專利名稱：利用酪丁酸梭菌發(fā)酵甘蔗渣水解液生產(chǎn)丁酸的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)丁酸的工藝，尤其是利用酪丁酸梭菌發(fā)酵甘蔗渣水解液生產(chǎn)丁酸的工藝，屬于有機(jī)酸發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
正丁酸(Butyric acid，以下簡稱丁酸)，又名酪酸，分子中含有四個碳原子，是以直鏈型方式相連接的短鏈飽和脂肪酸，具有刺激性氣味，極稀溶液也有汗臭味。丁酸常以酯的形式或游離狀態(tài)存在于自然界中。丁酸是一種多用途的精細(xì)化學(xué)品，廣泛應(yīng)用于食品、化學(xué)和醫(yī)藥等行業(yè)。在食品工業(yè)中配制糖果、飲料調(diào)味劑，在香料工業(yè)中用于配制果子香精； 丁酸纖維素在防老化、耐水性、收縮性等方面均優(yōu)于醋酸纖維素；醋酸丁酸纖維素酯能溶于許多溶劑中，與樹脂、塑料互混能力比單醋酸纖維素酯強(qiáng)，并具有良好的耐熱、耐光和抗?jié)裥?；還能用于醫(yī)藥中間體的制備，如Y-氨基丁酸的抗缺氧能力顯著，(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是用于合成多種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的重要中間體，用于治療高血壓和充血性心力衰竭等心血管疾?。淮送?，丁酸鈉鹽還可作為替代抗生素的飼料添加劑飼喂家禽，以促進(jìn)生長。目前，丁酸的生產(chǎn)工藝以化學(xué)合成法為主，包括正丁醛氧化法、丙烯羰基合成法、 丁醇氧化法等，其中以間歇式丁醛氧化制備丁酸工藝在工業(yè)上的應(yīng)用最為廣泛，但工藝復(fù)雜操作條件苛刻，環(huán)境污染嚴(yán)重等傳統(tǒng)化工普遍存在的問題沒有得到有效解決。隨著化石性資源日漸枯竭、傳統(tǒng)化工造成環(huán)境的嚴(yán)重污染以及人們對生物基化學(xué)品和生物能源需求的快速增加，化學(xué)工業(yè)呈現(xiàn)出從石油基到生物基的轉(zhuǎn)變趨勢。在這一轉(zhuǎn)變過程中，可再生生物質(zhì)資源利用和生物加工是一個重大的研究方向，特別是非糧原料和廢棄生物質(zhì)已成為當(dāng)前生物煉制工程的熱點。另外，由于丁酸和下游衍生產(chǎn)品相當(dāng)比例應(yīng)用于食品、飼料和醫(yī)藥等行業(yè)，從生物質(zhì)出發(fā)經(jīng)過生物合成的丁酸(稱為生物丁酸)更受歡迎。微生物發(fā)酵法利用的產(chǎn)丁酸菌多為專性厭氧菌，主要包括梭菌屬iClostridiimd、 丁酸弧菌屬(伽化乃>功_^0)、丁酸桿菌屬力acteri腫)、八疊球菌屬、Sarcina、、真桿菌屬iEubac terium )、梭桿菌屬(.Fusobac terium )禾口巨球形菌屬(Megasphaera )等。其中，梭菌屬細(xì)菌為革蘭氏陽性的產(chǎn)芽孢桿菌，屬化能異養(yǎng)型的專性厭氧菌，易從土壤、廢水、 動物消化系統(tǒng)、乳制品污染環(huán)境中分離得到，生長培養(yǎng)基配方簡單，對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，已成為眾多國內(nèi)外學(xué)者研究微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的出發(fā)菌株。在眾多產(chǎn)丁酸菌株中，酪丁酸 ■ (Clostridium tyrobutyricum)能代謝葡萄糖、木糖和果糖合成丁酸、乙酸、氫氣和二氧化碳，相比于丙酮-丁醇菌株，其代謝途徑簡單，主產(chǎn)物丁酸產(chǎn)量穩(wěn)定、得率高，副產(chǎn)物氫氣產(chǎn)量高，亦能利用廉價的生物質(zhì)資源作為原料，具有廣闊的商業(yè)應(yīng)用前景。但迄今為止， 由于生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸存在原料成本高(占產(chǎn)品成本的20-50%)、單位體積產(chǎn)量低(質(zhì)量濃度小于100 g/L)、副產(chǎn)物乙酸含量高等缺點，使其始終無法替代化學(xué)合成法，因此，尋找廉價的基質(zhì)原料，在此基礎(chǔ)上探索高效穩(wěn)定的發(fā)酵工藝以提高單位體積丁酸產(chǎn)量并降低副產(chǎn)物，對于生物法制備丁酸的工業(yè)化應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實意義。
甘蔗渣主要由半纖維素和木聚糖構(gòu)成，經(jīng)水解可生成葡萄糖和木糖。而酪丁酸梭菌能夠利用葡萄糖、木糖、乳糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、甘油等生產(chǎn)丁酸，而且能夠利用多種非糧作物(如木薯)及工農(nóng)業(yè)廢棄物(乳清、玉米皮酸水解物、甘蔗糖蜜、木薯渣水解液和玉米漿等)生產(chǎn)丁酸，表明丁酸發(fā)酵能夠充分利用多種可再生資源轉(zhuǎn)化的可發(fā)酵性糖，是生物煉制工程中最有前景的方向之一。運用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝生產(chǎn)丁酸往往出現(xiàn)生產(chǎn)效率低、細(xì)胞生長對丁酸的選擇性低、 終產(chǎn)物的抑制作用導(dǎo)致丁酸濃度和得率低等難題，這些也造成丁酸分離難度大和成本高。 纖維床生物反應(yīng)器(FBB)是由美國俄亥俄州立大學(xué)的楊尚天教授等人在改進(jìn)傳統(tǒng)的填充床反應(yīng)器性能的基礎(chǔ)上設(shè)計出的一種簡單、高效的生物反應(yīng)器，適用于厭氧微生物固定化發(fā)酵，并首先應(yīng)用于丙酸發(fā)酵。纖維床生物反應(yīng)器選擇棉纖維織物等纖維材料作為固定細(xì)胞的載體，具有以下優(yōu)點①材料化學(xué)惰性，對細(xì)胞不具毒害作用，也不會被細(xì)胞降解，不影響微生物的生長代謝；②具有較高的孔隙率(>95%)和比表面積(>40 m2/m3)，因此具有良好的傳質(zhì)性能；③具有較高的載體活性，即固定化細(xì)胞的活性回收率高；④單位體積固定的細(xì)胞數(shù)多(細(xì)胞密度最高可達(dá)70 g/L)；⑤容易獲得，價格便宜，固定化成本低；⑥制備方法簡單，固定化過程溫和，適于大規(guī)模生產(chǎn)；⑦有較高的機(jī)械強(qiáng)度(以不銹鋼絲支撐能進(jìn)一步強(qiáng)化其機(jī)械強(qiáng)度)，能較長時間使用；⑧生物、化學(xué)及熱力學(xué)穩(wěn)定，因此成為一種理想的細(xì)胞固定載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種利用酪丁酸梭菌發(fā)酵甘蔗渣水解液生產(chǎn)丁酸的工藝。一方面，可以降低微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸的成本，提高丁酸發(fā)酵產(chǎn)率和得率，另一方面，可以資源化利用甘蔗渣等農(nóng)業(yè)廢棄物。本發(fā)明的利用纖維床固定化發(fā)酵甘蔗渣生產(chǎn)丁酸的工藝，包括以下步驟
1)用接種針蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50 mg / mL丁酸鈉的強(qiáng)化培養(yǎng)基平板上劃線后，置37 °C培養(yǎng)72小時；酪丁酸梭菌(編號ATCC 25755)的分類命名中文名為酪丁酸梭菌，拉丁文學(xué)名為Clostridium i_Frotoi_F_ri / ，酪丁酸梭菌購自位于美國華盛頓的美國典型培養(yǎng)物保藏中心((American Type Culture Collection)。2)將步驟1)平板上的單菌落接種于含50 mL生長培養(yǎng)基的100 mL厭氧瓶中培養(yǎng) 72小時，得到一級種子；
3)取1.5 mL 一級種子接種于含50 mL生長培養(yǎng)基的100 mL厭氧瓶中培養(yǎng)72小時， 得到二級種子，作為發(fā)酵母種；
4)取3mL發(fā)酵母種接種于含100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL厭氧瓶中培養(yǎng)48小時后，接種于含2 L生長培養(yǎng)基的5 L預(yù)發(fā)酵罐中進(jìn)行M小時的擴(kuò)大培養(yǎng)，使菌體濃度達(dá)到6. 0-10. 0 g/L，利用蠕動泵以60-100 mL/min的速度將經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)液泵入纖維床生物反應(yīng)器內(nèi)，維持循環(huán)，當(dāng)游離的菌體濃度降為1.0-3.0 g/L，將上述的培養(yǎng)液更換為甘蔗渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行批次發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵或反復(fù)批次發(fā)酵，得到丁酸；發(fā)酵過程中， 攪拌轉(zhuǎn)速控制在150 rpm，溫度設(shè)定為37° C，用6 mol/L的NaOH維持pH在6. 0 ；
上述的甘蔗渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括總糖70 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨 5 g/L、(NH4)2SO4 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgS047H20 0.6 g/L、FeSOJH2O 0. 03 g/L ；所說的總糖為甘蔗渣水解液配制而成，其中甘蔗渣水解液制備方法如下將烘干后的甘蔗渣與 0. 3mol/L硫酸以質(zhì)量比1:10混合，于121°C水解30 min，過濾，離心取上清，將pH值調(diào)至 6. 0 ；
上述的生長培養(yǎng)基成分為葡萄糖30 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨5 g/L、(NH4) 2S04 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgS047H20 0.6 g/L、FeS047H20 0. 03 g/L ；
上述的強(qiáng)化培養(yǎng)基是在生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加50 mg / mL 丁酸鈉，培養(yǎng)條件 37° C、pH 6. 0、厭氧環(huán)境。本發(fā)明以甘蔗渣水解液為碳源，利用纖維床生物反應(yīng)器進(jìn)行固定化發(fā)酵，若甘蔗渣水解液僅批次發(fā)酵得到的丁酸濃度較低，會給后續(xù)分離帶來較大困難。為了進(jìn)一步提高丁酸產(chǎn)量，在發(fā)酵過程中，當(dāng)總糖濃度接近0時，可采用補(bǔ)充甘蔗渣水解液，形成以甘蔗渣水解液為碳源的固定化補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)丁酸工藝。為了反復(fù)利用纖維床生物反應(yīng)器進(jìn)行固定化發(fā)酵，也可以甘蔗渣水解液為碳源，反復(fù)進(jìn)行批次發(fā)酵，形成以甘蔗渣水解液為碳源的固定化反復(fù)批次發(fā)酵工藝。實現(xiàn)固定化發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的連續(xù)性，并降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明的有益效果在于
從糧食安全和生產(chǎn)成本角度，研究利用非糧原料一甘蔗渣水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的生物煉制工藝。甘蔗渣水解液的預(yù)處理工序操作條件溫和，設(shè)備簡單，易于進(jìn)行工業(yè)放大，對提高丁酸產(chǎn)量效果明顯。發(fā)酵過程中，纖維床生物反應(yīng)器能有效大量固定活力高、代謝能力強(qiáng)的菌體(50-70 g/Ι)，有利于簡化操作流程，省去反復(fù)接種、擴(kuò)大培養(yǎng)以及清洗罐體等工序，延長工作周期(可連續(xù)操作1-3個月)，提高運行過程的穩(wěn)定性，反復(fù)批次發(fā)酵甘蔗渣水解液仍能維持較高的糖酸轉(zhuǎn)化率(0. 38-0. 50 g/g發(fā)酵糖)，具有廣闊的工業(yè)化前景。本發(fā)明工藝簡單，以甘蔗渣水解液為碳源，利用纖維床生物反應(yīng)器進(jìn)行固定化發(fā)酵，可以資源化利用甘蔗渣等農(nóng)業(yè)廢棄物，降低發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸的成本，提高丁酸發(fā)酵產(chǎn)率和得率，同時可省去反復(fù)接種，并連續(xù)長期穩(wěn)定運行，易于進(jìn)行工業(yè)放大。


圖1是發(fā)酵丁酸的纖維床生物反應(yīng)器系統(tǒng)示意圖中1.攪拌式預(yù)發(fā)酵罐；2.雙向蠕動泵；3.纖維床固定化裝置；4. PH電極； 5. pH監(jiān)測器；6.尾氣吸收裝置；7.儲堿瓶；8.氮氣補(bǔ)入裝置。圖2是批次發(fā)酵丁酸的動力學(xué)圖；圖中
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HB- WjSflI ................不 τ — 4jBJi ',‘― J Bl —資一 OOi,.,。圖3是補(bǔ)料發(fā)酵丁酸的動力學(xué)圖；圖中
蘭5糖-一本糖一二^ 乙睡一+:_ 丁_ 一*一 。圖4是反復(fù)批次發(fā)酵丁酸的動力學(xué)圖；圖中
+蘭萄糖—-木精一> 乙融—+.++,+— 丁睡.-^ODsv。
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具體實施例方式實施例1
5本實施例給出的是以甘蔗渣水解液為碳源進(jìn)行纖維床固定化酪丁酸梭菌批次發(fā)酵丁酸的工藝，步驟如下
1)用接種針蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50 mg / mL丁酸鈉的強(qiáng)化培養(yǎng)基平板上劃線后，37 °C培養(yǎng)72小時。酪丁酸梭菌(編號ATCC 25755)的分類命名中文名為酪丁酸梭菌，拉丁文學(xué)名為Clostridium i_Frotoi_F_ri / ，酪丁酸梭菌購自位于美國華盛頓的美國典型培養(yǎng)物保藏中心((American Type Culture Collection)。強(qiáng)化培養(yǎng)基成分包括葡萄糖30 g/Ι，酵母抽提物5 g/Ι，蛋白胨5 g/1，(NH4) 2S04 3 g/1, K2HPO4 1.5 g/1, MgS047H20，0.6 g/1, FeS047H20 0. 03 g/1, 50 mg/mL 丁酸鈉， 培養(yǎng)條件37° C、PH 6. 0、厭氧環(huán)境。2) 將平板上的單菌落接種于含50 ml生長培養(yǎng)基的100 ml血清瓶中培養(yǎng)72 小時，得到一級種子。生長培養(yǎng)基成分為葡萄糖30 g/Ι、酵母抽提物5 g/Ι、蛋白胨5 g/ 1、(NH4)2SO4 3 g/1、K2HPO4 1.5 g/1、MgS047H20 0.6 g/1、FeS047H20 0. 03 g/1 ；
3)取1.5 ml 一級種子接種于含50 ml生長培養(yǎng)基的100 ml厭氧瓶中培養(yǎng)72小時， 得到發(fā)酵母種；
4)取3mL發(fā)酵母種接種于含100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL厭氧瓶中培養(yǎng)48小時后，接種于含2 L生長培養(yǎng)基的5 L攪拌式預(yù)發(fā)酵罐中進(jìn)行M小時的擴(kuò)大培養(yǎng)，使菌體濃度達(dá)到8.0 g/L，利用蠕動泵以80 mL/min的速度將經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)液泵入如圖1所示的纖維床生物反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行循環(huán)，當(dāng)大部分菌體固定在纖維床內(nèi)，即游離的菌體濃度降為2. 0 g/ L時，將上述培養(yǎng)液更換為甘蔗渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵。攪拌轉(zhuǎn)速控制在150 rpm, 發(fā)酵溫度為37° C，用6 mo/L NaOH維持pH在6. 0 ；
圖1中攪拌式預(yù)發(fā)酵罐通過管路連接右邊帶有恒溫水夾套的玻璃柱材質(zhì)纖維床固定化裝置(0 50 mm X 310 mm)。其中185 mm X 300 mm棉布織物(厚5 mm，空隙率90 %) 用不銹鋼絲網(wǎng)固定成螺旋狀，置于反應(yīng)器柱體內(nèi)，底部填充25-38 mm高的玻璃彈簧以使流體分布均勻，其工作體積為480 ml。上述的甘蔗渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括總糖70 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨 5 g/L、(NH4) 2S04 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgS047H20 0.6 g/L、FeS047H20 0. 03 g/ L?？偺菫楦收嵩庖号渲贫桑渲懈收嵩庖褐苽浞椒ㄈ缦聦⒑娓珊蟮母收嵩c 0. 3mol/L硫酸按質(zhì)量比1:10混合，于121°C水解30 min，過濾，離心取上清，將pH值調(diào)至 6. 0 ；
待發(fā)酵液中糖濃度接近0時即停止發(fā)酵，批次發(fā)酵丁酸的動力學(xué)如圖2所示。實施例2
本實施例給出的是以甘蔗渣水解液為碳源纖維床固定化酪丁酸梭菌補(bǔ)料發(fā)酵丁酸的工藝，步驟如下
1)同實施例1步驟1);
2)同實施例1步驟2);
3)同實施例1步驟3);
4)操作步驟同實施例1步驟4)，區(qū)別在于當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度接近0時，補(bǔ)加甘蔗渣水解液，共補(bǔ)加3批，直至發(fā)酵產(chǎn)物丁酸的終濃度不再增加。發(fā)酵186小時后總糖濃度不再下降，氣相色譜法測得丁酸終濃度為62. 8 g/L。補(bǔ)料發(fā)酵丁酸的動力學(xué)如圖3所示。
實施例3
本實施例給出的是以甘蔗渣水解液為碳源纖維床固定化酪丁酸梭菌反復(fù)批次發(fā)酵丁酸的工藝，步驟如下
1)同實施例1步驟1);
2)同實施例1步驟2);
3)同實施例1步驟3);
4)操作步驟同實施例1步驟4)，區(qū)別在于發(fā)酵過程中當(dāng)糖濃度接近0時更換新的甘蔗渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基，共更換5批，氣相色譜法測得丁酸平均終濃度為22. 9 g/L，反復(fù)批次發(fā)酵丁酸的動力學(xué)如圖4所示。
權(quán)利要求
1.利用酪丁酸梭菌發(fā)酵甘蔗渣水解液生產(chǎn)丁酸的工藝，其特征是包括以下步驟1)用接種針蘸取酪丁酸梭菌菌液，在含有50mg / mL丁酸鈉的強(qiáng)化培養(yǎng)基平板上劃線后，置37 °C培養(yǎng)72小時；2)將步驟1)平板上的單菌落接種于含50mL生長培養(yǎng)基的100 mL厭氧瓶中培養(yǎng)72小時，得到一級種子；3)取1.5 mL 一級種子接種于含50 mL生長培養(yǎng)基的100 mL厭氧瓶中培養(yǎng)72小時，得到二級種子，作為發(fā)酵母種；4)取3mL發(fā)酵母種接種于含100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL厭氧瓶中培養(yǎng)48小時后，接種于含2 L生長培養(yǎng)基的5 L預(yù)發(fā)酵罐中進(jìn)行24小時的擴(kuò)大培養(yǎng)，使菌體濃度達(dá)到6. 0-10. 0 g/L，利用蠕動泵以60-100 mL/min的速度將經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)液泵入纖維床生物反應(yīng)器內(nèi)，維持循環(huán)，當(dāng)游離的菌體濃度降為1.0-3.0 g/L，將上述的培養(yǎng)液更換為甘蔗渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行批次發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵或反復(fù)批次發(fā)酵，得到丁酸；發(fā)酵過程中，攪拌轉(zhuǎn)速控制在150 rpm，溫度設(shè)定為37° C，用6 mol/L的NaOH維持pH在6. 0 ；上述的甘蔗渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括總糖70 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨5g/L、(NH4)2SO4 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgSO4·7Η20 0.6 g/L、FeSO4.7Η20 0. 03 g/L ；所說的總糖為甘蔗渣水解液配制而成，其中甘蔗渣水解液制備方法如下將烘干后的甘蔗渣與0. 3mol/L硫酸以質(zhì)量比1:10混合，于121°C水解30 min，過濾，離心取上清，將pH值調(diào)至6. 0 ；上述的生長培養(yǎng)基成分為葡萄糖30 g/L、酵母抽提物5 g/L、蛋白胨5 g/L、(NH4)2S04 3 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgSO4·7Η20 0.6 g/L、FeS04*7H20 0. 03 g/L ；上述的強(qiáng)化培養(yǎng)基是在生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加50 mg/mL 丁酸鈉，培養(yǎng)條件37° C、pH 6. 0、厭氧環(huán)境。
全文摘要
本發(fā)明公開的利用酪丁酸梭菌發(fā)酵甘蔗渣水解液生產(chǎn)丁酸的工藝，步驟包括將酪丁酸梭菌接種于種子培養(yǎng)基中，得到一級種子；取一級種子接種于種子培養(yǎng)基，得到二級種子作為發(fā)酵母種；將發(fā)酵母種接種于預(yù)發(fā)酵罐中經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液泵入纖維床生物反應(yīng)器內(nèi)，維持循環(huán)，當(dāng)游離的菌體濃度降為1.0-3.0g/L，將培養(yǎng)液更換為甘蔗渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行批次發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵或反復(fù)批次發(fā)酵，得到丁酸；本發(fā)明工藝簡單，以甘蔗渣水解液為碳源，利用纖維床生物反應(yīng)器進(jìn)行固定化發(fā)酵，可以資源化利用甘蔗渣等農(nóng)業(yè)廢棄物，降低發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸的成本，提高丁酸發(fā)酵產(chǎn)率和得率，同時可省去反復(fù)接種，并連續(xù)長期穩(wěn)定運行，易于進(jìn)行工業(yè)放大。
文檔編號C12R1/145GK102559782SQ201210042829
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者徐志南, 施周銘, 王金, 蔡謹(jǐn), 黃磊 申請人:浙江大學(xué)