專利名稱：生物基質(zhì)支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基質(zhì)支架和產(chǎn)生生物基質(zhì)支架的方法，以及它們作為完整支架或作為以各種方式被切片或粉碎以及被分散以用于特定的實(shí)驗(yàn)和臨床用途的支架在不同應(yīng)用中的用途。
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背景技術(shù)：
先體內(nèi)后體外(ex vivo)或臨床項(xiàng)目如細(xì)胞療法中使用分化細(xì)胞的能力取決于維持具有成體表型并具有完全功能或可以譜系限制干細(xì)胞或祖細(xì)胞(“干/祖細(xì)胞”)以實(shí)現(xiàn)該成體表型的細(xì)胞的能力。干細(xì)胞研究中正在進(jìn)行的革命已經(jīng)使得干/祖細(xì)胞群體包括來(lái)自胚胎、胎兒和出生后組織的那些的鑒定和分離成為可能^針對(duì)所有成體細(xì)胞類型鑒定和分離干/祖細(xì)胞的能力以及使它們擴(kuò)增和分化的能力極大地增加了利用它們用于制藥學(xué)及其他工業(yè)研究項(xiàng)目、用于學(xué)術(shù)研究以及用于臨床項(xiàng)目諸如基于細(xì)胞的療法和組織工程的潛能2。目前用于先體內(nèi)后體外維持分化`細(xì)胞或?qū)⒏杉?xì)胞譜系限制為成體命運(yùn)的方法是部分成功的，并且涉及將細(xì)胞鋪板在或嵌入一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的基質(zhì)并嵌入對(duì)于所需成體表型定制的由特定激素、生長(zhǎng)因子、和營(yíng)養(yǎng)物組成的培養(yǎng)液中。對(duì)于非常原始的干細(xì)胞諸如胚胎干(ES)細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iS)，或出生后衍生的可以轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N成體命運(yùn)的干細(xì)胞，諸如間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)或羊水來(lái)源干細(xì)胞(AFSC)，這些干細(xì)胞經(jīng)受可溶性信號(hào)和/或細(xì)胞外基質(zhì)成分的混合物，并必須經(jīng)數(shù)周時(shí)間以多組這樣的信號(hào)進(jìn)行處理。典型地，所實(shí)現(xiàn)的成體表型隨著每次制備是不同的，并具有某些成體特異基因的過(guò)表達(dá)或低表達(dá)和/或一種或多種成體組織特異性基因的異常調(diào)節(jié)。細(xì)胞外基質(zhì)由細(xì)胞分泌，在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面上與它們鄰近，并且已經(jīng)長(zhǎng)期被認(rèn)為是對(duì)于細(xì)胞的結(jié)構(gòu)支持物7。它是由多種生物活性分子組成的極其復(fù)雜的支架，所述生物活性分子被高度調(diào)節(jié)，并且對(duì)于決定附著細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)和分化是關(guān)鍵的8。培養(yǎng)細(xì)胞的組織特異性基因表達(dá)通過(guò)在基質(zhì)提取物或純化的基質(zhì)成分上培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)改善9。然而，個(gè)別基質(zhì)成分，單獨(dú)的或組合的，不能夠概括組織的復(fù)雜基質(zhì)化學(xué)和結(jié)構(gòu)。這與下列事實(shí)相關(guān):基質(zhì)成分處于與自然組織區(qū)域以及與組織學(xué)結(jié)構(gòu)諸如血管相關(guān)的梯度中。組織基質(zhì)的這種復(fù)雜性更加容易通過(guò)對(duì)組織脫細(xì)胞化并留下基質(zhì)作為殘留物的提取法來(lái)實(shí)現(xiàn)1CK11。然而，當(dāng)前的脫細(xì)胞化方案由于使用溶解基質(zhì)成分的基質(zhì)降解酶或緩沖液而導(dǎo)致一些基質(zhì)成分的大量流失。本發(fā)明提供了生物基質(zhì)支架以及制備和使用這樣的生物基質(zhì)支架的方法。本發(fā)明的方法導(dǎo)致產(chǎn)生富含組織的大部分膠原并具有結(jié)合基質(zhì)成分和基質(zhì)結(jié)合激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的組織特異性提取物，所述膠原、結(jié)合基質(zhì)成分和基質(zhì)結(jié)合激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子對(duì)成熟細(xì)胞和干/祖細(xì)胞群體的譜系限制共同地產(chǎn)生重復(fù)性更高且更有效的分化效果O

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了從生物組織產(chǎn)生生物基質(zhì)支架的方法，其包括以下步驟:a)以第一培養(yǎng)液灌注生物組織或使生物組織均質(zhì)化，其中所述第一培養(yǎng)液的重量摩爾滲透壓濃度是約250m0sm/kg至約350m0sm/kg,以及所述第一培養(yǎng)液是無(wú)血清的且處于中性PH ;然后b)在所述第一培養(yǎng)液中用包含脂肪酶和/或去污劑的脫脂緩沖液灌注步驟
(a)的生物組織或提取步驟(a)的勻漿；然后c)用處于中性pH且包含約2.0M NaCl至約
5.0M的鹽濃度的緩沖液灌注步驟(b)的組織或提取步驟(b)的勻漿，所述濃度選擇以保持生物組織中鑒定的膠原不溶；然后d)在緩沖液中用核糖核酸酶(RNase)和脫氧核糖核酸酶(DNase)灌注步驟(C)的組織或提取步驟(C)的勻漿；以及然后e)用處于中性pH、無(wú)血清、且具有約250m0sm/kg至約350m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度的第二培養(yǎng)液沖洗步驟(d)的組織或步驟(d)的勻漿，進(jìn)而從所述生物組織產(chǎn)生完整的或均質(zhì)化的生物基質(zhì)支架，所述生物基質(zhì)支架包含生物組織的至少95%的膠原和大部分膠原結(jié)合基質(zhì)成分以及基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞因子。此外，本發(fā)明提供生物基質(zhì)支架，其包含膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、內(nèi)功素/巢蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、以及它們的任何組合，它們都是生物基質(zhì)支架的部分。 在另外的方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架；b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸步驟(a)的生物基質(zhì)支架；以及c)用細(xì)胞接種步驟(b)的生物基質(zhì)支架，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。本文中還提供了產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)生物基質(zhì)支架山)冷凍步驟(a)的生物基質(zhì)支架；c)從步驟(b)的生物基質(zhì)支架制備冷凍切片作為細(xì)胞培養(yǎng)基；d)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸步驟(C)的細(xì)胞培養(yǎng)基；以及
e)以細(xì)胞接種步驟(d)的細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。另外，本發(fā)明提供了產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架山)將步驟(a)的生物基質(zhì)支架研磨為粉末(例如，在一些實(shí)施方案中，在冷凍步驟(a)的生物基質(zhì)支架之后)；c)用步驟(b)的粉末包被至少部分培養(yǎng)裝置以產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)基；d)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(C)的細(xì)胞培養(yǎng)基；以及e)用細(xì)胞接種步驟(d)的細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。在該方法的特定實(shí)施方案中，可以例如在液氮溫度或液氮溫度附近在冷凍研磨機(jī)中進(jìn)行生物基質(zhì)支架的研磨。本文中還提供了本發(fā)明的組織特異性生物基質(zhì)支架促進(jìn)胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能細(xì)胞向特定命運(yùn)分化的用途，以及本發(fā)明的組織特異性生物基質(zhì)支架促進(jìn)將羊水來(lái)源干細(xì)胞或來(lái)自骨髓、脂肪組織、或任何胎兒組織或出生活組織的間充質(zhì)干細(xì)胞或任何決定干細(xì)胞(例如，肺、腸、膽系、腎、皮膚、心臟)向特定成體命運(yùn)分化的用途。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增強(qiáng)及加速干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞的方法，其包括根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞，并且細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液針對(duì)成熟細(xì)胞配制，進(jìn)而增強(qiáng)和加速了干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞。本發(fā)明還提供了將細(xì)胞遞送至受試者的方法，其包括用細(xì)胞接種本發(fā)明的生物基質(zhì)支架，以及然后將所述用細(xì)胞接種的生物基質(zhì)支架移植進(jìn)受試者。另外，本文中提供了鑒定組織類型中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架山)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的生物基質(zhì)支架；c)用腫瘤細(xì)胞接種(b)的生物基質(zhì)支架；d)在培養(yǎng)條件下維持(C)的生物基質(zhì)支架；以及e)監(jiān)控(d)的生物基質(zhì)支架上腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中生物基質(zhì)支架上腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)鑒定該腫瘤細(xì)胞可以在體內(nèi)在產(chǎn)生所述生物基質(zhì)支架的組織類型中形成集落，進(jìn)而鑒定該腫瘤細(xì)胞在所述組織類型中的轉(zhuǎn)移潛能。此外，本發(fā)明提供了鑒定腫瘤細(xì)胞對(duì)于抗腫瘤治療的響應(yīng)的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架山)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的生物基質(zhì)支架；c)用腫瘤細(xì)胞接種(b)的生物基質(zhì)支架；d)在培養(yǎng)條件下維持(C)的生物基質(zhì)支架；e)將抗腫瘤治療施加至生物基質(zhì)支架上的腫瘤細(xì)胞；以及f)監(jiān)控(e)的生物基質(zhì)支架上腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中(e)的生物基質(zhì)支架上腫瘤細(xì)胞沒有生長(zhǎng)和/或腫瘤細(xì)胞的死亡則鑒定該腫瘤細(xì)胞對(duì)于抗癌治療的響應(yīng)。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生用于移植到宿主動(dòng)物中的腫瘤移植物的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架山)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的生物基質(zhì)支架；c)用腫瘤細(xì)胞接種(b)的生物基質(zhì)支架；d)在培養(yǎng)條件下維持(C)的生物基質(zhì)支架；以及e)在(d)的生物基質(zhì)支架上建立腫瘤細(xì)胞的群體，進(jìn)而產(chǎn)生用于移植到宿主動(dòng)物中的腫瘤移植物。在一些實(shí) 施方案中，本發(fā)明還可以包括將腫瘤移植物移植到宿主動(dòng)物中的步驟。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生譜系依賴性病毒的病毒顆粒的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架；b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸
(a)的生物基質(zhì)支架；c)用可以被所述譜系依賴性病毒感染的類型和譜系階段的細(xì)胞接種
(b)的生物基質(zhì)支架；d)用譜系依賴性病毒感染(C)的細(xì)胞；e)在培養(yǎng)條件下維持生物基質(zhì)支架上的感染細(xì)胞；以及f)收集感染細(xì)胞中所產(chǎn)生的病毒顆粒，進(jìn)而產(chǎn)生譜系依賴性病毒的病毒顆粒。本發(fā)明還提供了制備通過(guò)生物基質(zhì)支架的再細(xì)胞化形成的類器官的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架；b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸
(a)的生物基質(zhì)支架；c)用與用于制備生物基質(zhì)支架的生物組織相同組織類型的細(xì)胞接種
(b)的生物基質(zhì)支架；d)在培養(yǎng)條件下維持(C)的生物基質(zhì)支架上的細(xì)胞，由此由所述細(xì)胞形成類器官，進(jìn)而產(chǎn)生了通過(guò)生物組織支架的再細(xì)胞化而形成的類器官。本文中還提供了在生物基質(zhì)支架上培養(yǎng)的細(xì)胞中制造產(chǎn)生目的蛋白的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架；b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的生物基質(zhì)支架；c)用產(chǎn)生目的蛋白的細(xì)胞接種(b)的生物基質(zhì)支架；d)在培養(yǎng)條件下在生物基質(zhì)支架上維持(C)的細(xì)胞；以及f)收集通過(guò)(d)的細(xì)胞產(chǎn)生的目的蛋白，進(jìn)而在生物基質(zhì)支架上培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白。本發(fā)明的前述和其他方面現(xiàn)在將關(guān)于本文描述的其他實(shí)施方案來(lái)進(jìn)行更加詳細(xì)描述。應(yīng)該意識(shí)到的是，本發(fā)明可以以不同形式體現(xiàn)，并且不應(yīng)該解釋為限于本文所述的實(shí)施方案。還有，提供這些實(shí)施方案，使得本發(fā)明公開徹底且完整，并且將本發(fā)明的范圍充分地傳達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A-El:大鼠肝臟生物基質(zhì)支架制備。(A)四步脫細(xì)胞化過(guò)程，包括灌注清洗、以PLA2和SDC脫脂、高鹽量清洗、以及核酸酶處理用于核酸去除。(B-D)在大鼠生物基質(zhì)支架制備中的四個(gè)階段。⑶在用基礎(chǔ)培養(yǎng)液灌注清洗10分鐘后，肝臟變得蒼白；(C)在脫脂期間，肝臟在GC下變得部分透明；(D)最終的完整支架在40分鐘灌注后看起來(lái)透明；(E)以低放大倍數(shù)顯示的生物基質(zhì)支架。(El)用若丹明標(biāo)記的葡聚糖顆粒灌注的支架可視化表明了沿通道從大血管至細(xì)血管分支的漸增流量，且沒有泄露，表明支架中的專有脈管。在不同階段的生物基質(zhì)支架的相應(yīng)蘇木精和伊紅(H&E)染色表明，封裝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的組織學(xué)結(jié)構(gòu)如血管和網(wǎng)格狀基質(zhì)被保留，而細(xì)胞被去除。正常的大鼠肝門三聯(lián)管結(jié)構(gòu)由門靜脈(PV)Jfa脈(HA)、和膽管(BD)組成(BI);在脫細(xì)胞化過(guò)程期間，基質(zhì)纖維隨著細(xì)胞被逐漸去除而變得透明(Cl);對(duì)比(BI)和(Dl)，脫細(xì)胞化肝門三聯(lián)管區(qū)；D2和D3顯示所有細(xì)胞從基質(zhì)支架去除，但網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被保留，諸如血管、GC、及圍繞實(shí)質(zhì)細(xì)胞壁的網(wǎng)格狀基質(zhì)。圖2A-H:大鼠肝臟生物基質(zhì)支架的TEM(A-C)和SEM(D-H)圖像。(A)具有厚壁(W)的血管(BV)的低放大倍數(shù)。I型膠原(大箭頭)是眾多的并且包含不攝取重金屬染料的纖維的橫截面(白點(diǎn)、小箭頭)。(B)血管壁的更高放大倍數(shù)顯示了基膜(大箭頭)、無(wú)定形彈性蛋白(*)和相關(guān)彈性纖維、少量的膜囊泡殘留物(小箭頭)、I型膠原帶狀纖維(箭頭)和小纖維(小箭頭)。小纖維可能是原纖蛋白(VI型膠原)，其與I型膠原密切關(guān)聯(lián)且?guī)椭M織I型膠原。(C)具有64nm帶 型模式的I型膠原的高放大倍數(shù)(箭頭)。(D)具有薄壁(BV)的血管和更大血管(W)的壁的低放大倍數(shù)。(E)在更高放大倍數(shù)，大血管壁(W)是圓齒狀的，與門三聯(lián)管的肝動(dòng)脈一致，參見(A)。在壁下是眾多的I型膠原束(大箭頭)，其由長(zhǎng)分支型薄的、網(wǎng)狀的(III型)膠原纖維(小箭頭)連接。(F)大束的I型膠原具有特征性的平行纖維(大箭頭)，其與各種較小纖維(箭頭)和結(jié)節(jié)或珠狀纖維(箭頭)關(guān)聯(lián)。(G)在平面中互連的大/小纖維的3D網(wǎng)絡(luò)，其將邊界形成例如為肝血竇。(H)網(wǎng)絡(luò)的更高放大倍數(shù)顯示了各種纖維(箭頭):ΙΠ型膠原(更大直徑直線)、彈性纖維或VI型膠原。圖3Α-Β:生物基質(zhì)支架中膠原的化學(xué)分析和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的表達(dá)。(A)所有在膠原中發(fā)現(xiàn)的三種氨基酸的含量:羥脯氨酸(Hyp)、羥賴氨酸(Hyl)及甘氨酸(Gly)。數(shù)字表示每種氨基酸/1000氨基酸的殘留。該數(shù)據(jù)顯示脫細(xì)胞化過(guò)程中膠原含量顯著增力口，其從肝臟中< 0.2%至生物基質(zhì)支架中的大于15%。(B)生物基質(zhì)支架中基質(zhì)分子的免疫組織化學(xué)染色，顯示了肝臟生物基質(zhì)支架中層粘連蛋白(LAM)、硫酸肝素(HS)、III型膠原(C0L3)和纖連蛋白(FN)以及與血管壁殘留物相關(guān)的典型的基膜蛋白的分布。在更高放大倍數(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以觀察基膜的主要成員，包括IV型膠原(C0L4)、巢蛋白(Ent，也稱為內(nèi)功素)、層粘連蛋白(LAM)和基底膜聚糖(Per)，其是靠近門三聯(lián)管的支架部分中HS-PG的形式。
圖4A-D:生物基質(zhì)支架中從門三聯(lián)管至中央靜脈的ECM成分的模式。正常肝臟(A)與肝臟生物基質(zhì)支架⑶的從門三聯(lián)管(I區(qū))至中央靜脈(3區(qū))的組織學(xué)比較；兩者都是蘇木精/伊紅染色切片。(C)該模型示意肝臟中干細(xì)胞和成熟譜系系統(tǒng)，其具有顯示形成與肝分區(qū)相關(guān)的模式的代表性基質(zhì)成分。成分以免疫組織化學(xué)的發(fā)現(xiàn)中的豐度的順序列出。人肝臟中已知的譜系階段在I區(qū)門靜脈周圍(門三聯(lián)管周圍)開始并且進(jìn)行成熟，在3區(qū)中以凋亡細(xì)胞結(jié)束。在肝臟干細(xì)胞龕中鑒定的已知基質(zhì)化學(xué)物包括透明質(zhì)酸、III型膠原、與α6β4整聯(lián)蛋白結(jié)合的形式的層粘連蛋白、以及弱硫酸化形式的CS-PG43'44。只是在干細(xì)胞龕外側(cè)發(fā)現(xiàn)IV型膠原、通常硫酸化的CS-PG和HS-PG、以及與α β I整聯(lián)蛋白結(jié)合形式的層粘連蛋白。HP-PG已經(jīng)證實(shí)獨(dú)特地位于中心周圍45'46。(D)肝臟中基質(zhì)成分和它們的位置與生物基質(zhì)支架中基質(zhì)成分及其位置的比較的研究，從免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)中總結(jié)的數(shù)據(jù)(N/D=未測(cè)試。*由其他人員發(fā)現(xiàn)的僅僅靠近中央靜脈)。細(xì)胞骨架的多數(shù)成分在清洗期間丟失，存在細(xì)胞骨架蛋白的一些殘留物但非全部。支架缺乏可檢測(cè)量的微管蛋白、肌間線蛋白和肌動(dòng)蛋白(鬼筆環(huán)肽測(cè)定)。然而，存在在支架中隨機(jī)分散著的痕量細(xì)胞角蛋白；在門三聯(lián)管的血管殘留物周圍痕量的α平滑肌肌動(dòng)蛋白；以及遍布的低水平的波形蛋白。圖5Ε-Ι:肝臟生物基質(zhì)支架上與I型膠原上比較的hHpSC的表征。相差圖像(A-D)顯示了源自相同肝臟并在無(wú)血清Kubota'培養(yǎng)液中和在組織培養(yǎng)塑料(A)上和在I型膠原上(B)上培養(yǎng)的hHpSC集落的形態(tài)變化，所述組織培養(yǎng)塑料是一種用于自我復(fù)制的條件，其與對(duì)于肝臟的無(wú)血清分化培養(yǎng)液中的分化條件對(duì)比，所述I型膠原與在牛肝臟生物基質(zhì)支架上(C-E)對(duì)比。有功能的和完全存活的培養(yǎng)物在I型膠原上存活不超過(guò)-2周。通過(guò)對(duì)t匕，在肝臟生物基質(zhì)支架上的細(xì)胞是存活且健康的，且具有功能的所有組成成分，且持續(xù)至少一個(gè)月。培養(yǎng)物通過(guò)7-12天轉(zhuǎn)換為具有增加的細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核比率和標(biāo)記的糖原表達(dá)的細(xì)胞(C)，并且然后轉(zhuǎn)換為具有通過(guò)清楚膽小管散布的典型多邊形細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞(D)，所述培養(yǎng)形態(tài)在其后持續(xù)，如第24天的代表性培養(yǎng)物所顯示的(E)。RT-PCR測(cè)定顯示了第7天在培養(yǎng)塑料上(F)與在大鼠肝臟生物基質(zhì)支架上(G)相比較、在自我復(fù)制條件下hHpSC的基因表達(dá)變化。我們對(duì)比以下表達(dá)，hHpSC標(biāo)記，包括CXCR4和EpCAM ;早期肝細(xì)胞基因，包括CK19(KRT19)、HNF6、F0XA2、AFP和低水平的白蛋白；成熟肝細(xì)胞標(biāo)記，包括高水平的白蛋白(ALB)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、CYP450-3A4、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)、和葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)，以及膽管上皮細(xì)胞基因 ，包括CFTR、伽馬谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGTl)、陽(yáng)離子交換2 (AE2)和頂端鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ASBT)。生化測(cè)定測(cè)量I型膠原上與大鼠肝臟生物基質(zhì)支架上的培養(yǎng)物中合成的尿素(H)，以及測(cè)量I型膠原上與由大鼠或牛肝臟制備的生物基質(zhì)支架上的培養(yǎng)物中CYP450-3A4活性(I)。表7提供了定量測(cè)量的總結(jié)，其比較了在針對(duì)自我復(fù)制的培養(yǎng)條件下(III型膠原)、或在針對(duì)I型膠原與肝臟生物基質(zhì)支架上相比的分化的條件下新鮮分離的hHpSC的附著、存活力、生長(zhǎng)、培養(yǎng)生命周期、以及組織特異性基因表達(dá)。圖6A-D:在生物基質(zhì)支架上由hHpSC譜系限制的細(xì)胞的免疫熒光染色。(A)以肝特異性標(biāo)記白蛋白(Alb，淺灰色)染色和以肝干細(xì)胞表面標(biāo)記EpCAM(白色)染色。注意的是鋪板在生物基質(zhì)支架上的細(xì)胞不表達(dá)EpCAM。比例尺= 200 μ m。(B)以早期肝標(biāo)記甲胎蛋白(AFP，淺灰色)和針對(duì)人膽管上皮細(xì)胞標(biāo)記細(xì)胞角蛋白19(CK19，白色)的抗體染色，所述標(biāo)記在該表達(dá)水平顯示成熟膽管上皮細(xì)胞。針對(duì)CK19的抗體測(cè)定是人特異性的，并且不染色沒有細(xì)胞接種的支架中大鼠CK19處的殘留物。AFP表達(dá)是低的但在第7天仍是明顯的。比例尺= 200μπι。(C)以Alb (淺灰色)和肝星形細(xì)胞標(biāo)記、a -平滑肌肌動(dòng)蛋白(ASMA,白色)染色。白蛋白和ASMA的表達(dá)強(qiáng)烈顯示正在成熟的肝細(xì)胞和星形細(xì)胞都存在。比例尺=IOOym0 (D)以功能肝蛋白CYP450-3A4 (淺灰色)和膽管上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記分泌素受體(SR，白色)染色，所述標(biāo)記顯示正在成熟的肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞是功能性的并且表達(dá)針對(duì)這兩種細(xì)胞類型的典型標(biāo)記。比例尺=200 μ m。圖7A-D:生物基質(zhì)支架上的完全功能性的、成熟人肝細(xì)胞的穩(wěn)定性。成體肝細(xì)胞鋪板在分化培養(yǎng)液中，以及鋪板在I型膠原(A、B)上與牛肝臟生物基質(zhì)支架(C)上對(duì)比，它們是低溫粉碎的、分散在培養(yǎng)液中并允許沉積在板上。I型膠原上的細(xì)胞是完全存活的并且在第7-12天(A顯示第7天)處于它們的分化峰值；它們?cè)?2周后開始惡化，并通過(guò)20天(B)它們死亡、正在死亡和無(wú)功能。通過(guò)對(duì)比，鋪板在肝臟生物基質(zhì)支架上的那些細(xì)胞(C)持續(xù)至少8周是有功能的(還沒有評(píng)估更長(zhǎng)時(shí)間)；這里顯示的21天后在粉碎的肝臟生物基質(zhì)支架上的培養(yǎng)物中。對(duì)于鋪板在生物基質(zhì)支架上與I型膠原上相比的冷凍成體肝臟細(xì)胞的兩種獨(dú)立制備物的培養(yǎng)的CYP450-3A4測(cè)定，并且在第12天測(cè)定(D)。樣本ZHep-007代表在解凍后具有良好附著的低溫保存樣本；樣本ZL-013代表在解凍后具有差附著或無(wú)附著的那些批次。因此，即使這些更差質(zhì)量的樣本能夠附著至生物基質(zhì)支架并長(zhǎng)期維持存活。在所測(cè)定的兩種樣本中，P450s水平在肝臟生物基質(zhì)支架上培養(yǎng)時(shí)更高。隨著在生物基質(zhì)支架上的時(shí)間推移，更差質(zhì)量的冷凍保存的批次將得到改進(jìn)。圖8:通過(guò)脫氧膽酸鈉激活磷脂酶A2來(lái)產(chǎn)生溶血卵磷脂。該方案的原理:由脫氧膽酸鈉激活的磷脂酶A2 (PLA2)將使位于細(xì)胞質(zhì)膜和線粒體膜上的磷酸甘油酯降解為溶血卵磷脂，所述溶血卵磷脂是強(qiáng)力表面活性劑，其誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。圖9:大鼠肝臟與大鼠肝臟生物基質(zhì)支架相比的膠原組成分析。生物基質(zhì)(黑色)和整個(gè)肝臟(淺灰色)的氨基酸成分以玫瑰圖形式呈現(xiàn)。對(duì)于分析的每種氨基酸使用三字母縮寫。沒有分析色氨酸和半胱氨酸。數(shù)字顯示氨基酸殘基/1000。圖10A-C:大鼠肝臟生物基質(zhì)支架的核酸分析。肝臟生物基質(zhì)載玻片的相差圖(A)和熒光DAPI染色(B)，以及·來(lái)自大鼠新鮮肝臟組織與生物基質(zhì)支架(C)相比的總DNA及RNA的定量測(cè)定。圖1lA-C:在將hHpSC鋪板至生物基質(zhì)支架上以后的生物基質(zhì)支架的染色?；铙w(鈣黃綠素-AM，白色)/死亡(溴化乙錠或EtD-Br1，淺灰色)測(cè)定顯示hHpSC集落在生物基質(zhì)支架切片上是存活的，但在集落中部(A、B)在前幾天沒有攝取染料，這是由于干細(xì)胞中的已知泵(例如MDR1)消除了活體染料。在(B)中，熒光圖像與相位圖像合并以顯示集落中間含有細(xì)胞。通過(guò)7天，整個(gè)集落的細(xì)胞已經(jīng)分化并在幾乎整個(gè)集落的所有細(xì)胞中攝取活體染料(C)。圖12A-F:在I型膠原上培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞與在大鼠肝臟生物基質(zhì)支架上培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞的對(duì)比。第3天(A、C)和第10天(B、D)在I型膠原上和生物基質(zhì)支架上培養(yǎng)的成體大鼠肝細(xì)胞。它們?cè)趲追昼妰?nèi)附著在肝臟生物基質(zhì)支架上并存活與測(cè)試一樣長(zhǎng)的時(shí)間，持續(xù)大于8周(C、D);沒有測(cè)試更長(zhǎng)時(shí)間。培養(yǎng)物在生物基質(zhì)支架上是非常三維的。在第1、3、5、7、10、14、21和28天的尿素合成(E)和細(xì)胞存活力測(cè)定(F)，η = 3。圖13A-D:人胰腺與人胰腺生物基質(zhì)支架的對(duì)比。嵌入石蠟中、切片并以蘇木精和伊紅(Η&Ε)染色的人胰腺(A)與人胰腺生物基質(zhì)支架(B-D)的對(duì)比。胰島結(jié)構(gòu)已經(jīng)在B中描繪出。胰腺生物基質(zhì)支架的腺泡區(qū)在C和D中顯示。圖14:在人胰腺組織中與大鼠胰腺生物基質(zhì)支架中相比發(fā)現(xiàn)的代表性基質(zhì)成分和一種細(xì)胞骨架成分波形蛋白。沒有發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)量的其他細(xì)胞骨架成分(肌間線蛋白、微管蛋白、肌動(dòng)蛋白)或發(fā)現(xiàn)痕量的細(xì)胞骨架成分(細(xì)胞角蛋白)。虛線環(huán)繞胰島，注意的是多配體聚糖I和VI型膠原在胰腺組織和生物基質(zhì)支架的胰島中都是強(qiáng)陽(yáng)性的。多配體聚糖I僅在胰島中(虛線)發(fā)現(xiàn)而沒有在腺泡細(xì)胞中(箭頭)發(fā)現(xiàn)；III型膠原在腺泡細(xì)胞中和血管周圍(箭頭)更富集，但在胰島中沒有。圖15A-C:人十二指腸生物基質(zhì)支架的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色。(A)人十二指腸生物基質(zhì)支架的外側(cè)和腔側(cè)。在H&E染色切片中對(duì)比正常組織(B)和生物基質(zhì)支架(C)之間的多層結(jié)構(gòu)，并且結(jié)果顯示支架保留黏膜層和黏膜下層中的絨毛和血管。下圖顯示，人十二指腸生物基質(zhì)支架的免疫組織化學(xué)染色顯示保留在支架中可變數(shù)量的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。圖16A-D:人膽囊組織與人膽囊生物基質(zhì)支架的對(duì)比。人膽囊組織(A、B)與由其制備的生物基質(zhì)支架(C、D)的對(duì)比。組織和生物基質(zhì)支架嵌入在石蠟中、切片并以蘇木精和伊紅染色。圖17A-B:結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系HT29 (A)和SW480 (E)接種在生物基質(zhì)支架上并形成細(xì)胞集落，其由數(shù)百至數(shù)千個(gè)細(xì)胞組成，并且它們是非常三維的。發(fā)明詳細(xì)描述現(xiàn)將在下文中更加全面的描述本發(fā)明。然而本發(fā)明可以以不同形式體現(xiàn)并不應(yīng)該被解釋為限于本文所述的實(shí)施方案。還有，提供這些實(shí)施方案以使得本發(fā)明公開將徹底且完整，并且將本發(fā)明的范圍充分地傳達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。本文中本發(fā)明說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，并不旨在對(duì)本發(fā)明的限定。如本發(fā)明說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式“一個(gè)(a)”、“一個(gè)(an)”和“該”(the)還旨在包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文中另有清楚的顯示。除非另有限定，本文使用的所有術(shù)語(yǔ)(包括技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ))具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。還將理解的是，術(shù)語(yǔ)諸如在通常使用的字典中定義的那些，應(yīng)該解釋為具有與在本申請(qǐng)上下文和相關(guān)領(lǐng)域中的它們的意義相一致的含義，且不應(yīng)該解釋為理想化的或過(guò)于正式的意義，除非本文明確這樣限定。本發(fā)明說(shuō)明書中所使用的術(shù)語(yǔ)在本文中僅是用于描述特定實(shí)施方案的目的并且不旨在對(duì)本發(fā)明的限定。本文中所提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。而且，如本文中所使用的，“和/或”是指并包括相關(guān)列出項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)的任何和所有可能組合，以及在解釋為可替代的(“或”)時(shí)沒有組合。除非上下文另有顯示，特別期望的是，本文中所描述的本發(fā)明的各種特征可以以任何組合使用。此外，本發(fā)明還考慮在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征組合。為了示意，如果說(shuō)明書聲明復(fù)合物包括組分A、B和C，特別期望的是，可以單獨(dú)或以任何組合省略或放棄A、B或C中的任一個(gè)、或其組合。如本文 中所使用的，過(guò)渡詞“基本由…組成”(以及語(yǔ)法變體)應(yīng)該解釋為包括所述的材料或步驟，“以及那些非本質(zhì)上影響要求保護(hù)的發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)基本和新的特征”的材料或步驟。參見 In re Herz，537 F.2d 549，551-52，190 U.S.P.Q.461，463 (CCPA 1976)(原文中強(qiáng)調(diào))；還參見MPEP §2111.03。因此，本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“基本由…組成”不應(yīng)該解釋為等同于“包括”。如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“約”在是指可測(cè)量值如量或濃度(例如，生物基質(zhì)支架中總蛋白中膠原的百分比)等時(shí)，旨在包括所指定量的20%、10%、5%、1%、0.5%、或甚至
0.1 %的變化。本發(fā)明涉及生物基質(zhì)支架的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，所述生物基質(zhì)支架比現(xiàn)在已知的脫細(xì)胞化的組織支架具有意外的改進(jìn)和優(yōu)勢(shì)，改進(jìn)和優(yōu)勢(shì)的一些實(shí)例是使用本發(fā)明的生物基質(zhì)支架有效維持成熟細(xì)胞和/或譜系限制和/或使干細(xì)胞分化為成熟命運(yùn)和/或維持該成熟細(xì)胞在長(zhǎng)期的一段時(shí)期有功能。作為進(jìn)一步實(shí)例，使用本發(fā)明的生物基質(zhì)支架將產(chǎn)生成熟命運(yùn)的細(xì)胞的時(shí)間從約3-6周或更多降低至約1-2周。本發(fā)明的生物基質(zhì)支架使用特定方案來(lái)產(chǎn)生，其針對(duì)給定組織利用鹽濃度和離子強(qiáng)度(不同膠原具有不同溶解度常數(shù)(23))的適當(dāng)平衡，以使得保留以不溶形式存在于該組織中的天然膠原，導(dǎo)致生物基質(zhì)支架保留了高百分比的天然膠原，所述天然膠原提供信號(hào)以驅(qū)動(dòng)譜系限制和分化。作為對(duì)比，根據(jù)已知方案產(chǎn)生的脫細(xì)胞化支架沒有利用使得保留高百分比的這些天然膠原的這樣的鹽濃度和離子強(qiáng)度的平衡，而大部分這些天然膠原在使用這些已知方案時(shí)丟失。此外，本發(fā)明的生物基質(zhì)支架允許產(chǎn)生譜系依賴(例如，分化依賴的)病毒和/或病原體，其數(shù)量足以用于實(shí)驗(yàn)和/或治療用途(例如，用于疫苗生產(chǎn))。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從生物組織產(chǎn)生生物基質(zhì)支架的方法，其包括如下步驟:a)用第一培養(yǎng)液灌注生物組織或使該生物組織均質(zhì)化，其中所述第一培養(yǎng)液的重量摩爾滲透壓濃度是約250m0sm/kg至約350m0sm/kg,以及所述第一培養(yǎng)液是無(wú)血清的且處于中性PH ;然后b)在所述第一培養(yǎng)液中用包含脂肪酶和/或去污劑的脫脂緩沖液灌注步驟(a)的生物組織或提取步驟(a)的勻漿；然后c)用處于中性pH且包含約
2.0MNaCl至約5.0M的鹽濃度的緩沖液灌注步驟(b)的組織或提取步驟(b)的勻漿，所述濃度選擇以保持生物組織中鑒定的膠原不溶`；然后d)在緩沖液中用核糖核酸酶(RNase)和脫氧核糖核酸酶(DNase)灌注步驟(C)的組織或提取步驟(C)的勻漿；以及然后e)用處于中性pH、無(wú)血清、且具有約250m0sm/kg至約350m0sm/kg重量摩爾滲透壓濃度的第二培養(yǎng)液沖洗步驟(d)的組織或勻漿，進(jìn)而從所述生物組織產(chǎn)生完整的或均質(zhì)化的生物基質(zhì)支架，所述生物組織支架包含未處理生物組織的至少95 % (例如，80 %、85 %、90 %、95 %、98%,99%,100% )的膠原和大部分膠原結(jié)合基質(zhì)成分以及基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞因子。本文還提供了通過(guò)本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的生物基質(zhì)支架。如本文中所使用的“生物基質(zhì)支架”是指細(xì)胞外基質(zhì)中富集的分離的組織提取物，如本文所述，其保留了生物組織中天然存在的許多或大部分膠原和膠原結(jié)合因子。在一些實(shí)施方案中，基本所有的膠原和膠原結(jié)合因子被保留，以及在其他實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架包含所有已知在該組織中的所有膠原。生物基質(zhì)支架可以包含天然生物組織中的任何組合的至少約 50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%,99.5%或100%的天然生物組織中以任何組合的膠原、膠原結(jié)合基質(zhì)成分、和/或基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和/或細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架包含生物組織中至少95%的膠原和生物組織中大部分膠原結(jié)合基質(zhì)成分、和基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和/或細(xì)胞因子。如本文中所述的，“生物組織中大部分膠原結(jié)合基質(zhì)成分、和基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和/或細(xì)胞因子”是指生物基質(zhì)支架保留的天然(例如，未處理)生物組織中存在的約50%、60%、70%,75%,80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%,99.5%或 100%的膠原結(jié)合基質(zhì)成分、
和基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和/或細(xì)胞因子。示例性膠原包括所有類型的膠原，諸如但不限于I型至XXIX型膠原。生物基質(zhì)支架可包含天然生物組織中發(fā)現(xiàn)的至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%>98%>99%>99.5%或更多的一種或多種膠原，和/或可具有一種或多種膠原,所述膠原以天然生物組織中發(fā)現(xiàn)的至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%,99%,99.5%或更大的濃度存在。在生物基質(zhì)支架中膠原的量可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的以及如本文所述的各種方法來(lái)確定，諸如但不限于確定羥脯氨酸含量。示例性膠原結(jié)合基質(zhì)成分包括但不限于，粘附分子；粘附蛋白；L_和P-選擇蛋白；肝素結(jié)合生長(zhǎng)相關(guān)分子(HB-GAM);血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)序列(TSR);淀粉樣蛋白P(AP);層粘連蛋白；內(nèi)功素/巢蛋白；纖連蛋白；彈性蛋白；波形蛋白；蛋白聚糖(PG);硫酸軟骨素-PG(CS-PG);硫酸皮膚素-PG(DS-PG);富含小亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)家族成員，如雙糖鏈蛋白聚糖和核心蛋白聚糖；肝素-PG(HP-PG);硫酸肝素-PG(HS-PG)，諸如磷脂酰肌醇聚糖、多配體聚糖、和基底膜聚糖；以及葡萄糖胺聚糖(GAG)，諸如透明質(zhì)酸、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、和肝素。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架包含(以任何組合)結(jié)合至各種基質(zhì)成分的膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、內(nèi)功素/巢蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、生長(zhǎng)因子、激素、以及結(jié)合至各種基質(zhì)成分的細(xì)胞因子，由其組成，或基本由其組成(以任何組合)。生物基質(zhì)支架可包含天然生物組織中發(fā)現(xiàn)的至少約50%、70%,75%,80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%,99.5%或更多的一種或多種膠原結(jié)合基質(zhì)成分、激素和/或細(xì)胞因子，和/或可具有一種或多種這些成分，所述成分以在天然生物組織中發(fā)現(xiàn)的至少約 50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%或更大的濃度存在。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架包含已知在組織中的所有或大部分的膠原結(jié)合基質(zhì)成分、激素和/或細(xì)胞因子。在其他實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架包含一種或多種膠原結(jié)合基質(zhì)成分、激素和/或細(xì)胞因子，基本由其組成，或由其組成，其濃度處于接近于那些在天然原始生物組織中發(fā)現(xiàn)的濃度(例如天然組織所發(fā)現(xiàn)濃度的約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或 100% )。示例性生長(zhǎng)因子包括但不限于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、IGF結(jié)合蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。示例性細(xì)胞因子包括但不限于白細(xì)胞介素、淋巴因子、單核因子、集落刺激因子、趨化因子、干擾素和腫瘤壞死因子(TNF)。生物基質(zhì)支架可包含天然生物組織中發(fā)現(xiàn)的至少約 50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%,99.5%、100%或更多(以任何組合)的一種或多種基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子，和/或可具有一種或多種這些生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子(以任何組合)，其以天然生物組織中發(fā)現(xiàn)的濃度的至少約50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%,99.5%、100%或更大的濃度存在。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架包含生理水平或接近生理水平的已知在天然組織中和/或在組織中檢測(cè)的許多或大部分基 質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和/或細(xì)胞因子，以及在其他實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架包含一種或多種基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和/或細(xì)胞因子，其濃度接近于天然生物組織中發(fā)現(xiàn)的那些生理濃度(例如，對(duì)比差異不超過(guò)約20%,25%,20%,15%,10%,5%,4%,3%,2%U%>0.5% )。在生物基質(zhì)支架中存在的生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子的量或濃度可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的和如本文中所述的各種方法來(lái)確定，諸如但不限于各種抗體測(cè)定和生長(zhǎng)因子測(cè)定。如本文中所使用的“生物組織”是指活體或死亡生物體的任何組織或源自活體或死亡生物體的任何組織。如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“天然生物組織”及其變化是指當(dāng)其以其天然或未修飾狀態(tài)存在于生物體中的生物組織。本發(fā)明的生物基質(zhì)支架可以由任何生物組織制備。生物組織可包括任何單一組織(例如，可以被互連的細(xì)胞的集合)或組成生物體的器官或部分或區(qū)域的一群組織。組織可包括均質(zhì)細(xì)胞材料或者它可以是復(fù)合結(jié)構(gòu)諸如在包括胸部的身體的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的復(fù)合結(jié)構(gòu)，其例如可以包括肺組織、骨骼組織、和/或肌肉組織。本發(fā)明的示例性生物組織包括但不限于肝臟、肺臟、甲狀腺、皮膚、胰腺、血管、膀胱、腎臟、大腦、膽系、十二指腸、腹主動(dòng)脈、髂靜脈、心臟和腸，包括它們的任何組合。生物組織相關(guān)或來(lái)源的生物體(即，受試·者)可以是任何動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物如無(wú)脊椎動(dòng)物。示例性受試者包括但不限于哺乳動(dòng)物，例如但不限于:人、小鼠、大鼠、白融、倉(cāng)鼠、兔、豚鼠、豬(Pigs)、豬(porcine)、狗、貓、馬、牛、綿羊、猴、和黑猩猩，以及非哺乳動(dòng)物，例如但不限于:鳥類、爬行動(dòng)物、和無(wú)脊椎動(dòng)物。受試者可以是任何年齡和/或大小。生物組織可以是健康的、病變的、和/或具有基因突變。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物基質(zhì)支架在其化學(xué)和功能性方面是組織特異的，即所述生物基質(zhì)支架在它們的化學(xué)和功能性方面是代表與產(chǎn)生它們的生物組織，或與之相當(dāng)。在一些實(shí)施方案中，天然組織和專有脈管(patent vasculatures)保留在生物基質(zhì)支架中。這可以包括生物組織的主要組織實(shí)體的可識(shí)別殘留物，例如但不限于針對(duì)任何組織的血管和其他脈管；肝臟的膽管和格利森氏囊(GC);胰腺管，胰腺的胰島和腺泡；肺的支氣管、氣管和肺泡，等。在其他實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架的化學(xué)物與組織學(xué)匹配(例如，血管周圍的基質(zhì)不同于肝細(xì)胞周圍的基質(zhì))。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架的化學(xué)物處于與組織學(xué)相關(guān)的梯度中。例如，在生物組織是肝臟時(shí)，生物基質(zhì)支架可以保留基質(zhì)化學(xué)的梯度，所述基質(zhì)化學(xué)的梯度從門三聯(lián)管至中央靜脈的肝腺泡區(qū)1-3相關(guān)以及與組織學(xué)實(shí)體諸如血管通道及格利森氏囊(GC)相關(guān)。其他實(shí)例包括但不限于，血管，其中血管周圍基質(zhì)的化學(xué)物充滿高水平的網(wǎng)絡(luò)膠原(例如，IV型和VI型)、彈性蛋白、各種形式的HS-PG ；門靜脈周圍區(qū)域(區(qū)I)的肝細(xì)胞周圍，其中層粘連蛋白連同CS-PG及HS-PG的混合物具有高濃度，而在中心周圍區(qū)(區(qū)3)周圍，是由HS-PG及HP-PG的混合物圍繞的肝細(xì)胞；與膽管相關(guān)的，其中存在高水平的I型膠原、纖連蛋白、以及各種形式的CS-PG及DS-PG。在每種組織中存在基質(zhì)化學(xué)物的平行梯度。存在多種沖洗培養(yǎng)液，諸如第一和第二培養(yǎng)液，以及可用于本發(fā)明中的緩沖液。特別的，可以使用以不溶狀態(tài)維持膠原和結(jié)合因子(例如，基質(zhì)成分、生長(zhǎng)因子、以及細(xì)胞因子)的任何沖洗培養(yǎng)液或緩沖液。在選擇培養(yǎng)液或緩沖液時(shí)，鹽濃度、pH、及離子強(qiáng)度應(yīng)該適于以不溶狀態(tài)維持膠原和/或大部分或許多膠原結(jié)合基質(zhì)成分以及其他因子(例如，依靠與膠原直接或間接的它們的化學(xué)連接)。表I提供了針對(duì)各種類型膠原的氯化鈉的摩爾濃度范圍以幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供確保膠原、膠原結(jié)合基質(zhì)成分、及基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子維持不溶的培養(yǎng)液或緩沖液。Deyl等人("Preparative proceduresand purity assessment of collagen proteins " Journal of Chromatography B790(2003)245-275)另外提供了關(guān)于膠原化學(xué)物的信息，其可以促進(jìn)鑒定用于維持不溶狀態(tài)的膠原和結(jié)合因子的最佳條件，并且其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。表I表明pH是與鹽濃度一起作用來(lái)限定溶解度的變量。通過(guò)具有高鹽濃度，pH可以是中性的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所選擇的鹽濃度是維持不溶狀態(tài)的所有組織膠原的濃度，而不是僅維持不溶狀態(tài)的一種組織膠原的濃度。例如，胎兒肝臟中已知的膠原在約4.5M NaCl的鹽濃度中是不溶的，而成體肝臟組織中的那些膠原在約3.4M-3.5M NaCl的鹽濃度中是不溶的。沖洗培養(yǎng)液和/或緩沖液中任何的重量摩爾滲透壓濃度可以例如是200m0sm/kg至約 400m0sm/kg、約 250m0sm/kg 至約 350m0sm/kg、約 275m0sm/kg 至約 325m0sm/kg、或約300m0sm/kg至約325m0sm/kg,包括但不限于這些范圍內(nèi)非明確陳述的任何值。蒸懼水和稀釋緩沖液(例如，具有重量摩爾滲透壓濃度< lOOmOsm/kg)將導(dǎo)致大量膠原、膠原結(jié)合基質(zhì)成分和基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子的損失。因此，在本發(fā)明的方法的一些實(shí)施方案中，不包括蒸餾水和稀釋緩沖液。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到的，重量摩爾滲透壓濃度是每質(zhì)量溶質(zhì)滲透濃度的表達(dá)，而摩爾滲透壓濃度是每體積的溶質(zhì)。因此，從摩爾滲透壓濃度至重量摩爾滲透壓濃度的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)乘以質(zhì)量密度得到。重量摩爾滲透壓濃度可以使用測(cè)量依數(shù)性質(zhì)的滲壓計(jì)測(cè)量，所述依數(shù)性質(zhì)諸如凝固點(diǎn)下降、蒸汽壓、及沸點(diǎn)升高。摩爾滲透壓濃度是溶質(zhì)濃度的量度，定義為每升(L)溶液中溶質(zhì)的滲透壓摩爾(Osm)的數(shù)量(osmol/L或0sm/L)。溶液的摩爾滲透壓濃度通常表示為0sm/L。而摩爾濃度測(cè)量每單位體積溶液中溶質(zhì)的摩爾數(shù)，摩爾滲透壓濃度測(cè)量每單位體積溶液中溶質(zhì)顆粒的滲透壓摩爾數(shù)。重量摩爾滲透壓濃度是每千克溶劑中溶質(zhì)的滲透壓摩爾(osmol/kg或Osm/kg)的量度。 摩爾濃度和摩爾滲透壓濃度由于它們是溫度依賴的而在滲透壓測(cè)定中是不常用的。這是因?yàn)樗S著溫度改變其體積。然而，如果溶質(zhì)濃度非常低，摩爾滲透壓濃度和重量摩爾滲透壓濃度則認(rèn)為是相等的。溶液的摩爾滲透壓濃度可以由下面表達(dá)來(lái)計(jì)算:
osmol/L=J] ^niCi * ,其中φ是滲透系數(shù)，其解釋溶液的非理想性程度；η是分子解離的顆粒(例如，離子)的數(shù)量；c是溶質(zhì)的摩爾濃度；以及指數(shù)i表示特定溶質(zhì)的身份。在最簡(jiǎn)單情況下，φ是溶質(zhì)的解離度。然后，φ介于O和I之間，其中I表示100%解離。然而，φ還可以大于I (例如，對(duì)于蔗糖)。對(duì)于鹽，靜電效應(yīng)導(dǎo)致即使在發(fā)生100%解離時(shí)φ也小于I。用任何培養(yǎng)液或緩沖液對(duì)生物組織的灌注可通過(guò)迫使培養(yǎng)液或緩沖液穿過(guò)生物組織的相關(guān)脈管來(lái)完成。例如，如果生物組織是肝臟，則培養(yǎng)液或緩沖液可以灌注穿過(guò)肝臟的門靜脈。可替代的，培養(yǎng)液或緩沖液可以傾注在生物組織上和/或允許擴(kuò)散通過(guò)生物組織。例如，生物組織可以在培養(yǎng)液或緩沖液中淹沒和/或透析，以允許培養(yǎng)液或緩沖液擴(kuò)散通過(guò)生物組織。在培養(yǎng)液或緩沖液中淹沒和/或透析的同時(shí)可以搖動(dòng)諸如在搖桿上和/或攪拌溶液和生物組織。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)液和緩沖液灌注通過(guò)生物組織的相關(guān)脈管?？商娲?，可以在初始的培養(yǎng)液和緩沖液以及然后用于勻漿提取的培養(yǎng)液中將組織均質(zhì)化。生物基質(zhì)支架的均質(zhì)化形式由大器官(例如，來(lái)自牛或豬組織)制備，然后在液氮溫度下粉碎成粉末，并將該粉末用在皿上用于培養(yǎng)研究。在一些實(shí)施方案中，第一培養(yǎng)液和/或第二培養(yǎng)液是基礎(chǔ)培養(yǎng)液，諸如但不限于RPMI1640, DME/F12、DME、F12、BME、DMEM、Waymouth 培養(yǎng)液、或 William 培養(yǎng)液。其他示例性基礎(chǔ)培養(yǎng)液是本領(lǐng)域已知的且是市售的。第一培養(yǎng)液和/或第二培養(yǎng)液可以包含如本文所述的(例如，通過(guò)重量摩爾滲透壓濃度和離子強(qiáng)度的特定組合并且沒有血清)被組合以保持大部分膠原不溶并作為天然分子的成分，基本由其組成，或由其組成。第一培養(yǎng)液和/或第二培養(yǎng)液可以包含存在或類似于或模擬存在于組織液中的那些組分的組分，由其組成，或基本由其組成，所述組分諸如但不限于:水；鹽，諸如但不限于無(wú)機(jī)鹽；維生素；礦物質(zhì)；氨基酸，諸如但不限于甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、和/或谷氨酰胺；糖；脂肪酸；輔酶；激素；以及神經(jīng)遞質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，其中第一培養(yǎng)液和/或第二培養(yǎng)液包括存在或類似于或模擬存在于組織液中的那些組分的組分，這些組分可以產(chǎn)生約等于市售基礎(chǔ)培養(yǎng)液的重量摩爾滲透壓濃度的重量摩爾滲透壓濃度，或產(chǎn)生約250m0sm/kg至約350m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度。在一些實(shí)施方案中，第一培養(yǎng)液和/或第二培養(yǎng)液包括無(wú)血清、包含存在于組織液中的組分、和/或具有約250m0sm/kg至約350m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度的培養(yǎng)液。該培養(yǎng)液還可以是處于中性pH。第一培養(yǎng)液和/或第二培養(yǎng)液的具體成分在特定實(shí)施方案中通過(guò)用于制備生物基質(zhì)支架的生物組織膠原的不溶性常數(shù)來(lái)確定，這對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。本發(fā)明的脫脂緩沖液應(yīng)該是有效且還是溫和的。脫脂緩沖液可以包含去污劑或表面活性劑、基礎(chǔ)培養(yǎng)液、鹽、和/或脂肪酶，由其組成，或基本由其組成。在選擇用于脫脂緩沖液的成分時(shí)，應(yīng)該避免 苛刻的強(qiáng)力去污劑(例如，十二烷基硫酸鈉；TritonX-100)以使基質(zhì)成分的損失最小化。本發(fā)明的示例性去污劑包括但不限于陰離子去污劑，諸如脫氧膽酸鹽、1-庚烷磺酸、N-月桂酰肌氨酸、月桂烷硫酸鹽、1-辛烷磺酸和?；悄懰岬柠}；陽(yáng)離子去污劑，諸如氯化苯甲烴銨、十六烷基吡啶、氯化甲基芐甲乙氧銨、以及十烴溴銨；兩性離子去污劑，諸如燒基甜菜堿、燒基酰胺燒基甜菜堿、N-十二燒基-N, N- 二甲基-3-胺基-1-丙磺酸鹽、以及磷脂酰膽堿；以及非離子去污劑，諸如正癸基a -D-吡喃葡萄糖苷、正癸基β-D-麥芽吡喃糖苷、正十二烷基β-D-麥芽糖苷、正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、山梨聚糖酯、正十四烷基β-D-麥芽糖苷、曲拉通、Nonidet-P-40、泊洛沙姆188、以及任何去污劑吐溫組；月桂基硫酸鈉；以及脫氧膽酸鈉。在一些實(shí)施方案中，脫脂緩沖液包括脫氧膽酸鈉。示例性脂肪酶包括但不限于:磷脂酶如磷脂酶A2、人胰脂肪酶、鞘磷脂酶、溶酶體脂肪酶、內(nèi)皮脂肪酶、以及肝脂肪酶。在一些實(shí)施方案中，脫脂緩沖液包括磷脂酶A2。在其他實(shí)施方案中，脫脂緩沖液包括脫氧膽酸鈉和磷脂酶A2。在一些實(shí)施方案中，該組合可以包含約20至約50單位/L的磷脂酶A2和約I %的脫氧膽酸鈉，其在中性pH和無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中制備，其可以是例如第一培養(yǎng)液。脫氧膽酸鈉和磷脂酶A2的組合將位于細(xì)胞質(zhì)膜和線粒體膜上的磷酸甘油酯快速降解為溶血卵磷脂，其是一種強(qiáng)力的表面活性劑，可誘導(dǎo)壞死和細(xì)胞裂解。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以意識(shí)到的，脂肪酶和/或去污劑的量和類型可取決于生物組織。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行用脫脂緩沖液灌注生物組織的步驟，直至組織變得透明。在其他實(shí)施方案中，進(jìn)行用脫脂緩沖液灌注生物組織的步驟，直至滲出液變得透明。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行脫脂步驟，直至組織變得透明并且滲出液變得透明。在一些實(shí)施方案中，避免生物基質(zhì)支架延長(zhǎng)暴露于來(lái)自破裂細(xì)胞的酶，因?yàn)樗梢詷O大減少?gòu)椥缘鞍缀亢推咸烟前肪厶侵T如硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、及肝素的含量，它們是細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子結(jié)合的位點(diǎn)。例如在脫脂和/或脫脂后的隨后的清洗期間可以避免暴露于來(lái)自破裂細(xì)胞的酶。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶抑制劑的使用和/或pH、溫度、和/或時(shí)間的小心控制可以用于限制來(lái)自破裂細(xì)胞的蛋白酶和/或其他酶的活性。示例性蛋白酶抑制劑包括但不限于:絲氨酸蛋白酶抑制劑，諸如但不限于抗痛素、抑肽酶、胰凝乳蛋白酶抑制劑、彈性酶抑制劑、苯甲磺酰氟(PMSF)、APMSF, TLCK, TPCK、亮抑酶肽以及大豆胰蛋白酶抑制劑；半胱氨酸蛋白酶，諸如但不限于IAA(吲哚乙酸)和E-64 ；天冬氨酸蛋白酶抑制劑，諸如但不限于胃酶抑素和VdLPFFVdL ;金屬蛋白酶，諸如但不限于EDTA、1,10-鄰二氮雜菲和磷酸阿米酮(phosphoramodon);外肽酶,諸如但不限于氨肽酶抑制劑、苯丁抑制素、抑二肽素A和抑二肽素B ;巰基蛋白酶；α-2-巨球蛋白、大豆或利馬豆膜蛋白酶抑制劑；膜蛋白酶抑制劑；蛋清卵固蛋白；蛋清半胱;氣酸蛋白酶抑制劑；以及蛋白酶抑制劑的組合，通常被該抑制劑供應(yīng)商稱為“蛋白酶抑制劑混合物”。生物基質(zhì)支架、緩沖液、和/或培養(yǎng)液的pH可以維持在約6.0至約9.0、約6.5至約8.5、約7.0至約8.0、或約7.5至約8.0。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架、緩沖液、和/或培養(yǎng)液的pH維持在約7.5至約8.0或維持在約7.3至約7.5，包括但不限于包括在這些范圍內(nèi)但本文未明確陳述的任何值。在其他實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架、緩沖液、和/或培養(yǎng)液維持中性pH。生物基質(zhì)支架(例如，在制備期間和/或制備后)、緩沖液、和/或培養(yǎng)液的溫度可以是約(TC至約30°C、約5°C至約25°C、或約10°C至約20°C，包括但不限于包括在這些范圍內(nèi)但本文未明確陳述的任何值。在一些實(shí)施方案中，溫度維持在約20°C。用于以任何培養(yǎng)液或緩沖液灌注生物組織的時(shí)間可以是約5小時(shí)或更少、約3小時(shí)或更少、約I小時(shí)或更少、約30分鐘或更少、或約15分鐘或更少。在一些實(shí)施方案中，以脫脂緩沖液灌注生物組織的步驟為約30分鐘或更少。在其中使用酸性pH的一些實(shí)施方案中，用于維持膠原和膠原相關(guān)成分不溶的鹽濃度可以是不同的；該濃度通過(guò)現(xiàn)有關(guān)于膠原化學(xué)的文獻(xiàn)通過(guò)選擇維持膠原不溶的鹽濃度來(lái)確定。示例性緩沖液包括但不限于氯化鈉、乳酸鈉、醋酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉、葡萄糖酸鈉、檸檬酸鹽緩沖液、bis\tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液、磷酸鉀、檸檬酸鹽/葡萄糖、碳酸氫鈉、氯化銨、3_{[三(羥甲基)甲基]氨基}丙磺酸、三(羥甲基)甲胺、N-三(羥甲基)甲基甘氨酸、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、以及3-(N-嗎啉基)丙磺酸。在一些實(shí) 施方案中，本發(fā)明的緩沖液(例如，用于本文描述步驟: 中的緩沖液)可以包含約2.0M或更高濃度的鹽。例如，在一些實(shí)施方案中，鹽濃度可以是約2.0M至約5.0M、約2.5M至約5.0M、約3.0M至約4.5M、或約3.0M至約4.0M,包括但不限于包括在這些范圍內(nèi)但本文未明確陳述的任何值。例如，在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法中的緩沖液可以包含鹽諸如氯化鈉，其濃度為約2.0M NaCl至約4.5M NaCl。在其他實(shí)施方案中，諸如對(duì)于成體肝臟的那些，所用的緩沖液可包含約3.4M至約3.5M NaCl。在實(shí)施方案諸如對(duì)于胎兒肝臟的實(shí)施方案中，所用緩沖液可包含鹽諸如氯化鈉，其濃度為約4.0M至約4.50M。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行用鹽清洗液灌注生物組織，諸如本文所描述的示例性方法中步驟c)中的，直至灌注液(即，用于灌注的液體，諸如已經(jīng)迫使穿過(guò)脈管的液體)通過(guò)280nm光密度(OD)對(duì)于蛋白是陰性的。本發(fā)明的任何培養(yǎng)液和/或緩沖液可包含蛋白酶抑制劑。示例性蛋白酶抑制劑如上所述。在一些實(shí)施方案中，緩沖液，諸如本文所描述的示例性方法的步驟c)中的緩沖液，包含蛋白酶抑制劑，諸如大豆胰蛋白酶抑制劑。在其他實(shí)施方案中，步驟d)的緩沖液包含一種或多種蛋白酶抑制劑，諸如大豆胰蛋白酶抑制劑。本發(fā)明的培養(yǎng)液和/或緩沖液可以包含一種或多種核酸酶，其在一些實(shí)施方案中可在這些酶的供應(yīng)商所推薦的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中制備。例如，在一些實(shí)施方案中，步驟d)的緩沖液包含一種或多種核酸酶，諸如但不限于RNase和DNase。以核酸酶灌注消除了核酸的殘留。在其他實(shí)施方案中，步驟d)的緩沖液包含RNase、DNase,以及一種或多種蛋白酶抑制齊U。在一些實(shí)施方案中，以一種或多種核酸酶進(jìn)行生物組織的灌注，直至灌注液(即，用于灌注的液體，諸如已經(jīng)迫使穿過(guò)脈管的液體)通過(guò)260nm光密度(OD)對(duì)于核酸是陰性的。在一些實(shí)施方案中，核酸酶消除了生物組織中75%、80%、85%、90%、95%、98%或100%的核酸。第二培養(yǎng)液(例如，最后的沖洗培養(yǎng)液)可以是如上述的確保膠原和結(jié)合因子(例如，基質(zhì)成分、生長(zhǎng)因子、和細(xì)胞因子)將保持不溶的任何培養(yǎng)液。示例性最終沖洗培養(yǎng)液是如上述關(guān)于第一培養(yǎng)液所描述的，并且是無(wú)血清的、處于中性pH、且具有250-350m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度。例如，在一些實(shí)施方案中，第二培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液。在一些實(shí)施方案中，第二培養(yǎng)液是無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液。在其他實(shí)施方案中，第二培養(yǎng)液是無(wú)血清的、激素限定培養(yǎng)液(HDM)，其包含激素、生長(zhǎng)因子、脂質(zhì)、及血清白蛋白，并且其根據(jù)待培養(yǎng)細(xì)胞的需求來(lái)定制。 示例性的第二培養(yǎng)液是Kubota' s培養(yǎng)液(Kubota和Reid, PNAS 97:12132-12137，2000)，其設(shè)計(jì)用于肝干細(xì)胞、肝母細(xì)胞、和其他祖細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，第二培養(yǎng)液可包含或不包含血清或源自血清的因子的補(bǔ)充，諸如但不限于人血清白蛋白。在一些實(shí)施方案中，以第二培養(yǎng)液沖洗組織消除了脫脂緩沖液和核酸的殘留。在其他實(shí)施方案中，用第二培養(yǎng)液和/或任何后續(xù)緩沖液或培養(yǎng)液的清洗使得用培養(yǎng)液或緩沖液平衡生物基質(zhì)支架。在一些實(shí)施方案中，第一培養(yǎng)液和第二培養(yǎng)液可以是相同的，而在一些實(shí)施方案中，第一培養(yǎng)液和第二培養(yǎng)液可以是不同的，進(jìn)而產(chǎn)生來(lái)自生物組織的生物基質(zhì)支架。在一些實(shí)施方案中，用于生物基質(zhì)支架制備中的一種或多種培養(yǎng)液和/或緩沖液中沒有(即，不包含可檢測(cè)量的)使細(xì)胞外基質(zhì)成分降解的一種或多種酶。在其他實(shí)施方案中，用于生物基質(zhì)支架制備中的所有培養(yǎng)液和緩沖液沒有(即，不包含可檢測(cè)量的)使細(xì)胞外基質(zhì)成分降解的一種或多種酶。示例性酶包括但不限于膠原酶；蛋白酶；糖苷酶，諸如肝素酶、乙酰肝素酶、軟骨素酶、及透明質(zhì)酸酶；以及彈性蛋白酶。本發(fā)明的生物組織、勻漿和/或生物基質(zhì)支架的消毒可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)完成，其中需要告誡的是應(yīng)該避免使用可結(jié)合生物基質(zhì)支架的因子(例如，環(huán)氧乙烷)的方法。示例性消毒方法包括但不限于伽馬輻射、射頻輝光放電(RFGD)等離子體消毒、電子束消毒、以及超臨界二氧化碳消毒。在一些實(shí)施方案中，組織、勻漿和/或生物基質(zhì)支架的消毒使用約5，OOOrads的伽馬輻射來(lái)完成。如果支架立刻用于再細(xì)胞化，以及如果在脫細(xì)胞化過(guò)程中(特別是在高鹽提取后)使用無(wú)菌程序，則可以無(wú)需消毒。生物基質(zhì)支架的保存可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)完成。在一些實(shí)施方案中(例如，在支架將完整使用時(shí))，生物基質(zhì)支架可以在約4°C下保存，以及在其他實(shí)施方案中(例如，在支架將分散為小片時(shí))，生物基質(zhì)支架在例如約_80°C下冷凍。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架包含膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、內(nèi)功素/巢蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖及其任何組合，由其組成，或基本由其組成，它們所有都是生物基質(zhì)支架的部分(例如結(jié)合至生物基質(zhì)支架)。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架缺乏可檢測(cè)量的膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、內(nèi)功素/巢蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖及其任何組合。本發(fā)明的生物基質(zhì)支架已經(jīng)證實(shí)是細(xì)胞的有力分化基，并且可用于許多細(xì)胞類型，諸如但不限于任何成熟細(xì)胞或用于各種干細(xì)胞群體。這些包括，例如胚胎干(ES)細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞、胚層干細(xì)胞(例如，確定的內(nèi)胚層干細(xì)胞)、決定干細(xì)胞(例如，肝、肺、胰或腸干細(xì)胞)、人肝干細(xì)胞(hHpSC)、圍產(chǎn)期干細(xì)胞(例如，羊水來(lái)源干細(xì)胞(AFSC))、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)諸如來(lái)自骨髓或來(lái)自脂肪組織的、定向祖細(xì)胞、任何類型的成體細(xì)胞、病態(tài)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、成熟細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞、星狀細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、膽系細(xì)胞諸如不是膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、平滑肌或骨骼肌細(xì)胞、肌細(xì)胞(肌肉干細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、纖維成肌細(xì)胞(fibromyoblasts)、內(nèi)皮細(xì)胞、外胚層細(xì)胞包括韌性和皮膚細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、胰島細(xì)胞、存在于腸內(nèi)的細(xì)胞、成骨細(xì)胞、形成骨或軟骨的其他細(xì)胞、以及它們的任何組合。這些細(xì)胞可以是正常的或病態(tài)的。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架用于細(xì)胞的生物學(xué)、藥學(xué)、遺傳學(xué)、分子學(xué)、和/或病毒學(xué)研究，不論是新 鮮分離自組織或分離自譜系限定干細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架用于可植入的、血管化的工程改造的器官，諸如但不限于肝臟。針對(duì)生物基質(zhì)支架的其他示例性用途包括但不限于蛋白制造、藥物毒理學(xué)測(cè)試、藥物開發(fā)、抗體篩選、和/或病毒生產(chǎn)以用于病毒的疫苗制備。譜系依賴性病毒(例如，乳頭瘤病毒和丙型肝炎)的病毒生產(chǎn)可以如下實(shí)現(xiàn)，即通過(guò)將干細(xì)胞群體鋪板在組織特異性生物基質(zhì)支架上，然后在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)液與生物基質(zhì)支架組合作用以完全誘導(dǎo)細(xì)胞的分化。這些成熟病毒體將在細(xì)胞完全成熟時(shí)產(chǎn)生。只要病毒自身沒有影響細(xì)胞存活性，被病毒感染的成熟細(xì)胞可以維持至少八周，從而提供了用穩(wěn)定培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生大量病毒的方法。 生物基質(zhì)支架可以完整的使用，諸如但不限于用于細(xì)胞的2-D和/或3-D培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架可以組合特定培養(yǎng)液使用以用于細(xì)胞系的2-D和/或3-D培養(yǎng)中的分化，諸如但不限于，來(lái)自于任何成熟譜系階段的從干細(xì)胞至后期細(xì)胞的正?；虿B(tài)細(xì)胞。可替代的，生物基質(zhì)支架可以冷凍?？梢灾苽溥@些冷凍切片并用作基質(zhì)。生物基質(zhì)支架可以在干冰上快速冷凍，并且冷凍切片用低溫恒溫器制備、置于培養(yǎng)裝置上(例如，皿、燒瓶、織物、轉(zhuǎn)移孔等)，消毒和在培養(yǎng)液中再水化，然后接種細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的冷凍生物基質(zhì)支架切片。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架；b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸步驟(a)的生物基質(zhì)支架；以及c)用細(xì)胞接種步驟(b)的生物基質(zhì)支架，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括:a)產(chǎn)生本發(fā)明的生物基質(zhì)支架；b)冷凍步驟(a)的生物基質(zhì)支架；c)從來(lái)自步驟(b)的生物基質(zhì)支架制備冷凍切片作為細(xì)胞培養(yǎng)基；d)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸步驟(C)的細(xì)胞培養(yǎng)基；以及e)用細(xì)胞接種步驟(d)的細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。在其他實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架可以研磨為粉末。將生物基質(zhì)支架研磨為粉末的一種方法包括在液氮溫度或接近液氮溫度的溫度下在冷凍研磨機(jī)中將生物基質(zhì)支架研磨為粉末。其他用于在液氮或等效溫度下研磨(例如，用干冰冷凍)的裝置是本領(lǐng)域已知的。粉末可以被帶到室溫，在室溫下其獲得涂料的稠度，可以使用無(wú)菌涂料刷或等效裝置將所述涂料包被在培養(yǎng)裝置上。所述粉末或平板可以是消毒的。因此，在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括:a)產(chǎn)生本發(fā)明的生物基質(zhì)支架；b)將步驟(a)的生物基質(zhì)支架研磨為粉末；c)用步驟(b)的粉末包被培養(yǎng)裝置以產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)基；d)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(C)的細(xì)胞培養(yǎng)基；以及e)用細(xì)胞接種(d)的細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。在該方法的一些實(shí)施方案中，在液氮溫度或接近液氮溫度下在冷凍研磨機(jī)(例如，低溫研磨)中進(jìn)行生物基質(zhì)的研磨。在一些實(shí)施方案中，在為了細(xì)胞培養(yǎng)而接種細(xì)胞之前，添加部分培養(yǎng)液至培養(yǎng)裝置中，因?yàn)榧?xì)胞可以在數(shù)秒內(nèi)附著。在一些實(shí)施方案中，對(duì)正常成體細(xì)胞而言，細(xì)胞在數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)附著，而對(duì)各種類型的干細(xì)胞而言，細(xì)胞在數(shù)分鐘至幾個(gè)小時(shí)內(nèi)附著。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞的附著可以取決于生物基質(zhì)支架如何分散用于培養(yǎng)中使用。細(xì)胞培養(yǎng)液可以是適于產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物的任何培養(yǎng)液。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液包含組織液中存在的至少一種組分，其中所述培養(yǎng)液的重量摩爾滲透壓濃度為約250m0sm/kg至約350m0sm/kg，其中所述培養(yǎng)·液是無(wú)血清的且其中pH是中性的。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液可以是基礎(chǔ)培養(yǎng)液，諸如但不限于RPM1-1640、DME/F12、Ham培養(yǎng)液、Kubota培養(yǎng)液，等。在一些實(shí)施方案中，用生物基質(zhì)支架產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物包含與用于制備生物基質(zhì)支架的生物組織細(xì)胞相同類型的細(xì)胞，基本由其組成，或由其組成。本發(fā)明細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括:胚胎干(ES)細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞、決定干細(xì)胞、圍產(chǎn)期干細(xì)胞、羊水來(lái)源干細(xì)胞(AFSC)、來(lái)自任何來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、任何組織類型的定向祖細(xì)胞或成體細(xì)胞、成熟細(xì)胞、正常細(xì)胞、病態(tài)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及其任何組合。另外的非限制性實(shí)例包括肝臟細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞、星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、不是膽管上皮細(xì)胞的膽系細(xì)胞以及胰臟細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，原始干細(xì)胞(不論是ES、iPS、MSC或AFSC)將，至少部分地，將細(xì)胞譜系限制為用于制備生物基質(zhì)支架的組織類型。在支架由源自給定胚層的組織制備時(shí)，該胚層的決定干細(xì)胞將譜系限制為用于制備生物基質(zhì)支架的組織類型，并且如果在源自不同胚層的組織的支架上，則可部分地分化為成體命運(yùn)。因此，成體細(xì)胞完全分化的能力可由生物基質(zhì)支架的組織類型確定。平行的，干細(xì)胞的命運(yùn)可部分或完全由生物基質(zhì)支架的組織類型確定，或干細(xì)胞的命運(yùn)可完全由生物基質(zhì)支架的組織類型確定。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞與用于制備生物基質(zhì)支架的生物組織的細(xì)胞是不同類型的。如上所詳細(xì)描述的，可以用于產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物的示例性細(xì)胞類型包括但不限于胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、羊水來(lái)源干細(xì)胞、決定干細(xì)胞、成熟細(xì)胞、正常細(xì)胞、病態(tài)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及其任何組合。這些細(xì)胞可以來(lái)自本文所述的任何生物組織。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架誘導(dǎo)與正常細(xì)胞分化有關(guān)的緩慢生長(zhǎng)或生長(zhǎng)停滯，不論是干細(xì)胞或成熟細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，成熟細(xì)胞在數(shù)小時(shí)內(nèi)完全分化，并且其后保持穩(wěn)定分化持續(xù)至少八周。在一些實(shí)施方案中，成體細(xì)胞(即，完全成熟細(xì)胞)在數(shù)分鐘內(nèi)附著至支架，并且其后保持它們的完全分化持續(xù)超過(guò)八周。在一些實(shí)施方案中，干細(xì)胞經(jīng)歷幾次分裂并且隨后進(jìn)入生長(zhǎng)停滯并完全分化。干細(xì)胞在生長(zhǎng)停滯中保持穩(wěn)定，存活且完全分化，持續(xù)至少8周。在一些實(shí)施方案中，接種在生物基質(zhì)支架上的干細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)停滯或緩慢生長(zhǎng)，在大約一周內(nèi)失去干細(xì)胞標(biāo)記并分化為成熟、功能細(xì)胞，在至少八周或更長(zhǎng)內(nèi)保持穩(wěn)定表型和存活力(例如，持續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間期間(例如，至少一周、至少兩周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少九周、至少十周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周、至少15周、至少16周、至少一個(gè)月、至少兩個(gè)月、至少三個(gè)月、至少四個(gè)月、至少五個(gè)月、至少六個(gè)月、至少七個(gè)月、至少八個(gè)月、至少九個(gè)月、至少十個(gè)月、至少11個(gè)月、至少一年，等)的40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%的存活力)。在其他實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架用于將胚胎干(ES)細(xì)胞和/或誘導(dǎo)多能干(IPS)細(xì)胞分化為特定命運(yùn)。例如，在一些實(shí)施方案中，組織特異性生物基質(zhì)支架用于促進(jìn)胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向特定命運(yùn)分化。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架用于將羊水來(lái)源干細(xì)胞(AFSC)、或者來(lái)自骨髓或來(lái)自脂肪組織或來(lái)自任何胎兒或出生后組織的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、或者任何決定干細(xì)胞(例如，肺、腸、膽系、腎、皮膚、心臟，等)向特定成體命運(yùn)分化。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物基質(zhì)支架通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物用于增強(qiáng)并加速干細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增強(qiáng)和/或加速干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞的方法，其包括根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞，以及細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液針對(duì)成熟細(xì)胞配制，從而增強(qiáng)和/或加速干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液可以是針對(duì)成熟細(xì)胞配制的任何培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中的組分對(duì)每種細(xì)胞類型是不同的。分化意味著這些條件引起細(xì)胞成熟為產(chǎn)生成體特異性基因產(chǎn)物的成體細(xì)胞類型。用于這些方法中的細(xì)胞可以是任何類型的成體細(xì)胞或干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其非限制性的實(shí)例包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、胚層干細(xì)胞、決定干細(xì)胞、圍產(chǎn)期干細(xì)胞、羊水來(lái)源干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、短暫擴(kuò)增細(xì)胞、或任何組織類型的定向祖細(xì)胞。可以將接種在生物基質(zhì)支架(例如，完整生物基質(zhì)支架、支架切片或混合在其他可植入材料中/上的粉末狀生物基質(zhì)支架)上的細(xì)胞移植進(jìn)動(dòng)物或人作為體內(nèi)移植細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，提供了將細(xì)胞遞送至受試者的方法，其包括用本發(fā)明的生物基質(zhì)支架接觸所述受試者，其中所述生物基質(zhì)支架包含細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，提供了將細(xì)胞遞送至受試者的方法，其包括用細(xì)胞接種本發(fā)明的生物基質(zhì)支架，并且然后將所述用細(xì)胞接種的生物基質(zhì)支架移植進(jìn)受試者。 在一些實(shí)施方案中，可以將沒有用任何細(xì)胞接種的生物基質(zhì)支架移植進(jìn)受試者。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架可以用作移植物，所述移植物可用于在受試者中再生組織或器官。本發(fā)明的生物基質(zhì)支架可用于建立生物人工器官，其在分析和/或臨床項(xiàng)目中是有用的。生物基質(zhì)支架還可用于鑒定特定基因產(chǎn)物或疾病狀態(tài)的方面。在一些實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架由突變動(dòng)物的組織制備，并且隨后用于定義與一種或多種突變相關(guān)的一種或多種相關(guān)因子。在其他實(shí)施方案中，生物基質(zhì)支架由病態(tài)組織制備，并用于定義與疾病相關(guān)的基質(zhì)中的變化。 使用本發(fā)明的生物基質(zhì)支架的其他非限制性實(shí)例包括:1)使用該支架用于培養(yǎng)惡性細(xì)胞，以定義轉(zhuǎn)移潛能(腫瘤細(xì)胞在給定類型的生物基質(zhì)支架上形成細(xì)胞生長(zhǎng)集落的能力預(yù)示細(xì)胞轉(zhuǎn)移至用于制備該支架的組織的能力)；2)將組織移植物置于支架上，其用于移植進(jìn)受試者；3)產(chǎn)生通過(guò)支架的再細(xì)胞化形成的類器官，其用作輔助裝置，諸如，例如肝臟類器官，所述肝臟類器官然后連接至具有肝臟衰竭的受試者；4)使用支架用于蛋白制備(支架上的細(xì)胞產(chǎn)生可以從培養(yǎng)液和/或從細(xì)胞分離并且然后純化的因子)；以及5)使用支架用于產(chǎn)生譜系依賴性病毒；例如用于產(chǎn)生需要分化細(xì)胞以產(chǎn)生足夠顆粒用作疫苗的病毒。因此，本發(fā)明提供了鑒定組織類型中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架山)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的生物基質(zhì)支架；c)用腫瘤細(xì)胞接種(b)的生物基質(zhì)支架；d)在培養(yǎng)條件下維持(C)的生物基質(zhì)支架；以及e)監(jiān)控(d)的生物基質(zhì)支架上腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中生物基質(zhì)支架上腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)鑒定該腫瘤細(xì)胞可以在體內(nèi)在產(chǎn)生所述生物基質(zhì)支架的組織類型中形成集落，進(jìn)而鑒定該腫瘤細(xì)胞在所述組織類型中的轉(zhuǎn)移潛能。本文中還提供了鑒定腫瘤細(xì)胞對(duì)于抗腫瘤治療的響應(yīng)的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架山)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的生物基質(zhì)支架；c)用腫瘤細(xì)胞接種(b)的生物基質(zhì)支架；d)在培養(yǎng)條件下維持(C)的生物基質(zhì)支架；e)將抗腫瘤治療施加至生物基質(zhì)支架上的腫瘤細(xì)胞；以及f)監(jiān)控(e)的生物基質(zhì)支架上腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中(e)的生物基質(zhì)支架上腫瘤細(xì)胞沒有生長(zhǎng)和/或腫瘤細(xì)胞的死亡鑒定該腫瘤細(xì)胞對(duì)于抗腫瘤治療的響應(yīng)?？鼓[瘤治療的非限制性實(shí)例包括:化療劑、抗體、輻射治療、免疫治療、激素治療等，這在本領(lǐng)域是公知的。在一些實(shí)施方案中，可以將來(lái)自受試者的腫瘤細(xì)胞接種到本發(fā)明的不同生物基質(zhì)支架上，并暴露于各自的抗腫瘤治療。根據(jù)這些不同抗腫瘤治療的各自分析的結(jié)果，可以選擇針對(duì)受試者腫瘤細(xì)胞有效的抗腫瘤治療，并且可以將該抗腫瘤治療施用于該受試者以治療該受試者的腫瘤。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生用于移植到宿主動(dòng)物中的腫瘤移植物的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架；b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸步驟(a)的生物基質(zhì)支架；c)用腫瘤細(xì)胞接種(b)的生物基質(zhì)支架；d)在培養(yǎng)條件下維持(C)的生物基質(zhì)支架；以及e)在(d)的生物基質(zhì)支架上建立腫瘤細(xì)胞的群體，進(jìn)而產(chǎn)生用于移植到宿主動(dòng)物中的腫瘤移植物。在一些實(shí)施方案中，本方法還可以進(jìn)一步包括將腫瘤移植物移植到宿主動(dòng)物中的步驟。在各種實(shí)施方案中，腫瘤移植物針對(duì)宿主動(dòng)物來(lái)說(shuō)可以是同源的、同種異型的、或異種的。
本文還提供了產(chǎn)生譜系依賴性病毒的病毒顆粒的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架；b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的生物基質(zhì)支架；
c)用可以被所述譜系依賴性病毒感染的類型和譜系階段的細(xì)胞接種(b)的生物基質(zhì)支架；
d)用譜系依賴性病毒感染(C)的細(xì)胞；e)在培養(yǎng)條件下維持生物基質(zhì)支架上的感染細(xì)胞；以及f)收集感染細(xì)胞中所產(chǎn)生的病毒顆粒，進(jìn)而產(chǎn)生譜系依賴性病毒的病毒顆粒。本發(fā)明的譜系依賴性病毒的非限制性實(shí)例包括丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、諾洛病毒、人乳頭瘤病毒、以及現(xiàn)在已知或后來(lái)鑒定為譜系依賴性的任何其他病毒。譜系依賴意味著其中存在病毒的細(xì)胞必須在病毒在細(xì)胞內(nèi)可以成功復(fù)制并產(chǎn)生病毒顆粒前成熟或分化至特定階段，這是本領(lǐng)域已知的。此外，本發(fā)明提供了產(chǎn)生通過(guò)生物組織支架的再細(xì)胞化形成的類器官的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架；b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸
(a)的生物基質(zhì)支架；c)用與用于制備生物基質(zhì)支架的生物組織相同組織類型的細(xì)胞接種
(b)的生物基質(zhì)支架；以及d)在培養(yǎng)條件下維持生物基質(zhì)支架上的細(xì)胞，由此由所述細(xì)胞形成類器官，進(jìn)而產(chǎn)生通過(guò)生物組織支架的再細(xì)胞化形成的類器官。該方法還可以包括使步驟(a)至(d)產(chǎn)生的類器官與受試者接觸的步驟，其用作輔助裝置，這是本領(lǐng)域所已知的?？梢杂糜诋a(chǎn)生本發(fā)明的生物基質(zhì)支架的任何細(xì)胞類型都可以用于本方法中。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是肝臟細(xì)胞。本發(fā)明另外提供了在生物基質(zhì)支架上培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，其包括:a)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架；b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的生物基質(zhì)支架；c)用產(chǎn)生目的蛋白的細(xì)胞接種(b)的生物基質(zhì)支架；d)在培養(yǎng)條件下在生物基質(zhì)支架上維持(C)的細(xì)胞；以及e)收集由(d)的細(xì)胞產(chǎn)生的目的蛋白，進(jìn)而在生物基質(zhì)支架上培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白。該方法可以包括純化步驟(f)中收集的目的蛋白的進(jìn)一步的步驟。本發(fā)明的目的蛋白可以是由細(xì)胞以可以從培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)的培養(yǎng)液收集的量產(chǎn)生的任何蛋白，所述蛋白由內(nèi)源基`因和/或作為重組蛋白產(chǎn)生。這樣的目的蛋白的很多實(shí)例在本領(lǐng)域是已知的。本發(fā)明將在下面非限制實(shí)施例中進(jìn)行更詳細(xì)的解釋。
實(shí)施例實(shí)施例1:通過(guò)組織特異性生物基質(zhì)支架有效地將人肝干細(xì)胞譜系限制為成熟命運(yùn)摘要:當(dāng)前對(duì)于干細(xì)胞分化的方案使用可溶性信號(hào)和/或基質(zhì)因子的多種處理，并通常通過(guò)成體組織特異性基因的低表達(dá)或過(guò)表達(dá)導(dǎo)致部分分化為成熟細(xì)胞。在本發(fā)明中，開發(fā)了用于干細(xì)胞的快速和有效分化的策略，其使用生物基質(zhì)支架的基質(zhì)、在細(xì)胞外基質(zhì)中富集的組織特異性提取物、以及相關(guān)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，結(jié)合對(duì)于目的成體細(xì)胞類型定制的無(wú)血清、激素限定培養(yǎng)液(HDM)。本文中所述的研究表明了本發(fā)明的生物基質(zhì)支架在將人肝干細(xì)胞(hHpSC)分化為成熟命運(yùn)以及持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間期間維持成熟實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有完全功能中的效力。通過(guò)新的四步灌注脫細(xì)胞化方案使用設(shè)計(jì)以保持所有膠原類型不溶的條件制備生物組織支架。所述支架保持了天然組織學(xué)、專有脈管以及約1%的組織蛋白但>95%的其膠原、大部分的組織膠原結(jié)合基質(zhì)成分、以及生理水平的基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。膠原從幾乎不可檢測(cè)的水平增加至> 15%的具有殘留物的支架蛋白，其包括以與組織學(xué)相關(guān)的模式的層粘連蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白、內(nèi)功素/巢蛋白、蛋白聚糖、和基質(zhì)結(jié)合細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。人肝干細(xì)胞(hHpSC)，接種在肝生物基質(zhì)支架上和對(duì)于人成體肝臟細(xì)胞定制的HAM中，損失干細(xì)胞標(biāo)記并在大約一周內(nèi)分化為成熟、功能性實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其保持存活并具有穩(wěn)定成熟細(xì)胞表型持續(xù)超過(guò)八周。因此，本發(fā)明的生物基質(zhì)支架可以用于譜系限制干細(xì)胞的生物和藥物研究、用于成熟細(xì)胞的保持、以及用于可植入的、血管化工程改造的組織或器官。用于脫細(xì)胞化的程序:在以氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉后，打開大鼠腹腔并將具有插管的套筒插入門靜脈中以灌注整個(gè)肝臟。(I)以RPMI 1640進(jìn)行灌注10分鐘；然后(2)以脂肪酶(例如，20-50單位的磷脂酶A2-PLA2)結(jié)合溫和的去污劑如I %脫氧膽酸鈉(SDC)脫脂約30-60分鐘，直至組織變得透明并且滲出液變得澄清；(3)以高鹽清洗液(對(duì)于胎兒肝臟:4.5M NaCl，以及對(duì)于成體肝臟:3.4M-3.5MNaCl)進(jìn)行灌注，直至灌注液在280nm處的光密度(OD)對(duì)于蛋白是陰性的；(4)在RPMI 1640中以核酸酶(DNase、RNase)灌注，直至灌注液在OD 260下對(duì)于核酸是陰性的；以及(5)用RPMI 1640最后沖洗2小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。生物基質(zhì)支架在干冰上快速冷凍并以低溫恒溫器制備冷凍切片，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，通過(guò)伽馬輻射(5000rads)消毒以及在培養(yǎng)液(KM)中再水合30分鐘，然后接種細(xì)胞。生物基質(zhì)支架切片覆蓋24孔培養(yǎng)板中 95%的孔表面。用于將生物基質(zhì)支架分布在培養(yǎng)皿上的可替代方法包括使用填充有液氮的冷凍研磨機(jī)將生物基質(zhì)支架粉碎為粉末。所粉碎的粉末，在帶到室溫下時(shí)，獲得涂料的稠度，并可以包被在任何表面諸如皿、載玻片、織物、濾膜上或用于附著細(xì)胞和/或細(xì)胞培養(yǎng)的其他表面上。粉碎支架消除了基質(zhì)成分和信號(hào)的梯度，但是存在的成分混合物仍然引起強(qiáng)力的分化效果。在制備用于體內(nèi)移植或用于3-D培養(yǎng)的工程改造器官中，支架還可以完整使用以及用細(xì)胞再接種。開發(fā)了可替代方法用于與豬和牛肝臟使用。豬和牛肝臟從USDA認(rèn)證的肉類加工廠(CT)獲得。對(duì)于代表性方案 的概要，參見實(shí)施例3。每份肝臟都是USDA檢查的并在出廠前接受USDA蓋戳。肝臟在ESP-Gro培養(yǎng)液(Gigacyte，Branford, CT ;目錄號(hào)1101-250)中運(yùn)輸。實(shí)驗(yàn)室接收到的肝臟稱重、拍照記錄并準(zhǔn)備用于灌注。在研磨后，混合物解凍并稀釋到1: 48的培養(yǎng)液:生物基質(zhì)比率。該生物基質(zhì)漿然后用于包被板。在干燥后，生物基質(zhì)清洗三次并然后施加細(xì)胞。成體肝臟細(xì)胞在10分鐘內(nèi)附著至板。干細(xì)胞/祖細(xì)胞可以使用更長(zhǎng)時(shí)間(幾小時(shí))。然而，對(duì)于干細(xì)胞/祖細(xì)胞和成體肝臟細(xì)胞，基本100%的活細(xì)胞附著。培養(yǎng)液和溶液:所有培養(yǎng)液是無(wú)菌-過(guò)濾的(0.22-μπι過(guò)濾器)并在使用前保持在4°C的黑暗中。為了在生物基質(zhì)中保持膠原穩(wěn)定，用于生物基質(zhì)支架制備的灌注培養(yǎng)液的pH 保持在 7.5-8.0。使用 RPM1-1640(Gibco/Invitrogen，Carlsbad, CA)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其用于生物基質(zhì)支架的制備和用于肝細(xì)胞或肝干細(xì)胞培養(yǎng)。所有試劑除了提到的那些以外都從 Sigma (St.Louis, MO)獲得。用于生物基質(zhì)支架制備的灌注培養(yǎng)液:(I)、灌注清洗和灌注沖洗:無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液(例如，RPM1-1640)；(2)、以去污劑灌注:36單位/L PLA2加上1% SDC ;
(3)、以高鹽灌注:3.4M NaCl，其具有0.lmg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑；(4)、以核酸酶灌注:5mg/100ml RNase、lmg/100ml DNase 和 0.lmg/ml 大豆膜蛋白酶抑制劑(例如，在RPMI 1640中制備)。Kubota培養(yǎng)液:KM最初設(shè)計(jì)用于肝母細(xì)胞47并且現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)于人肝祖細(xì)胞48和對(duì)于其他內(nèi)胚層祖細(xì)胞,包括來(lái)自膽系(Wang等人"Multipotent stem/progenitorcells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes andpancreatic islets " Hepatology, 2011,出版中)和膜腺((Wang, Y 和 Reid L,未公開數(shù)據(jù))的細(xì)胞是有效的。它由任何基礎(chǔ)培養(yǎng)液(這里是RPMI 1640)組成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液沒有銅、具有低鈣(0.3mM)、l(T9M硒、0.1% BSA.4.5mM煙酰胺、0.1nM七水合硫酸鋅(來(lái)自Specpure, Johnson Matthew Chemicals, Royston,英格蘭)、ICT8M 氫化可的松、5 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白/Fe、5y g/ml胰島素、10 μ g/ml高密度脂蛋白、以及添加了結(jié)合至純化的人血清白蛋白的游離脂肪酸的混合物。為了將細(xì)胞分化至成體命運(yùn)，可以使用對(duì)于成體細(xì)胞類型定制的無(wú)血清、激素限定培養(yǎng)基(HDM)。例如，我們使用HDM用于成體肝臟命運(yùn)，所述HDM由KM組成，所述KM進(jìn)一步補(bǔ)充鈣以達(dá)到0.6mM濃度、KT12M銅、InM三碘化甲狀腺氨酸(T3)、7ng/ml胰高血糖素、20ng/ml FGF、2g/L 半乳糖、10ng/ml 制瘤素 M(OSM)、10ng/ml 表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、20ng/ml肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、以及10_8M氫化可的松。如果鋪板在支架上，將細(xì)胞接種在該HDM無(wú)血清中；在使用酶來(lái)處理細(xì)胞或組織的情況下，然后我們用5% FBS(HyClone,Waltham,MA)補(bǔ)充HDM持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，然后其后轉(zhuǎn)到無(wú)血清HDM。在平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)物始終保持在具有5% FBS的HDM中，但是我們發(fā)現(xiàn)血清的存在引起細(xì)胞隨著時(shí)間失去分化功能。鑒于如此多因子結(jié)合至生物基質(zhì)支架，與對(duì)于在其他給定基質(zhì)上 培養(yǎng)的通常情況相比需要更少的可溶性因子。鑒于如此多因子結(jié)合至生物基質(zhì)支架，與對(duì)于在其他給定基質(zhì)上培養(yǎng)的通常情況相比需要更少的可溶性因子。肝臟生物基質(zhì)支架中完整血管系(vascular trees)的表征:大鼠肝臟生物基質(zhì)支架中脈管包括毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的分支(branching)和網(wǎng)狀(ramifying)基質(zhì)殘留物分別通過(guò)光顯微鏡和熒光顯微鏡可視化。將若丹明標(biāo)記的250kDa葡聚糖顆粒通過(guò)門靜脈的殘留物注射到肝臟生物基質(zhì)支架中，以檢查生物基質(zhì)支架中脈管系統(tǒng)的基質(zhì)殘留物的完整性。使用Leica MZ16FA熒光解剖顯微鏡(機(jī)動(dòng)化)制備影片。人胎兒肝臟處理:由認(rèn)證機(jī)構(gòu)(AdvancedBiological Resources, SanFrancisco,CA)從通過(guò)選擇妊娠終止獲得的16-20周胎齡的胎兒提供胎兒肝臟組織。該研究方案由北卡羅來(lái)納查佩爾山大學(xué)的針對(duì)人研究的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)審查和批準(zhǔn)。人胎兒肝臟細(xì)胞的懸浮液如先前描述地進(jìn)行制備48'49。簡(jiǎn)要的說(shuō)，在補(bǔ)充0.1%牛血清白蛋白、InM硒和抗生素的RPMI 1640中進(jìn)行處理。酶處理緩沖液含有300U/ml IV型膠原酶和0.3mg/ml脫氧核糖核酸酶，其在32°C頻繁攪拌15-20分鐘。將富集的緩沖液擠壓通過(guò)75規(guī)格網(wǎng)，并以1200RPM旋轉(zhuǎn)5分鐘，然后再懸浮。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法評(píng)估的細(xì)胞存活力通常高于95%。hHpSC的富集和在生物基質(zhì)支架上的培養(yǎng):我們使用兩種方法用于hHpSC的純化或富集:I)培養(yǎng)選擇:將大約3X105細(xì)胞鋪板在IOcm組織培養(yǎng)皿和KM中。每三天更換培養(yǎng)液。5-7天內(nèi)形成集落并觀察最長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月。我們?cè)?4-18天后使用倒置顯微鏡(1X-FLAIII ；01ympus, Japan 和 Melville, NY)手動(dòng)挑選集落。2)使用 Miltenyi Biotech MACS 系統(tǒng)(Bergisch Gladbach,德國(guó))遵照廠商說(shuō)明書通過(guò)使用磁珠免疫選擇技術(shù)選擇針對(duì)上皮細(xì)胞粘附分子(hHpSC和hHB)為陽(yáng)性的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)專能肝祖細(xì)胞亞群(multipotent hepatic progenitor subpopulations)的磁性免疫選擇5°。簡(jiǎn)要的說(shuō)，在4°C，將解離的細(xì)胞與結(jié)合至磁性微珠的EpCAM抗體孵育30分鐘，并使用來(lái)自Miltenyi的磁柱分離系統(tǒng)遵照廠商推薦程序進(jìn)行分離。用250hHpSC集落、或5X IO5富集的hHpSC或2.5X IO5的原代成體肝細(xì)胞接種培
養(yǎng)物。每日更換培養(yǎng)液，并且所收集的培養(yǎng)液在_20°C下保存用于進(jìn)一步分析。在包被I型膠原的24孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照。成體大鼠肝細(xì)胞分離:大鼠肝細(xì)胞的新鮮分離懸浮液從3個(gè)月大、重200_250g的成體雄性 Lewis 大鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)獲得。使用如先前所述的改進(jìn)兩步灌注法49用于大鼠肝細(xì)胞分離和純化。用含有EGTA的無(wú)鈣緩沖液灌注肝臟10-15分鐘，然后在含有膠原酶的含鈣緩沖液中灌注10-15分鐘。然后通過(guò)擠壓消化的肝臟穿過(guò)紗布并隨后繼續(xù)將細(xì)胞懸浮液通過(guò)狹窄網(wǎng)格尺寸的篩網(wǎng)來(lái)機(jī)械地解離肝臟。細(xì)胞清洗兩次并然后在50g離心。通過(guò)在臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)細(xì)胞來(lái)定義存活力。通常，每只大鼠分離200-300百萬(wàn)細(xì)胞，存活力為89-95%，純度為> 99%。成體肝細(xì)胞分離和培養(yǎng):從CellzDirect (現(xiàn)在是Invitrogen, RTP, NC的部分)獲得新鮮的人肝臟細(xì)胞懸浮液。每種CellzDirect方法處理懸浮液，然后在H印toMAIN培養(yǎng)液中(目錄號(hào)1103-250 ；GigaCyte, Branford, CT)再懸浮，以1.88 X IO5細(xì)胞/cm2鋪板在用肝臟生物基質(zhì)支架包被的多孔培養(yǎng)板中或I型膠原上(I μ g/ml,Meridian目錄號(hào)A33704H)。膠原化學(xué)分析:生物基質(zhì)支架中的膠原量基于羥脯氨酸(hyp)含量來(lái)評(píng)估。粉碎、清洗并凍干整個(gè)肝臟的樣本以及生物基質(zhì)支架的樣本。然后水解等分試樣并進(jìn)行氨基酸分析51，以及基于300殘留/膠 原的hyp值來(lái)評(píng)估每種總蛋白中的膠原量。DNA和RNA含量的定量分析:為了評(píng)估保留在脫細(xì)胞化肝臟生物基質(zhì)中的總DNA，稱重新鮮大鼠肝臟組織和脫細(xì)胞化的生物基質(zhì)，切割并用蛋白酶K消化，以及分離總的細(xì)胞DNA52。為了評(píng)估保留在脫細(xì)胞化的肝臟生物基質(zhì)中的總RNA，稱重新鮮大鼠肝臟組織和脫細(xì)胞化的大鼠肝臟生物基質(zhì)，然后在TRIzol溶液(Invitrogen)中均勻化，以及分離總的細(xì)胞RNA。生長(zhǎng)因子測(cè)定:將大鼠肝臟、大鼠肝臟生物基質(zhì)支架、人膽管組織和人膽管生物基質(zhì)支架的樣本(每種兩個(gè)樣本)送到RayBiotech, Inc (Norcross, Georgia)用于生長(zhǎng)因子的分析。將這些樣本均勻化，制備為裂解物，并且然后用lmg/ml蛋白進(jìn)行測(cè)定，產(chǎn)生熒光，所述突光以突光強(qiáng)度單位(FIU)定義。使用Ray Bio Human Growth Factor Arrays, G
Series I進(jìn)行半定量生長(zhǎng)因子測(cè)定。FIU減去來(lái)自關(guān)于非特異性結(jié)合的陰性對(duì)照的FIU，并標(biāo)準(zhǔn)化為蛋白濃度。將來(lái)自一式兩份的數(shù)據(jù)取平均值。使用四組陣列來(lái)實(shí)現(xiàn)針對(duì) 40種生長(zhǎng)因子的測(cè)量。雖然該測(cè)定開發(fā)用于人生長(zhǎng)因子，但是其在與大鼠生長(zhǎng)因子的交叉反應(yīng)中具有足夠重疊以使得可以用于大鼠和人樣本。透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡檢查(TEM和SEM):對(duì)于TEM，以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗生物基質(zhì)支架，并在pH7.4的3%戊二醛/0.1 二甲胂酸鈉中固定過(guò)夜。在以二甲胂酸鈉緩沖液沖洗三次后，生物基質(zhì)支架在1%四氧化鋨/0.1 二甲胂酸鈉中后固定I小時(shí)。在去離子水中沖洗后，將其脫水并嵌入Polybed 812環(huán)氧樹脂(Polysciences,Niles,IL)中。使用金剛石刀垂直于基底以70nm切片生物基質(zhì)支架。超薄切片收集在200網(wǎng)孔銅網(wǎng)上，并用4%水性醋酸雙氧鈾染色15分鐘，然后用Reynolds'檸檬酸鉛染色7分鐘。使用以80kV操作的LEO EM910透射電子顯微鏡(LEO Electron Microscopy,Oberkochen,Germany)觀察樣本。使用 Gatan Orius SCIOOO CCD 數(shù)碼相機(jī)和 Digital Micrograph 3.11.0 (Gan,Pleasanton, CA)采集數(shù)字圖像。對(duì)于SEM，在固定和沖洗后，將生物基質(zhì)支架脫水并在100%乙醇中轉(zhuǎn)移至Balzers CPD-020 臨界點(diǎn)干燥機(jī)(Bal-Tec AG, Balzers, Switzerland),使用二氧化碳作為過(guò)渡溶劑干燥。該基質(zhì)利用碳膠標(biāo)簽安裝在鋁質(zhì)試樣支持件上，并使用Hummer X噴涂機(jī)(Anatech, Worcester MA)用IOnm厚的金鈕合金(60: 40合金)包被。在5kV加速電壓時(shí)使用 Zeiss Supra 55 FESEM 檢查樣本并使用 Zeiss SmartSEM 軟件(Carl Zeiss SMT，Germany和Thornwood, NY)米集數(shù)字圖像。免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織學(xué):對(duì)于生物基質(zhì)支架上培養(yǎng)的細(xì)胞的熒光染色，細(xì)胞在室溫下以4%多聚甲醛(PFA)固定20分鐘，以HBSS沖洗，在HBSS中以10%山羊血清封閉2小時(shí)，并沖洗。固定細(xì)胞在4°C下用第一抗體孵育過(guò)夜，清洗，用標(biāo)記的同種型特異性第二抗體孵育I小時(shí)，清洗，用4’，6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染以用于細(xì)胞核的可視化，并使用Leica DMIRB倒置顯微鏡(Leica, Houston, TX)觀察。對(duì)于免疫組織化學(xué)，生物基質(zhì)支架在4% PFA中固定過(guò)夜并在70%乙醇中保存。它們嵌入石蠟中并切割為 5μπι切片。對(duì)切片脫蠟，以及修復(fù)抗原。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶通過(guò)在0.3% H2O2溶液中孵育30分鐘而封閉。在以10%馬血清封閉后，在4°C施加第一抗體過(guò)夜；使用 RTU Vectastain 試劑盒(Vector Laboratories, Burlingame, CA)進(jìn)行第二抗體和ABC染色。Vector Nova RED用作底物。將切片脫水，固定并嵌入Eukitt封固培養(yǎng)液中(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA),并使用倒置顯微鏡分析。用于肝臟切片和用于培養(yǎng)的抗體列于表4中。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析:hHpSC在細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，并且該集落轉(zhuǎn)移到生物基質(zhì)支架上。在進(jìn)一步培養(yǎng)7天后，該集落裂解用于RT-PCR。使用RNeasy PlusMini試劑盒(Qiagen GmbH, Valencia CA)根據(jù)廠商說(shuō)明書提取總RNA。使用SuperscriptFirst-Strand Synthesis 系統(tǒng)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄用于 RT-PCR(Invitrogen, Carlsbad, CA)。使用HotStarTaq Master Mix 試劑盒(Qiagen)用于 PCR。PCR 引物列于表 5 中。活體/死亡試驗(yàn)和細(xì)胞存活試驗(yàn):活體/死亡存活力測(cè)定試劑盒(MolecularProbes/Invitrogen, Carlsbad, CA)用于粘附和增殖測(cè)定。hHpSC或肝細(xì)胞與兩種探針I(yè)丐黃綠素-AM(活體，淺灰色)和溴乙非啶同型二聚體-l(EtdD-l，死亡)孵育，分別用于細(xì)胞內(nèi)酯酶活性和質(zhì)膜完整性。在熒光Olympus SZX12立體顯微鏡(OLYMPUS，Japan和Melville，NY)下觀察樣本。遵循廠商手冊(cè)使用刃天青細(xì)胞存活力測(cè)定試劑盒(Biotium, Hayward,CA)。簡(jiǎn)要的說(shuō)，10%刃天青溶液添加至培養(yǎng)的培養(yǎng)液中并在37°C下孵育過(guò)夜。使用BiotekSynergy HT多檢測(cè)酶標(biāo)儀(Winooski，VT)獲得0D57(l-0D_吸光度，并繪制存活力曲線。所有實(shí)驗(yàn)在每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下使用最少3份樣本進(jìn)行三次。

肝特異性功能測(cè)定:使用P450_Glo 篩選系統(tǒng)(Promega, Madison, WI)檢測(cè)CYP450 3A4活性。簡(jiǎn)要的說(shuō)，在37°C下，培養(yǎng)的細(xì)胞與含有發(fā)光的CYP3 A4底物(對(duì)于CYP為熒光素PPXE)的培養(yǎng)液孵育4小時(shí)。使用Wallace Victor2 Multilabel Counter (現(xiàn)在是Waltham, MA的Perkins/Elmer的部分)根據(jù)廠商說(shuō)明書進(jìn)行突光素檢測(cè)和分析。使用人白蛋白ELISA定量試劑盒(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)進(jìn)行定量白蛋白分泌。針對(duì)尿素合成分析,細(xì)胞與2mM銨孵育24小時(shí)，收集上清液并使用Quantichrom尿素測(cè)定試劑盒(Bioassay Systems,Hayward,CA)測(cè)定。對(duì)來(lái)自針對(duì)每個(gè)培養(yǎng)條件的一個(gè)樣本的上清液一式三份進(jìn)行測(cè)定，并且該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)分析:針對(duì)每個(gè)條件使用一式兩份或一式三份樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少2-3次。呈現(xiàn)了來(lái)自代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，而在多次實(shí)驗(yàn)中觀察到類似的趨勢(shì)。所有誤差條代表了
S.E.Mo使用新的四步方案制備生物基質(zhì)支架:使用包括脫脂而后高鹽提取的方案并使用灌注方法(圖1)制備生物基質(zhì)支架。該方法中給出了方案的詳細(xì)介紹。這通過(guò)新的四步方案來(lái)實(shí)現(xiàn):I)溫和脫脂；2)用具有約2.0M至約5.0M(例如2.0M-2.5Μ、2.6Μ-3.0M ；
3.1Μ-3.5Μ、3.6Μ-4.0Μ、4.1Μ_4.5Μ ；4.6Μ_5.0M)鹽濃度的緩沖液清洗，所述鹽濃度已知維持膠原處于不溶狀態(tài)23 (緩沖液的精確濃度和PH由組織中的膠原類型確定)，所述濃度已知維持膠原處于不溶狀態(tài)23 ；3)核酸酶處理以消除殘留的核酸；以及4)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗以消除去污劑、鹽和核酸·酶殘留物，以及用培養(yǎng)液平衡基質(zhì)成分(圖1Α)。針對(duì)核酸酶的沖洗培養(yǎng)液或緩沖液的選擇可以是多種選擇中的任一種，只要鹽濃度和離子強(qiáng)度得以維持基質(zhì)成分處于不溶狀態(tài)。脫脂方法的選擇對(duì)于有效且溫和是關(guān)鍵的。我們選擇脫氧膽酸鈉(SDC)和磷酯酶A2(PLA2)的組合來(lái)將位于質(zhì)膜和線粒體膜上的磷酸甘油酯快速降解為溶血卵磷脂，其是一種強(qiáng)力表面活性劑，其可以誘導(dǎo)壞死和細(xì)胞裂解。圖8顯示了反應(yīng)式。我們避免強(qiáng)力去污劑，諸如十二烷基硫酸鈉(SDS)或Triton-X 100，其可以裂解一些基質(zhì)成分，諸如葡萄糖胺聚糖(參見Gilbert等人的綜述"Decellularization of tissues and organs " , Biomaterials 27:3675-3683(2006))。我們避免支架在脫脂和高鹽清洗期間長(zhǎng)期暴露在來(lái)自破裂細(xì)胞的酶，因?yàn)樗鼈兛梢詷O大的降低彈性蛋白的含量和葡萄糖胺聚糖(GAG)的含量，所述葡萄糖胺聚糖諸如硫酸肝素(HS)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸皮膚素(DS)和肝素(HP)，它們是細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子結(jié)合的部位24。我們使用大豆胰蛋白酶抑制劑并小心控制PH(7.5-8.0)、溫度(20°C )、和時(shí)間(30-60分鐘)以限制源自破裂細(xì)胞的蛋白酶的活性。我們通過(guò)相關(guān)脈管(例如，肝臟中的門靜脈)灌注整個(gè)組織，這使得我們快速分離(幾個(gè)小時(shí)內(nèi))生物基質(zhì)支架而使基質(zhì)成分的損失最小化。分離的快速是由于用去污劑的初始步驟在大約30-60分鐘(而不是像其他使用的方案中的數(shù)小時(shí)或數(shù)天)內(nèi)使組織脫月旨。產(chǎn)生的生物基質(zhì)支架是透明或白色的(圖1)。此外，使用該灌注方法，我們維持了初始的脈管通道、門靜脈和肝靜脈以及肝臟中的大部分血管分支，這增加了脫細(xì)胞化效率。通過(guò)生物基質(zhì)支架灌注的熒光羅丹明標(biāo)記的葡聚糖顆粒保持在脈管殘留物內(nèi)，這表明它們是顯著的(圖1E)。存在染料從大血管沿通道逐漸流入細(xì)血管分支而沒有泄露。該事實(shí)在支架的血管再形成中將是有幫助的，所述血管再形成作為制備工程改造的組織用于三維培養(yǎng)和/或用于體外植入的方法。在切片時(shí)，支架保持了初始組織的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，包括主要組織學(xué)實(shí)體中的可識(shí)別殘留物，諸如血管、膽管、以及格利森氏囊(GC)(圖1)。對(duì)比圖1Bl和1D1，其中肝臟組織的切片與生物基質(zhì)支架的切片對(duì)比。實(shí)質(zhì)細(xì)胞壁的基質(zhì)殘留物由網(wǎng)格狀網(wǎng)絡(luò)組成(圖1D2-1D3)。膠原、膠原相關(guān)蛋白和結(jié)合細(xì)胞因子保持在生物基質(zhì)支架中:生物基質(zhì)支架中的膠原量通過(guò)前面所使用的方法通過(guò)氨基酸分析來(lái)評(píng)估25。因?yàn)榱u脯氨酸(Hyp)對(duì)于膠原和月父原蛋白是獨(dú)特的，相對(duì)于總蛋白的月父原組成表不為每1000個(gè)氣基酸中的Hyp殘留。該結(jié)果表明膠原含量從幾乎不可檢測(cè)的水平，即肝臟中小于0.2殘留的羥脯氨酸(Hyp)/1000，增加至生物基質(zhì)支架中 13殘留的Hyp/1000。這表明如上所述的脫脂和高鹽清洗沒有去除膠原，在生物基質(zhì)支架中留下幾乎所有的膠原。檢測(cè)到生物基質(zhì)支架中顯著水平的另一種膠原相關(guān)氨基酸一輕賴氨酸(Hyl)，以及更高水平的甘氨酸(Gly)支持了我們的結(jié)論，即膠原在生物基質(zhì)支架中是明顯富集的(圖2A、9和表2)。使用免疫組織化學(xué)和超微結(jié)構(gòu)研究，我們能夠在支架中鑒定肝臟中原位發(fā)現(xiàn)的所有已知形式的膠原，包括纖維狀膠原(1、III和V型膠原,對(duì)于小纖維為10_30nm直徑,對(duì)于裝配纖維為500-3000nm直徑)和珠狀纖維(可能是VI型)。那些纖維和纖絲存在于間皮層下的包膜下結(jié)締組織層中。盡管在沿門三聯(lián)管至中央靜脈的血竇中沒有發(fā)現(xiàn)基膜的典型結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)了 IV型膠原和一些結(jié)合小纖維形成網(wǎng)狀、多孔3D網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，其充當(dāng)用于實(shí)質(zhì)細(xì)胞的支架(圖2)。I型膠原束可視為支架的主要結(jié)構(gòu)，其他型膠原、糖蛋白、以及蛋白聚糖附著至所述支架的主要結(jié)構(gòu)。在狄氏間隙中，我們發(fā)現(xiàn)I型膠原的小束和III型和IV型以及一些V型膠原的纖維，所述V型膠原纖維在門三聯(lián)管和中央靜脈附近更豐富。代表性的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于圖3B中，以及基質(zhì)成分和它們?cè)谡８闻K組織中的位置與它們?cè)谏锘|(zhì)支架中的位置的比較的概要列于圖4D中。在針對(duì)生物基質(zhì)支架制備的方案發(fā)展中的早期研究表明，大量的細(xì)胞骨架成分在清洗中丟失。但是，我們通過(guò)免疫組織化學(xué)評(píng)估支架，并且我們沒有發(fā)現(xiàn)微管蛋白、肌間線蛋白或肌動(dòng)蛋白、微量的細(xì)胞角蛋白18和19、以及低水平的波形蛋白遍布整個(gè)支架的證據(jù)。與膽管以及部分肝血管系統(tǒng)(動(dòng)脈和靜脈血管)相關(guān)的基質(zhì)由典型的基膜結(jié)構(gòu)組成，所以與在血竇中發(fā)現(xiàn)的脈管結(jié)構(gòu)相關(guān)的基質(zhì)薄層相當(dāng)不同。層粘連蛋白、巢蛋白/內(nèi)功素、基底膜聚糖和IV型膠原發(fā)現(xiàn)于門三聯(lián)管中，而在狄氏間隙中僅發(fā)現(xiàn)基底膜聚糖和一些IV型膠原。存在大量的疏水、波狀彈性蛋白；它交聯(lián)在一起并形成片層和纖維，其主要限定于包膜下結(jié)締組織、門靜脈區(qū)、以及動(dòng)脈壁。纖連蛋白普遍存在并遍及于肝基質(zhì)中，并且在狄氏間隙中是尤其豐富的，在那里它們形成細(xì)纖絲或粒狀沉積(圖2和3)。免疫組織化學(xué)表明，組織中已知的蛋白聚糖保存于生物基質(zhì)支架中(圖3B、4D)。在鑒定的異質(zhì)蛋白多糖中，沿血竇間插且并連續(xù)地發(fā)現(xiàn)多配體聚糖，而基底膜聚糖在狄氏間隙中更間插。發(fā)現(xiàn)HS-PG和CS-PG的形式遍及生物基質(zhì)支架中的血竇的殘留物，其模式與肝臟組織中已知成帶相關(guān)。蛋白聚糖和其他基質(zhì)成分對(duì)于細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子是重要儲(chǔ)庫(kù)，所述細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子緊密結(jié)合至它們的GAG26。大部分生長(zhǎng)因子和激素發(fā)現(xiàn)于生物基質(zhì)支架中，其接近初始組織中發(fā)現(xiàn)的濃度。在表6中，給出了來(lái)自大鼠肝臟裂解物和大鼠肝臟生物基質(zhì)支架的比較的數(shù)據(jù)， 以及在表3中，提供了來(lái)自人膽管組織與膽管生物基質(zhì)支架的比較的平行數(shù)據(jù)。有趣的是，存在肝臟生物基質(zhì)支架中相比于肝臟裂解物所發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)烈富集的幾個(gè)實(shí)例(例如，bFGF)。結(jié)合的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子在肝臟與膽管組織的支架的比較之間在定性和定量上是不同的，其暗示了組織特異性或物種特異性?？商娲模梢?，部分地，是由于膽管支架需要通過(guò)在搖桿上搖動(dòng)緩沖液中的組織而不是通過(guò)穿過(guò)脈管灌注來(lái)制備的事實(shí)。生物基質(zhì)支架的化學(xué)物與組織學(xué)相關(guān):該新方案的重要特征在于保留基質(zhì)化學(xué)物，其模式與門三聯(lián)管至中央靜脈的肝腺泡區(qū)1-3并與組織學(xué)實(shí)體諸如血管通路和格利森氏囊(GC)相關(guān)，如圖4A-C中所示。區(qū)I中的門靜脈周圍的基質(zhì)化學(xué)物類似于胎兒肝臟中所發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)化學(xué)物，并且部分地由III型膠原、層粘連蛋白、以及CS-PG的形式組成。它轉(zhuǎn)變?yōu)橹胁肯倥?區(qū)2)和中心周圍區(qū)(區(qū)3)中不同的基質(zhì)化學(xué)物，其終止于非常穩(wěn)定的具有高水平IV型膠原和HP-PG的基質(zhì)27。已知的是，多種蛋白(例如，生長(zhǎng)因子和激素、凝固蛋白、各種酶)通過(guò)結(jié)合至GAG中離散且特定的硫酸化模式或結(jié)合至其他基質(zhì)成分而結(jié)合至基質(zhì)并保持穩(wěn)定24。因此，基質(zhì)化學(xué)物從干細(xì)胞食中的其起始點(diǎn)(具有與聞轉(zhuǎn)化和最小限度硫酸化相關(guān)的不穩(wěn)定基質(zhì)化學(xué)物)轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的基質(zhì)化學(xué)物并具有增加量的硫酸化，并向中心周圍區(qū)進(jìn)行。我們期望天然結(jié)構(gòu)以及與組織學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)的基質(zhì)化學(xué)物的保持將通過(guò)將細(xì)胞引導(dǎo)至生物基質(zhì)支架上的特定部位和/或提供合適的信號(hào)混合物來(lái)驅(qū)動(dòng)擴(kuò)張和/或分化為成熟細(xì)胞來(lái)促進(jìn)組織工程改造過(guò)程中的再細(xì)胞化。生物基質(zhì)支架可以由不同組織和物種來(lái)制備:生物基質(zhì)支架可以由任何正?；虿B(tài)的組織和由任何物種來(lái)容易地制備。在圖13-16中，我們顯示了來(lái)自人胰腺、膽系、和十二指腸以及來(lái)自大鼠和豬胰腺的生物基質(zhì)支架。在圖5-7和圖12中顯示了?；虼笫蟾闻K生物基質(zhì)支架對(duì)肝細(xì)胞的影響。另外，生物基質(zhì)支架由人腹主動(dòng)脈、髂靜脈、以及由大鼠和豬的腸來(lái)制備。對(duì)生物基質(zhì)支架的組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和免疫組織化學(xué)研究表明了在它們的結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、以及功能中具有明顯的組織特異性，而沒有物種特異性。生物基質(zhì)支架誘導(dǎo)和/或維持細(xì)胞的分化:將hHpSC鋪板在具有肝臟生物基質(zhì)支架切片的皿上以及對(duì)于成體肝臟細(xì)胞定制的HDM中，導(dǎo)致基本100%的活細(xì)胞在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)附著在生物基質(zhì)支架上；而不論是完整的還是低溫粉碎后。在支架切片上初始形成的細(xì)胞集落保留了它們的一些干·細(xì)胞表型，因?yàn)榧渲行牡募?xì)胞能夠抵抗染料的染色(圖11)并表達(dá)典型的肝祖細(xì)胞標(biāo)記，諸如趨化因子(C-X-C基序)受體4(CXCR4)和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)(圖5)。它們分裂I次或兩次，并然后轉(zhuǎn)換到細(xì)胞周期停滯并轉(zhuǎn)換到三維(3D)索狀形態(tài)，其對(duì)于成熟實(shí)質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物是典型的(圖5和6針對(duì)干細(xì)胞分化；與圖7和圖12對(duì)比)。所使用的HDM不需要所有的常用細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，因?yàn)檫@些以結(jié)合至生物基質(zhì)支架的形式存在。轉(zhuǎn)換到生長(zhǎng)停滯與活性染料對(duì)整個(gè)集落的染色相關(guān)(圖12)，其伴隨EpCAM和CXCR4表達(dá)的丟失，以及成體特異性肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞基因諸如尿素和細(xì)胞色素P450 3A4的表達(dá)的穩(wěn)定增加(圖5)。正常成體大鼠和成體肝細(xì)胞鋪板在I型膠原上或鋪板在來(lái)自大鼠或牛肝臟的生物基質(zhì)支架上，并且對(duì)于成體細(xì)胞鋪板于HDM中。成體實(shí)質(zhì)細(xì)胞能夠在10分鐘內(nèi)(即使在無(wú)血清培養(yǎng)液中)附著至支架，與之相比，在數(shù)小時(shí)內(nèi)附著在I型膠原上，其從附著點(diǎn)開始保持在生長(zhǎng)停滯；并在支架上保持存活和完全功能持續(xù)超過(guò)8周，與之相比，在I型膠原上保持約 2周(圖7和12)。在生物基質(zhì)支架上成熟肝臟細(xì)胞持續(xù)數(shù)周的功能水平證實(shí)與在其他新鮮分離的成體肝細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)相同或類似28。引入注目的區(qū)別是I型膠原上的培養(yǎng)物在2周后迅速惡化，而在生物基質(zhì)支架上的培養(yǎng)物在形態(tài)和功能上保持穩(wěn)定，持續(xù)維持培養(yǎng)物的時(shí)間(到目前為止 8周)。生物基質(zhì)支架包含了大部分組織的細(xì)胞外基質(zhì)成分和基質(zhì)結(jié)合細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子，其提供一組復(fù)合的化學(xué)信號(hào)，其可以用于不溶的、穩(wěn)定的支架，其具有特別的能力以誘導(dǎo)hHpSC為成體肝臟命運(yùn)，以及維持成體細(xì)胞完全分化持續(xù)數(shù)周。對(duì)比研究人員制備的基質(zhì)提取物的現(xiàn)有類型與本發(fā)明的生物基質(zhì)支架的類型，明顯的是，物理處理、酶處理和化學(xué)處理對(duì)組成、機(jī)械行為、以及對(duì)源自天然組織和器官脫細(xì)胞化的生物支架的宿主反應(yīng)有實(shí)質(zhì)性的影響，并且相應(yīng)地，對(duì)于它們的體外和體內(nèi)應(yīng)用具有重要啟示。所有其他現(xiàn)有的用于制備基質(zhì)或支架的方法通過(guò)使用基質(zhì)降解酶16或使用溶解大部分基質(zhì)的緩沖液11而導(dǎo)致大部分基質(zhì)成分的去除。物理方法(例如，速凍和攪拌)可以作用以從具有分層結(jié)構(gòu)的組織諸如真皮(例如，SIS、BSM)29制備基質(zhì)提取物，，但不能用于具有復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)的器官，諸如肝臟。通過(guò)對(duì)比，我們用于生物基質(zhì)支架的方法導(dǎo)致大部分細(xì)胞蛋白的損失，但保存了基本全部或至少大部分膠原和膠原相關(guān)成分，包括基質(zhì)結(jié)合細(xì)胞因子、激素和生長(zhǎng)因子。細(xì)胞外基質(zhì)嵌入嵌合體脂質(zhì)雙分子層中，甚至在最簡(jiǎn)單生物體中，其是復(fù)雜的、異質(zhì)且動(dòng)態(tài)的環(huán)境。脫脂方法是方案的關(guān)鍵方面。對(duì)于組織脫細(xì)胞化通常使用的方法包括離子型去污劑，諸如SDC和十二烷基硫酸鈉(SDS)。SDC比SDC相對(duì)更溫和，傾向于引起對(duì)天然組織結(jié)構(gòu)的更少的破壞，并且在溶解細(xì)胞質(zhì)膜和核細(xì)胞膜上效率更低3°。沒有單獨(dú)使用SDC進(jìn)行組織脫細(xì)胞化的報(bào)告。許多研究使用強(qiáng)力非離子型去污劑(例如，Triton X-100)31或兩性離子去污劑(例如，3-[(3_膽酰胺丙基)二甲基胺基)]-1_丙磺酸鹽，CHAPS)32。通過(guò)對(duì)比，我們使用SDC和PLA2組合的方法對(duì)組織快速且溫和地脫脂。目前為止已經(jīng)在脊椎動(dòng)物中鑒定了至少29種類型膠原(1-XXIX)，所述膠原在細(xì)胞粘附、分化、生長(zhǎng)、組織發(fā)育和結(jié)構(gòu)完整性中具有功能作用33'34。基質(zhì)中的主要結(jié)構(gòu)成分，膠原，已知在高鹽濃度和中性PH中保持不溶35'36，這一發(fā)現(xiàn)是我們制備生物基質(zhì)支架策略的基礎(chǔ)。該策略具有額外的優(yōu)勢(shì)，即膠原實(shí)現(xiàn)結(jié)合于它們的基質(zhì)成分諸如層粘連蛋白和纖連蛋白(FN)、富含小亮氨酸的蛋白聚糖(PG)和GAG的保存，所述基質(zhì)成分進(jìn)而保存結(jié)合于它們的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或細(xì)胞表面受體。生物基質(zhì)支架在它們誘導(dǎo)干細(xì)胞/祖細(xì)胞諸如hHpSC快速和穩(wěn)定分化為成體命運(yùn)以及保持它們的譜系限制細(xì)胞以及保持它們的譜系限制細(xì)胞或也保持鋪板在支架上的成體細(xì)胞作為存活且完全功能細(xì)胞持續(xù)許多周(> 8周)的意義深遠(yuǎn)的能力上是獨(dú)特的。干細(xì)胞諸如胚胎干(ES)細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞或各種形式的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分化為完全成熟肝臟細(xì)胞類型需要存在于各階段的多組信號(hào)(可溶的和基質(zhì))，其具有引發(fā)對(duì)不同組的應(yīng)答所需的一組的誘導(dǎo)，并且可以需要數(shù)周、最長(zhǎng)達(dá)6周的培養(yǎng)，以產(chǎn)生具有成體肝臟命運(yùn)的細(xì)胞37。此外，將MSC譜系限制為肝臟命運(yùn)產(chǎn)生了與具有混合的肝細(xì)胞和MSC表型的成體細(xì)胞不一致的結(jié)果。ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞和MSC的分化導(dǎo)致了肝細(xì)胞樣細(xì)胞，其表達(dá)一些、但不是全部的主要肝臟特異性基因；具有其中觀察到基因的變化；并且對(duì)于表達(dá)的那些肝基因的蛋白水平對(duì)于一種肝基因通常較低41或者較高而對(duì)于其他則可以忽略41'42。通過(guò)對(duì)比，生物基質(zhì)支架上hHpSC的分化導(dǎo)致基本所有細(xì)胞表達(dá)典型的成體表型，以及其中尿素、白蛋白和CYP450活性在培養(yǎng)一周后處于接近正常的水平。來(lái)自任何這些前體細(xì)胞并且通過(guò)處生 物基質(zhì)支架以外的方案分化的肝細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)了一些但不是全部的主要肝臟特異性基因，具有其中觀察到基因的變化；并且對(duì)于肝基因的蛋白水平對(duì)于一種肝基因通常較低或較高，而對(duì)于其他肝基因則可以忽略。出于未知原因，該結(jié)果在制備與制備之間是不同的。期望的是，利用本發(fā)明的生物基質(zhì)支架應(yīng)該導(dǎo)致這些干細(xì)胞群體的更加快速分化，其在實(shí)現(xiàn)具有穩(wěn)定的成體表型的細(xì)胞中具有更大的
一致性。決定干細(xì)胞群體諸如hHpSC在生物基質(zhì)支架上的分化導(dǎo)致基本所有細(xì)胞表達(dá)基因的典型成體所有組成成分，以及其中尿素、白蛋白和CYP450活性在培養(yǎng)1-2周內(nèi)處于接近正常的水平，并且其中該表型的穩(wěn)定性持續(xù)數(shù)周。因此，本發(fā)明的生物基質(zhì)支架具有極大促進(jìn)決定干細(xì)胞群體分化為成體肝臟表型的潛能。在生物基質(zhì)支架上分化干細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)成熟和功能細(xì)胞和組織的能力為學(xué)術(shù)、產(chǎn)業(yè)和臨床項(xiàng)目提供了相當(dāng) 多的機(jī)會(huì)，其使得良好分化的細(xì)胞類型用于每種類型的分析研究，以及最令人激動(dòng)的是，其使得產(chǎn)生可用于基礎(chǔ)研究和臨床項(xiàng)目的可植入的、再血管化的組織或甚至器官。實(shí)施例1的參考文獻(xiàn)ULanza,R.等人.Handbook of Stem Cells,Vol.2 volumes.(Elsevier AcademicPress, New York City ；2004).
2λ Vacanti,J.P.&Langer,R.Tissue engineering:the design and fabricationof living replacement devices for surgical reconstruction and transplantation.Lancet 354Suppl 1，SI32-34 (1999).
3、*Schmelzer，E.等人 Human hepatic stem cells from fetal and postnataldonors.Journal of Experimental Medicine 204，1973-1987 [* 共同第一作者；** 共同主要作者](2007).
4、Zhang, L.，Theise, N.，Chua, M.&Reid，L.M.Human hepatic stem cellsand hepatoblasts:Symmetry between Liver Development and Liver Regeneration.Hepatology 48，1598-1607(2008).
5、Kubota，H.&Reid，L M.Clonogenic hepatoblasts，common precursors forhepatocytic and biliary lineages，are lacking classical major histocompatibilitycomplex class I antigens.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 97，12132-12137 (2000).
6、Wauthier，E.等人.Hepatic stem cells and hepatoblasts !identification，isolation and ex vivo maintenance Methods for Cell Biology (Methods for StemCells)86，137-225(2008).
7λ Rhodes, J.M.&Simons, M.The extracellular matrix and blood vesselformation:not just a scaffold.Journal of Cell and Molecular Medicine 11，176-205(2007).
8、Chen, S.S.，F(xiàn)itsgerald，W.，Zimmerberg，J.，Kleinman，Η.K.&Margolis，L Cell-cell and cell-extracellular matrix interactions regulation embryonicstem cell differentiation.Stem Cells 25，553-561 (2007).
9、Daley, W.P.，Peters，S.B.&Larsen，M.Extracellular matrix dynamics
權(quán)利要求
1.從生物組織產(chǎn)生生物基質(zhì)支架的方法，其包括以下步驟: a)用第一培養(yǎng)液灌注所述生物組織或使所述生物組織均質(zhì)化，其中所述第一培養(yǎng)液的重量摩爾滲透壓濃度是約250m0sm/kg至約350m0sm/kg,并且所述第一培養(yǎng)液是無(wú)血清的且處于中性pH;然后 b)在所述第一培養(yǎng)液中用包含脂肪酶和/或去污劑的脫脂緩沖液灌注步驟(a)的生物組織或提取步驟(a)的勻漿；然后 c)用處于中性pH且包含約2.0M NaCl至約5.0M NaCl的鹽濃度的緩沖液灌注步驟(b)的組織或提取步驟(b)的勻漿，選擇所述濃度以保持所述生物組織中鑒定的膠原不溶；然后 d)在緩沖液中用RNase和DNase灌注步驟(C)的組織或提取步驟(C)的勻漿；以及然后 e)用處于中性pH、無(wú)血清、且具有約250m0sm/kg至約350m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度的第二培養(yǎng)液沖洗步驟(d)的組織或勻漿， 進(jìn)而從所述生物組織產(chǎn)生完整的或均質(zhì)化的生物基質(zhì)支架，所述生物組織支架包含所述生物組織的至少95%的膠原和大部分膠原結(jié)合基質(zhì)成分以及基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞因子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一培養(yǎng)液包含鹽、礦物質(zhì)、氨基酸、維生素和糖。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一培養(yǎng)液是基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液選自由RPMI1640、DME/F12、DME、F12、Waymouth培養(yǎng)液以及William培養(yǎng)液組成的群組。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二培養(yǎng)液包含組織液中所存在組分的至少一種。
6.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)的所述脫脂緩沖液包含第一培養(yǎng)液中約20單位/L至約50單位/L的磷脂酶A2和約I %的脫氧膽酸鈉。
7.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)的所述緩沖液的鹽濃度在用于從成體肝臟制備支架時(shí)為約3.4M NaCl至約3.5M NaCl，以及在用于從胎兒肝臟制備支架時(shí)為約4.0M NaCl至約 4.5M NaCl。
8.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)的所述緩沖液還包含蛋白酶抑制劑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是大豆胰蛋白酶抑制劑。
10.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)的所述緩沖液還包含蛋白酶抑制劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是大豆胰蛋白酶抑制劑。
12.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)至(e)的所有培養(yǎng)液和緩沖液中沒有可檢測(cè)量的使細(xì)胞外基質(zhì)成分降解的酶。
13.權(quán)利要求1的方法，還包括對(duì)所述生物基質(zhì)支架消毒。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述消毒步驟包括所述生物基質(zhì)支架的伽馬輻射。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物組織選自由肝臟組織、肺臟組織、胰臟組織、甲狀腺組織、腸組織、皮膚組織、血管組織、膀胱組織、心臟組織和腎臟組織組成的群組。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物組織來(lái)自哺乳動(dòng)物。
17.通過(guò)權(quán)利要求 1-16中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的生物基質(zhì)支架。
18.生物基質(zhì)支架，其包含膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、內(nèi)功素/巢蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、或它們的任何組合，它們都是所述生物基質(zhì)支架的部分。
19.產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，其包括: a)根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架； b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸步驟(a)的所述生物基質(zhì)支架；以及 c)用細(xì)胞接種步驟(b)的所述生物基質(zhì)支架，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。
20.產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，其包括: a)根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架； b)冷凍步驟(a)的所述生物基質(zhì)支架； c)從步驟(b)的所述生物基質(zhì)支架制備冷凍切片作為細(xì)胞培養(yǎng)基； d)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸步驟(C)的所述細(xì)胞培養(yǎng)基；以及 e)用細(xì)胞接種步驟(d)的所述細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。
21.產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，其包括: a)根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架； b)將步驟(a)的所述生物基質(zhì)支架研磨為粉末； c)用步驟(b)的所述粉末包被至少部分培養(yǎng)裝置以產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)基； d)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(C)的所述細(xì)胞培養(yǎng)基；以及 e)用細(xì)胞接種(d)的所述細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述生物基質(zhì)支架的研磨在液氮溫度或液氮溫度附近在冷凍研磨機(jī)中進(jìn)行。
23.權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液包含組織液中所存在組分的至少一種，其中所述培養(yǎng)液的重量摩爾滲透壓濃度是約250m0sm/kg至約350m0sm/kg,以及其中所述培養(yǎng)液是無(wú)血清的。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述培養(yǎng)液是RPM1-1640。
25.權(quán)利要求19-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞與用于制備所述生物基質(zhì)支架的所述生物組織的細(xì)胞是相同類型的。
26.權(quán)利要求19-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞選自由以下細(xì)胞組成的群組:胚胎干(ES)細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞、決定干細(xì)胞、圍產(chǎn)期干細(xì)胞、羊水來(lái)源干細(xì)胞(AFSC)、來(lái)自任何來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、任何組織類型的定向祖細(xì)胞或成體細(xì)胞、成熟細(xì)胞、正常細(xì)胞、病態(tài)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及其任何組合。
27.權(quán)利要求19-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞選自由以下細(xì)胞組成的群組:肝臟細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞、星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、非膽管上皮細(xì)胞的膽系細(xì)胞以及胰臟細(xì)胞。
28.組織特異性生物基質(zhì)支架促進(jìn)胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能細(xì)胞向特定命運(yùn)分化的用途。
29.組織特異性生物基質(zhì)支架促進(jìn)羊水來(lái)源干細(xì)胞或來(lái)自骨髓、脂肪組織、或任何胎兒組織或出生后組織的間充質(zhì)干細(xì)胞或任何決定干細(xì)胞向特定成體命運(yùn)分化的用途。
30.通過(guò)權(quán)利要求19-27中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物。
31.增強(qiáng)并加速干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞的方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求19-27中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞，并且所述細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液針對(duì)成熟細(xì)胞配制，進(jìn)而增強(qiáng)并加速干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述細(xì)胞是任何類型的成體細(xì)胞或選自由以下細(xì)胞組成的群組的干細(xì)胞或祖細(xì)胞:胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、胚層干細(xì)胞、決定干細(xì)胞、圍產(chǎn)期干細(xì)胞、羊水來(lái)源干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、短暫擴(kuò)增細(xì)胞、或任何組織類型的定向祖細(xì)胞。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液選自由RPMI1640、DME/F12、DME、F12、Waymouth培養(yǎng)液以及William培養(yǎng)液組成的群組。
34.將細(xì)胞遞送至受試者的方法，其包括用細(xì)胞接種權(quán)利要求17或18中任一項(xiàng)的生物基質(zhì)支架，然后將所述用細(xì)胞接種的生物基質(zhì)支架移植進(jìn)所述受試者。
35.鑒定組織類型中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能的方法，其包括: a)根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架； b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的所述生物基質(zhì)支架； c)用腫瘤細(xì)胞接種(b)的所述生物基質(zhì)支架； d)在培養(yǎng)條件下維持(C)的所述生物基質(zhì)支架；以及 e)監(jiān)控(d)的所述生物基質(zhì)支架上所述腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)， 其中所述生物基質(zhì)支架上腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)鑒定所述腫瘤細(xì)胞可以在體內(nèi)在產(chǎn)生所述生物基質(zhì)支架的組織類型中形成集落，進(jìn)而鑒定所述腫瘤細(xì)胞在所述組織類型中的轉(zhuǎn)移潛倉(cāng)泛。
36.鑒定腫瘤細(xì)胞對(duì) 于抗腫瘤治療的響應(yīng)的方法，其包括: a)根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架； b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的所述生物基質(zhì)支架； c)用腫瘤細(xì)胞接種(b)的所述生物基質(zhì)支架； d)在培養(yǎng)條件下維持(C)的所述生物基質(zhì)支架； e)將所述抗腫瘤治療施加至所述生物基質(zhì)支架上的所述腫瘤細(xì)胞；以及 f)監(jiān)控(e)的所述生物基質(zhì)支架上所述腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)， 其中(e)的所述生物基質(zhì)支架上腫瘤細(xì)胞沒有生長(zhǎng)和/或腫瘤細(xì)胞的死亡則鑒定所述腫瘤細(xì)胞對(duì)于所述抗腫瘤治療的響應(yīng)。
37.產(chǎn)生用于移植到宿主動(dòng)物中的腫瘤移植物的方法，其包括: a)根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架； b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的所述生物基質(zhì)支架； c)用腫瘤細(xì)胞接種(b)的所述生物基質(zhì)支架； d)在培養(yǎng)條件下維持(C)的所述生物基質(zhì)支架；以及 e)在(d)的所述生物基質(zhì)支架上建立所述腫瘤細(xì)胞的群體， 進(jìn)而產(chǎn)生用于移植到宿主動(dòng)物中的腫瘤移植物。
38.權(quán)利要求37的方法，還包括將所述腫瘤移植物移植到所述宿主動(dòng)物中的步驟。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述腫瘤移植物對(duì)于所述宿主動(dòng)物是同源的、同種異型的、或異種的。
40.產(chǎn)生譜系依賴性病毒的病毒顆粒的方法，其包括: a)根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架；b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的所述生物基質(zhì)支架； c)用可以被所述譜系依賴性病毒感染的類型和譜系階段的細(xì)胞接種(b)的所述生物基質(zhì)支架； d)用所述譜系依賴性病毒感染(c)的所述細(xì)胞； e)在培養(yǎng)條件下維持所述生物基質(zhì)支架上的所述感染細(xì)胞；以及 f)收集所述感染細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒顆粒， 進(jìn)而產(chǎn)生所述譜系依賴性病毒的病毒顆粒。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述譜系依賴性病毒選自由丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、諾洛病毒和人乳頭瘤病毒組成的群組。
42.產(chǎn)生通過(guò)生物組織支架的再細(xì)胞化形成的類器官的方法，其包括: a)根據(jù)權(quán)利要求1-16中任 一項(xiàng)的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架； b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的所述生物基質(zhì)支架； c)用與用于制備所述生物基質(zhì)支架的所述生物組織相同組織類型的細(xì)胞接種(b)的所述生物基質(zhì)支架；以及 d)在培養(yǎng)條件下維持所述生物基質(zhì)支架上的細(xì)胞，由此由所述細(xì)胞形成類器官， 進(jìn)而產(chǎn)生通過(guò)所述生物組織支架的再細(xì)胞化形成的類器官。
43.權(quán)利要求42的方法，還包括用所述類器官與受試者接觸的步驟，用于作為輔助裝置。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述細(xì)胞是肝臟細(xì)胞。
45.在生物基質(zhì)支架上培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，其包括: a)根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生生物基質(zhì)支架； b)在培養(yǎng)裝置中用細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液接觸(a)的所述生物基質(zhì)支架； c)用產(chǎn)生所述目的蛋白的細(xì)胞接種(b)的所述生物基質(zhì)支架； d)在培養(yǎng)條件下在所述生物基質(zhì)支架上維持(c)的所述細(xì)胞；以及 e)收集由(d)的所述細(xì)胞產(chǎn)生的所述目的蛋白， 進(jìn)而在生物基質(zhì)支架上培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白。
46.權(quán)利要求45的方法，還包括純化步驟(e)中收集的所述目的蛋白的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了生物基質(zhì)支架以及其制備和使用方法，所述生物基質(zhì)支架是對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)成分和結(jié)合生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和激素富集的組織提取物。
文檔編號(hào)C12N5/02GK103249404SQ201180042689
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者Y·王, L·C·M·里德, M·亞莫基, C-B·崔, A·Z·王, M·E·維爾納 申請(qǐng)人:北卡羅來(lái)納-查佩爾山大學(xué)