/cm2UVB輻射在培養(yǎng)物中的正常人角質(zhì)細(xì)胞，或NHK，此后在輻射后的不同時(shí)間回收并裂解它們。
b)蛋白酶體三種蛋白水解酶活性類胰凝乳蛋白酶，后谷氨酸水解酶和類胰蛋白酶活性是對(duì)從細(xì)胞裂解物提取的蛋白酶體測(cè)量，測(cè)量使用在下列濃度下的熒光多肽作為底物12.5μM的LLVY-amc，150μM的LLE-na和40μM的LSTR-amc。對(duì)于測(cè)量的每個(gè)系列，需要與對(duì)每種活性特異的熒光底物進(jìn)行另外的保溫。這些活性是與對(duì)蛋白酶體特異的抑制劑，即20μM的MG132(N-Cbz-Leu-Leu-leucinal)平行測(cè)定的，以檢測(cè)與蛋白酶體無(wú)關(guān)的活性的比例。
2.5.1)測(cè)定LLVY(類胰凝乳蛋白酶)活性的方法下面給出的這個(gè)方法的原理，除了試劑，它對(duì)于三種活性是相同的。
所謂的類胰凝乳蛋白酶活性是與胰凝乳蛋白酶活性類似的活性，它通過(guò)在芳香族氨基酸，在此情形中酪氨酸之后的切割而表示。蛋白酶體(LLVY活性)N-琥珀酰-LLVY-amc→N-琥珀酰-LLVY+熒光amc熒光素是通過(guò)切割反應(yīng)釋放。因此，在第一步中，通過(guò)讀取分光熒光計(jì)(FLUOstar(BMG))可以獲得表示為熒光單位每分鐘(FU/min)的粗結(jié)果。熒光單位是儀器的函數(shù)，因此是任意的。
我們?nèi)我獾剡x擇以樣品中存在的每mg蛋白(蛋白酶體)每min釋放pmol的amc表示蛋白酶體活性。為此，取自NHK培養(yǎng)物的每個(gè)樣品的蛋白(蛋白酶體)量首先通過(guò)Bradford方法檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)是使用不同的體積Vi進(jìn)行的，只不過(guò)總反應(yīng)體積保持恒定為200μl。一條amc校準(zhǔn)曲線也被預(yù)先確定，以便能夠使由儀器在給定的樣品Ii上產(chǎn)生的結(jié)果與那些蛋白量已知的結(jié)果相互關(guān)聯(lián)。
為了這個(gè)目的使用下列試劑-25mM TRIS緩沖液，pH7.5-用于校準(zhǔn)曲線7-氨基-4-甲基香豆素(amc)(SigmaA9891)20mM儲(chǔ)液(3.5 mg/1 ml DMSO)-用于活性測(cè)定熒光底物N-琥珀酰-Leu-Leu-Val-Tyr-7-酰氨基-4-甲基香豆素(SigmaS6510)10mM在DMSO中的儲(chǔ)液amc校準(zhǔn)范圍是通過(guò)將amc儲(chǔ)液在TRIS緩沖液中稀釋至4μM制備的。每個(gè)數(shù)量一式兩份分配至96-孔平板。
使用200ul TRIS緩沖液跑一個(gè)空白。然后在350nm的激發(fā)波長(zhǎng)和440nm的發(fā)射波長(zhǎng)處在分光熒光計(jì)上迅速讀出結(jié)果。
獲得的用于校準(zhǔn)曲線(斜率a的直線)的結(jié)果在下面表3中比較
表3amc校準(zhǔn)曲線

為了測(cè)定LLVY活性，固定體積的細(xì)胞裂解物(通過(guò)Bradford法測(cè)定以便每次相同量的蛋白質(zhì)最終被導(dǎo)入)被一式兩份導(dǎo)入96-孔平板。實(shí)際上，這是樣品的最低蛋白濃度(其必須相當(dāng)于20μg蛋白質(zhì))。用TRIS緩沖液將體積補(bǔ)足至100μl。
樣品然后保溫，加入100μl針對(duì)LLVY活性的熒光多肽底物，其首先已經(jīng)在TRIS緩沖液中被稀釋至25μM(為了12.5μM的最終濃度)。
然后在355nm的激發(fā)波長(zhǎng)和460nm的發(fā)射波長(zhǎng)處在分光熒光計(jì)上迅速讀出結(jié)果，增益為40，每2分鐘讀一次共30分鐘。
粗結(jié)果表示為FU/min，該單位是儀器的函數(shù)。
測(cè)定是在含有Vi體積細(xì)胞裂解物的200μl的恒定反應(yīng)體積上進(jìn)行的，其作為裂解物蛋白(蛋白酶體)濃度的函數(shù)被固定。
在使用前即時(shí)測(cè)定的蛋白濃度表示為μg/μl。
基于校準(zhǔn)范圍，通過(guò)使用下列經(jīng)驗(yàn)公式活性可以表示為每分鐘每mg蛋白釋放的amc(以pmol表示)

(a＝4.568.104)對(duì)于分為等分部分的每個(gè)樣品Ii，要求測(cè)定釋放的amc量并將其表示為pmol/min/mg蛋白。這是通過(guò)使用校準(zhǔn)曲線完成。在分光熒光計(jì)上迅速讀出的量與上述曲線斜率的比值給我們提供了表示為μmol/l/min蛋白的最初的中間結(jié)果。
然后足以用最終反應(yīng)體積(200μl)乘這個(gè)值，并除以要測(cè)定的樣品Ii等分體積Vi，并除以在使用前即刻通過(guò)Bradford方法測(cè)定的蛋白量。于是最后結(jié)果除了調(diào)節(jié)因子可表示為pmol/min/mg蛋白。
Ri＝(N.Vt/Vi.Qi).系數(shù)N＝每升每分鐘釋放的蛋白摩爾量Vt＝終反應(yīng)體積(200μl)Vi＝樣品Ii的等分體積(μl)Qi＝通過(guò)Bradford方法測(cè)定的蛋白量(μg)如果應(yīng)用上述方式，Ri代表研究蛋白(蛋白酶體)的量，任意的表示為pmol/min/mg引入蛋白(蛋白酶體)。
2.5.2)測(cè)定LSTR活性(類胰蛋白酶活性)的方法研究下列切割反應(yīng)蛋白酶體(LSTR)活性Nt-Boc-LSTR-amc→Nt-Boc-LSTR+熒光amc通過(guò)使用下列試劑首先進(jìn)行amc校準(zhǔn)，使用一個(gè)相同的公式可以獲得LSTR活性-25mM TRIS緩沖液，pH7.5-用于校準(zhǔn)曲線7-氨基-4-甲基香豆素(amc)(SigmaA9891)20mM儲(chǔ)液(3.5mg/1ml DMSO)在設(shè)定在350nm的激發(fā)波長(zhǎng)和440nm的發(fā)射波長(zhǎng)處的分光熒光計(jì)上很快地讀出原始結(jié)果。
-用于活性測(cè)定熒光底物N-t-Boc-Leu-Ser-Thr-Arg7-7-酰氨基-4-甲基香豆素(SigmaB4636)在DMSO中10mM的儲(chǔ)液胰蛋白酶抑制劑MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)(親和性，ZW8440)在DMSO中的20mM儲(chǔ)液獲得的用于校準(zhǔn)曲線的結(jié)果(斜率b的直線)在下面表4中比較表4amc校準(zhǔn)曲線

對(duì)于活性測(cè)定，在355nm(激發(fā)波長(zhǎng))和460nm(發(fā)射波長(zhǎng))處在FLUOstar(BMG)上讀出結(jié)果，增益為30，每2分鐘讀一次共30分鐘。
結(jié)果也可以使用與先前那個(gè)類似的另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)公式獲得

(b＝1.728.104)2.5.3)測(cè)定LLE活性(后谷氨酸水解酶活性)的方法研究下列切割反應(yīng)蛋白酶體(LLE活性)N-CBZ-LLE-na→N-CBZ-LLE+熒光na按照相同的方案進(jìn)行校準(zhǔn)，這次涉及底物β-萘胺(na)，使用下列試劑-25mM TRIS緩沖液，pH＝7.5
-用于校準(zhǔn)曲線β-萘酰胺(na)(SigmaN8381)20mM儲(chǔ)液(5.73mg/2ml DMSO)在激發(fā)波長(zhǎng)333 nm和發(fā)射波長(zhǎng)410nm處在分光熒光計(jì)上讀出結(jié)果。獲得的用于na校準(zhǔn)曲線(斜率c的直線)的結(jié)果在下面表5中比較表5na校準(zhǔn)曲線

-用于活性測(cè)定熒光底物N-CBZ-Leu-Leu-Glu-β-萘胺(SigmaC0788)10mM在DMSO中的儲(chǔ)液在340nm(激發(fā)波長(zhǎng))和410nm(發(fā)射波長(zhǎng))處在FLUOstar(BMG)上讀出測(cè)量結(jié)果，增益為30，每2分鐘讀一次共35分鐘。
使用與先前活性相同的方法，于是使用下列經(jīng)驗(yàn)公式可以獲得對(duì)LLE活性的測(cè)量，其中蛋白(蛋白酶體)量表示為pmol釋放的na/分鐘/mg引入的蛋白(蛋白酶體)

(c＝0.966.104)
2.6)測(cè)定積累的氧化蛋白量2.6.1)通過(guò)OXYBLOT測(cè)定(Western blot)目的是檢測(cè)羰基基團(tuán)(氧化標(biāo)記)，其已經(jīng)通過(guò)對(duì)氧作用敏感的種類(ROS＝活性氧種類)或另外對(duì)其它氧化機(jī)制如糖化反應(yīng)/糖氧化反應(yīng)(glycoxidation)或脂過(guò)氧化反應(yīng)(lipoperoxidation)，按照位點(diǎn)特異性機(jī)制敏感的種類被引入到蛋白鏈中。
原理如下。鏈中的羰基基團(tuán)與2，4-二硝基苯肼(DNPH)反應(yīng)生成腙衍生物。如對(duì)于常規(guī)Westem blot，通過(guò)在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離用DNP標(biāo)記的樣品，然后轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜。然后在第一抗體存在下將膜保溫，該抗體對(duì)于與具有羰基基團(tuán)的蛋白結(jié)合的DNP分子是特異的。下一步是用與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的第二(抗-兔)抗體保溫。顯示是使用在2.6.2)中描述的試劑實(shí)現(xiàn)的。
2.6.2)方案所有使用的試劑來(lái)源于OXYBLOT試劑盒(Appligene-Oncor，Illkirch，F(xiàn)rance)。
A-樣品的制備和電泳我們使用來(lái)源于5μl輻射過(guò)或未輻射過(guò)的角質(zhì)細(xì)胞裂解物的15-20μg蛋白。加入10μl 2，4-二硝基苯肼(DNPH)和5μl12％ SDS并接著讓反應(yīng)在室溫進(jìn)行15min。隨后加入7.5μl中和液(試劑盒中提供)。樣品然后準(zhǔn)備上樣(deposit)。
通過(guò)Laemmli的方法(1970)，在變性和還原條件下和在不連續(xù)緩沖液中，在濃度為12.5％、1mm厚的聚丙烯酰胺凝膠上低分子量蛋白進(jìn)行電泳。凝膠含有12.5％的T(T＝丙烯酰胺+二丙烯酰胺)和2.7％的C(C＝(二丙烯酰胺/丙烯酰胺)+二丙烯酰胺)，這使得它可以分離分子量為20-12kDa的蛋白質(zhì)。使用的儀器來(lái)源于Hoefer。下面給出凝膠顯色所要求的所有溶液I)在不連續(xù)緩沖液中，在變性和還原條件下用于制備電泳凝膠的緩沖液和溶液?jiǎn)误w溶液40％丙烯酰胺/二丙烯酰胺，2.6％ C(Biorad；ref.161-0148)分離凝膠緩沖液1.5M Tris-HCl，pH＝8.8
溶解18.15g Tris堿(Sigma；T1503)于100ml蒸餾水中并用12N的HCL調(diào)節(jié)pH值至8.8。
濃縮凝膠(stacking gel)緩沖液0.5M Tris-HCl，pH＝6.8溶解6g Tris堿于100ml蒸餾水中并用12N的HCL調(diào)節(jié)pH值至6.8。
10X遷移緩沖液0.25...Tris，pH＝8.3；1.92M甘氨酸；1％ SDS使用到下列試劑12g Tris堿，57.6g甘氨酸(Research Organics Inc.；5037G)，40ml 10％ SDS(Sigma；L5750)，并用蒸餾水將體積補(bǔ)足至400ml。
這些溶液保存在4℃。
過(guò)硫酸銨，(NH4)282O8(Sigma；A1433)濃度為10％，即100mg/ml。將溶液分為等分部分并保存在-20℃。
4X還原性樣品緩沖液2.5ml0.25 M的Tris-HCl，pH＝6.8；0.4g 8％的SDS；2ml 40％的甘油；1ml 20％的β-巰基乙醇；一匙尖0.02％的溴酚藍(lán)。該溶液室溫保存。
預(yù)染的低分子量標(biāo)樣(Biorad；ref.161-0305)。這些包括磷酸化酶B(104kDa)，牛血清蛋白(82kDa)，卵清蛋白(48.3kDa)，碳酸酐酶(33.4kDa)，大豆胰蛋白酶抑制劑(28.3kDa)和溶菌酶(19.4kDa)。II)電泳膠含有12.5％T的分離凝膠的制備表6

含有4％T的濃縮凝膠的制備表7

分離凝膠的制備可以在前一天或同一天但無(wú)論如何在遷移之前兩小時(shí)灌該凝膠。
將兩塊凝膠灌入所用的模子。該裝置是通過(guò)順序疊加下列各項(xiàng)組裝紅色封條，加過(guò)黑色潤(rùn)滑脂的黑封條，一塊塑料，一個(gè)大平板，一塊塑料，一塊氧化鋁平板，墊板(白色的用于1mm凝膠；黑色用于1.5mm凝膠)，一塊玻璃平板，一塊塑料，一塊氧化鋁平板，墊板，一塊玻璃平板，三塊塑料，然后蓋子。產(chǎn)生的裝置用夾子固定在一起并放置于平面區(qū)域上。
使用P5000移液管將凝膠灌注至離準(zhǔn)備濃縮凝膠的梳子的底部大約0.5mm處。將梳子移去并隨后輕輕地加水以便凝膠是平坦的(±0.5ml水/凝膠)。
用鋁覆蓋裝置并且在聚合過(guò)程中不應(yīng)移動(dòng)。
濃縮凝膠的制備將分離膠(在鋁和玻璃平板之間)從模子移開(kāi)并放置在電泳儀器上。如果只有一塊凝膠，這必須用一塊玻璃平板替換。
將梳子插入至鋁平板和玻璃平板中間。隨后用巴斯德(Pasteur)聚乙烯轉(zhuǎn)移移液管(Biorad，ref.223-9528)灌凝膠。在聚合之前，檢查凝膠的高度并且如果樣品體積較高對(duì)其進(jìn)行調(diào)整。凝膠聚合一小時(shí)。
樣品的制備在回收包含在器皿中的細(xì)胞之前，用PBS漂洗它們兩次。在最后漂洗后，盡可能的去除PBS。通過(guò)刮擦將細(xì)胞回收至裂解緩沖液(cf.圖解1)中(最低5.106細(xì)胞/ml裂解緩沖液)。將裂解物冷凍于-80℃。
在上樣之前，將解凍的裂解物超聲處理并隨后檢測(cè)上述樣品中的蛋白。
上樣的體積取決于蛋白量(最大蛋白量60μg；最大體積＝25μl，最小體積＝5μl)。按照預(yù)備試驗(yàn)，各個(gè)樣品的上樣體積相當(dāng)于10μg蛋白。
在分離膠聚合的同時(shí)測(cè)定蛋白。上樣將250ml遷移緩沖液灌注于凝膠上，在凝膠，玻璃平板和電泳儀器之間，以及槽內(nèi)。
隨后樣品在10,000g離心5min，然后上樣。與0.3μg HSP32(TEBU，ref.SPP-730，分為0.1μg/ml的等分并在-20℃冷凍)一起，另外加樣10μl預(yù)染過(guò)的標(biāo)樣(Biorad，預(yù)染過(guò)的SDS-PAGE標(biāo)樣，ref.161-0305)。遷移電泳是在室溫下，在制冷下進(jìn)行，在濃縮膠遷移過(guò)程中使用非限制的300V電壓和使用恒定電流強(qiáng)度(15mA)。一旦樣品已到達(dá)分離凝膠，電流強(qiáng)度降低到10mA。
當(dāng)遷移前沿到達(dá)凝膠的底部時(shí)停止電泳(大約1小時(shí)30分鐘的遷移)。
B-將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上并且封閉特定結(jié)合位點(diǎn)當(dāng)遷移結(jié)束，在室溫下，伴隨攪拌，讓凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20分鐘，本方法是基于該緩沖液上的，所述緩沖液由Towbin H.，Staehelin T.和Gordon J.在“Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gelsto nitrocellulose sheetsprocedure and some applications”，Proc.Natl.Sci.，USA 1979，76，4350-4354中描述。
讓具有良好機(jī)械強(qiáng)度和高蛋白固定容量的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Biorad，reff. 162-0184)在100％的甲醇中浸濕直至它透明，然后在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡直至它完全浸漬(20min)。
將先前在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕的一張厚過(guò)濾紙(Biorad，ref.17033960)，PVDF膜和凝膠導(dǎo)入半干的轉(zhuǎn)移儀器(Biorad)中，并且將另一濕過(guò)濾紙片放置于正極。注意必須保證用玻璃棒除去不同層之間的氣泡，以避免任何轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。隨后用作為陰極的蓋子密封儀器。
在非限制電流強(qiáng)度(5.5mA/cm2，250mA)和恒定電壓(15V)下讓蛋白遷移30分鐘。
然后將膜放置于用于封閉特定結(jié)合位點(diǎn)的溶液中，伴隨攪拌，4℃過(guò)夜，該溶液包括在TBS-T緩沖液(25ml)中的10％(25g)的脫脂乳(Régilait)。
C-抗原-抗體反應(yīng)在PVDF膜上的蛋白質(zhì)的免疫檢測(cè)借助于其底物使用ECL(增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光)試劑盒顯示過(guò)氧化物酶。
在封閉非特異位點(diǎn)后，在TBS-T中將膜漂洗15分鐘一次，5分鐘兩次。
隨后讓該膜在室溫下，攪拌下與稀釋至1/150的抗-DNP兔初級(jí)抗體接觸一小時(shí)。
隨后在TBS-T將其漂洗15分鐘一次，5分鐘兩次以去除過(guò)量的沒(méi)有被固定的游離抗體。
然后讓其與在TBS-T(5ml)中稀釋至1/5000的抗兔二級(jí)抗體(Amersham；ref.NA934；stored at 4℃)在室溫下，攪拌下接觸一小時(shí)。
在保溫一小時(shí)后，用TBS-T緩沖液快速漂洗兩次，隨后用TBS-T緩沖液15分鐘漂洗一次和最后5分鐘四次。
在排水之后，將其以蛋白質(zhì)側(cè)面，即向上放置于食品級(jí)的薄膜(SARAN)上。
使用高敏感性的檢測(cè)試劑盒，通過(guò)化學(xué)發(fā)光(Amersham；ECL Westernblotting，ref.RPN2106)使用魯米諾作為過(guò)氧化物酶的底物使膜顯影。在過(guò)氧化物酶和放大器的作用下，魯米諾被氧化并進(jìn)入到激活的過(guò)渡態(tài)。其通過(guò)發(fā)射光子返回至基態(tài)，該光子隨后與放置于膜上的放射自顯影薄膜反應(yīng)。
將檢測(cè)試劑盒的兩種溶液各1ml混合(2ml，覆蓋膜的最小體積)。
立即將混合物均勻的傾瀉在膜上并且讓其在室溫下與膜接觸正好1分鐘。
在莎綸食品級(jí)的薄膜下保護(hù)排干水的膜，將其放置于遮光的盒子中，隨后用預(yù)閃蒸過(guò)的放射自顯影薄膜覆蓋(Amersham，Hyperfilm ECL，ref.RPN2103)。
在曝光一小時(shí)后，回收放射自顯影薄膜，浸漬于薄膜顯影液(radio顯影液，LX24，Kodak)中5分鐘，然后用水漂洗，最后在用水再次漂洗之前通過(guò)浸漬于定影液最少5分鐘(radio定影液，AL4，Kodak)定影。
將薄膜干燥并使用軟件Gels Analysts3.01量化記錄的條帶。
3)測(cè)試結(jié)果3.1)按照本發(fā)明的提取物E2對(duì)于NHK蛋白酶體活性的影響按照在圖解1中描述的對(duì)于參比和對(duì)于用按照本發(fā)明的提取物處理過(guò)的樣品的方案制備這里使用的樣品。取15μl的等分部分并按照2.5)進(jìn)行活性測(cè)定。
在表8，9和10中給出的結(jié)果顯示，在加入按照本發(fā)明的藻提取物(Ph)7小時(shí)后，蛋白酶體的3種肽酶活性增強(qiáng)，這個(gè)增強(qiáng)對(duì)于它們中的兩個(gè)是顯著的(類胰凝乳蛋白酶和類胰蛋白酶活性)。另外，觀測(cè)到在用Ph處理7小時(shí)的NHK中，胞內(nèi)氧化蛋白的量比參比細(xì)胞少(圖4，泳道1和2)。這說(shuō)明觀察到的按照本發(fā)明的萃取物，對(duì)蛋白酶體肽酶活性的刺激作用是通過(guò)胞內(nèi)氧化蛋白比例的降低來(lái)表現(xiàn)。實(shí)際上，該測(cè)試是在細(xì)胞裂解物的8μg等分部分上進(jìn)行的。在輻射7小時(shí)后制備3種類型的樣品，I1，I2和I3并且隨后在DNPH的存在下保溫15min。然后用Amersham試劑盒中提供的中和液終止反應(yīng)。
3.2)UVA+UVB對(duì)原代培養(yǎng)物中的NHK的蛋白酶體的影響使用UVA和UVB按照符合圖例1原理的方案輻射按照2.1)的人角質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。對(duì)于此研究選擇的紫外線劑量對(duì)于UVA為10焦耳/cm2對(duì)于UVB為0.05焦耳/cm2。在用這兩種劑量的UVA和UVB結(jié)合輻射之后，在不同時(shí)間測(cè)量蛋白酶體的三種肽酶活性。對(duì)于這個(gè)測(cè)試，細(xì)胞在輻射后1小時(shí)，3小時(shí)，7小時(shí)和24小時(shí)后裂解，并且按照2.3)確定蛋白(蛋白酶體)濃度。按照2.5)進(jìn)行活性測(cè)量，使用的熒光底物濃度對(duì)于LLVY-amc是12.5μM，對(duì)于LLE-na是150μM，最后對(duì)于LSTR-amc是40μM。與MG132(20μM)平行測(cè)定這些活性以便計(jì)算出獨(dú)立于蛋白酶體的活性的比例。在

圖1，2和3中給出的結(jié)果是表示為相對(duì)于未輻射參比的％，并且顯示在UVA+UVB暴露后分析的三種肽酶活性降低四倍。該實(shí)驗(yàn)證明在用紫外線輻射之后蛋白酶體的活性受到影響。還可以看到分開(kāi)輻射和活性測(cè)定的時(shí)間越長(zhǎng)，影響越大(7 h和24h)。
3.3)當(dāng)其在UVA+UVB輻射之前施用時(shí)，藻Ph的提取物對(duì)NHK蛋白酶體活性的影響在輻射中和輻射后必需加入抗氧化維生素(50μM的生育酚和1mM的磷酸抗壞血酸酯)以保持提取物E2的功效。用按照本發(fā)明的提取物(5μg/ml的劑量+維生素)處理按照2.1)的人角質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)物，然后用UVA+UVB輻射并最終使其裂解。在表11，12和13中包含的結(jié)果顯示在用UVA+UVB輻射后，在按照本發(fā)明的提取物的存在下，蛋白酶體肽酶活性的降低被完全阻止。因?yàn)閷?duì)于未處理/未輻射的參比NHK和處理/輻射過(guò)的NHK24h后的蛋白酶體肽酶活性水平是相同的，基于按照本發(fā)明的提取物的化妝品可以保持蛋白酶體的肽酶活性，因此它具有抗UVA+UVB的保護(hù)效果。
3.4)在輻射后褐指藻(Ph)的提取物對(duì)NHK蛋白酶體活性的影響用UVA和UVB的劑量輻射人角質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)物，隨后用按照本發(fā)明的2.5μg/ml提取物E2處理7小時(shí)。發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)氧化蛋白的量隨UV輻射增加，但當(dāng)細(xì)胞已經(jīng)用按照本發(fā)明的提取物E2處理后，增加程度較小。實(shí)驗(yàn)在3.1)中描述并且結(jié)果如圖4中所示(泳道3和4)。使用上述提取物可以更好地去除氧化蛋白。而且，表14，15和16給出的結(jié)果顯示，當(dāng)在輻射后進(jìn)行處理時(shí)，基于按照本發(fā)明的提取物E2的處理顯著地恢復(fù)3種蛋白酶體活性。這蛋白酶體活性的完全恢復(fù)表明，基于Ph的試劑在蛋白酶體活性方面具有對(duì)UVA+UVB影響的恢復(fù)作用。
如在3.1)中看到，對(duì)于用按照本發(fā)明的提取物E2處理過(guò)的NHK，胞內(nèi)氧化蛋白的量比在參比樣品中少(cf.圖13，泳道1和泳道2)。這說(shuō)明在使用按照本發(fā)明的提取物E2時(shí)，觀測(cè)到的對(duì)蛋白酶體活性的刺激效果是通過(guò)胞內(nèi)氧化蛋白比例的降低來(lái)表現(xiàn)。圖4的泳道3和泳道4顯示，UV輻射確實(shí)產(chǎn)生更多量的氧化蛋白(與斑點(diǎn)的亮度成比例)，但這個(gè)量在使用所述按照本發(fā)明的提取物后顯著減小。
實(shí)施例1用于臉的抗衰老日霜

實(shí)施例2用于臉的抗皺紋乳-凝膠

實(shí)施例3用于身體的硬化乳狀液

實(shí)施例4用于臉的抗皺紋乳-凝膠

圖例1
表8(在使用按照本發(fā)明的提取物E2處理后測(cè)定來(lái)源于NHK的蛋白酶體的LLVY活性)

**對(duì)于15μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.2919X xFU/min則為顯著(S)
表9(在使用按照本發(fā)明的提取物E2處理后測(cè)定來(lái)源于NHK的蛋白酶體的LLE活性)

**對(duì)于15μl的等分部分，如果p值≤0.05/1.3794X xFU/min則為顯著(S)
表10(在使用按照本發(fā)明的提取物E2處理后測(cè)定來(lái)源于NHK的蛋白酶體的LSTR活性)

**對(duì)于35μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.3307X xFU/min則為顯著(S)
表11(在UVA和UVB輻射之前24h使用按照本發(fā)明的提取物E2預(yù)處理后測(cè)定來(lái)源于NHK的蛋白酶體的LLVY活性)

**對(duì)于20μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.2189X xFU/min則為顯著(S)
表12(在UVA和UVB輻射之前24h使用按照本發(fā)明的提取物E2預(yù)處理后測(cè)定來(lái)源于NHK的蛋白酶體的LLE活性)

**對(duì)于20μl的等分部分，如果p值≤0.05/1.0346X xFU/min則為顯著(S)
表13(在UVA和UVB輻射之前24h使用按照本發(fā)明的提取物E2預(yù)處理后測(cè)定來(lái)源于NHK的蛋白酶體的LSTR活性)

**對(duì)于50μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.2315X xFU/min則為顯著(S)
表14(用UVA和UVB輻射，之后使用按照本發(fā)明的提取物E2處理后7h，測(cè)定來(lái)源于NHK的蛋白酶體的LLVY活性)

**對(duì)于20l的等分部分，如果p值≤0.05/0.2189X xFU/min則為顯著(S)
表15(用UVA和UVB輻射，之后使用按照本發(fā)明的提取物E2處理后7h，測(cè)定來(lái)源于NHK的蛋白酶體的LSTR活性)

**對(duì)于40μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.2894X xFU/min則為顯著(S)
表16(用UVA和UVB輻射，之后使用按照本發(fā)明的提取物E2處理后7h，測(cè)定來(lái)源于NHK的蛋白酶體的LLE活性)

**對(duì)于20μl的等分部分，如果p值≤0.05/1.0346X xFU/min則為顯著(S)
權(quán)利要求
1.褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物作為化妝品的用途，其中所述化妝品能促進(jìn)皮膚細(xì)胞，特別是角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞(優(yōu)選人)的蛋白酶體活性。
2.褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物在制備用于保護(hù)皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化效應(yīng)出現(xiàn)的化妝品組合物中的用途。
3.按照權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于所述藻提取物以基于最終組合物的總重量大約0.01％-10％的濃度用于化妝品組合物中。
4.按照權(quán)利要求1至3中一項(xiàng)的用途，其特征在于上述提取物已經(jīng)通過(guò)使用一種極性萃取溶劑和/或一種非極性萃取溶劑萃取獲得。
5.按照權(quán)利要求4的用途，其特征在于一種或多種萃取溶劑是C1-C6醇或水-醇混合物，C2-C6多羥基醇如乙二醇，氯化的溶劑如氯仿或二氯甲烷，有機(jī)酸的C3-C6酯如乙酸乙酯，C6-C10烷烴如庚烷，C5-C8醚如二異丙基醚。
6.按照權(quán)利要求5的用途，其特征在于上述提取物是通過(guò)使用醇或水/醇混合物萃取藻獲得的，其中該醇或水/醇混合物已經(jīng)任選地呈堿性，所述醇是選自異丙醇，乙醇和甲醇。
7.按照權(quán)利要求6的用途，其特征在于上述提取物是通過(guò)使用異丙醇萃取藻獲得的。
8.按照權(quán)利要求6的用途，其特征在于上述提取物是通過(guò)使用乙醇萃取藻獲得的。
9.按照權(quán)利要求4至8中一項(xiàng)的用途，其特征在于在萃取藻之前冷凍藻，冷凍優(yōu)選在大約-40℃至-20℃的溫度下實(shí)施并且優(yōu)選大約1-7天時(shí)間，此后讓其與萃取溶劑接觸。
10.按照權(quán)利要求9的用途，其特征在于將冷凍過(guò)的藻直接浸漬于加熱過(guò)的萃取溶劑中。
11.按照權(quán)利要求4至10中一項(xiàng)的用途，其特征在于在任何萃取操作之前，于室溫下將藻在萃取溶劑中浸軟。
12.按照權(quán)利要求11的用途，其特征在于將藻浸軟大約5-80分鐘的一段時(shí)間，特別優(yōu)選大約20-40分鐘的一段時(shí)間。
13.按照權(quán)利要求4至12中一項(xiàng)的用途，其特征在于萃取是在回流下進(jìn)行。
14.按照權(quán)利要求4至13中一項(xiàng)的用途，其特征在于萃取是在惰性氣氛下，優(yōu)選在氮飽和氣氛下進(jìn)行。
15.按照權(quán)利要求6至14中一項(xiàng)的用途，其特征在于上述藻提取物在下列的系列步驟后獲得a)按照權(quán)利要求9冷凍藻并隨后按照權(quán)利要求10浸漬于萃取溶劑中，所述萃取溶劑是在權(quán)利要求6至8中限定的醇或水-醇溶劑，b)按照權(quán)利要求11或12浸漬藻，c)例如使用水性氫氧化鈉溶液或水性氫氧化鉀溶液，使萃取溶劑呈堿性至pH值為10-14，優(yōu)選地pH值為13，d)從醇或水-醇相中除去不溶物質(zhì)，e)將蒸餾水加入到醇或水-醇相，f)通過(guò)液-液方法使用非極性溶劑洗滌產(chǎn)生的水-醇溶液，該非極性溶劑與醇或水-醇相是不混溶的，例如庚烷，己烷或環(huán)己烷，g)去除含有非極性溶劑的相，h)例如使用水性硫酸溶液或水性鹽酸溶液，將除去含非極性溶劑相之后回收的水-醇相酸化至pH值為1-3，優(yōu)選至pH值為2，i)酸化后得到的溶液使用非極性溶劑進(jìn)行液-液萃取，該溶劑與醇或水-醇相是不混溶的，例如庚烷，己烷和環(huán)己烷，j)然后將水-醇相除去，并且k)將除去水-醇相之后回收的含有非極性溶劑的相進(jìn)行蒸發(fā)，產(chǎn)生不含非極性溶劑的油，該油是理想的提取物。
16.按照權(quán)利要求4至15中一項(xiàng)的用途，其特征在于每100g藻使用萃取溶劑的量是大約0.1-20升，優(yōu)選大約2-10升，其中藻是以干重表示。
17.按照權(quán)利要求1至3其中一項(xiàng)的用途，其特征在于所述藻提取物已經(jīng)通過(guò)使用超臨界CO2萃取獲得。
18.化妝品組合物，其促進(jìn)皮膚細(xì)胞，特別是角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞(優(yōu)選人)的蛋白酶體活性，用于保護(hù)皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化效應(yīng)，其特征在于它包含作為化妝品活性劑的褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物，其任選地在化妝品可接受的賦形劑之中。
19.按照權(quán)利要求18的組合物，其特征在于提取物是例如在權(quán)利要求4至17中任何一項(xiàng)所限定的，并且以例如在權(quán)利要求3中所限定的濃度存在于在所述組合物中。
20.化妝品皮膚護(hù)理的方法，其特征在于它包括化妝品有效量的例如在權(quán)利要求1至17中任何一項(xiàng)所限定的藻提取物，以例如在權(quán)利要求18或19中所限定的組合物的形式對(duì)需要它的人皮膚的適宜區(qū)域的局部施用，皮膚護(hù)理優(yōu)選是在暴露UV線之前的預(yù)防護(hù)理或在暴露UV線之后的恢復(fù)護(hù)理。
全文摘要
本發(fā)明涉及褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物作為化妝品的用途，它能促進(jìn)皮膚細(xì)胞，特別是角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞(優(yōu)選人)的蛋白酶體活性。本發(fā)明使得可以制造一種用于保護(hù)皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化效應(yīng)的化妝品組合物。
文檔編號(hào)A61Q17/04GK1499957SQ02807855
公開(kāi)日2004年5月26日 申請(qǐng)日期2002年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月3日
發(fā)明者C·尼扎德, B·弗里蓋特, M·莫羅, A－L·比爾托, A·索努瓦, C 尼扎德, 榷, 鋦翹 申請(qǐng)人:Lvmh里爾茲經(jīng)濟(jì)利益集團(tuán)