專利名稱：含有其pKa值有利于RNA遞送的脂質(zhì)的脂質(zhì)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于免疫的RNA非病毒遞送領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
用于免疫動(dòng)物的核酸遞送已成為數(shù)年來的目標(biāo)。人們已經(jīng)測(cè)試了許多方法，包括使用DNA或RNA，使用病毒或非病毒遞送載劑(或者甚至無(wú)遞送載劑，以“裸”疫苗形式)，使用復(fù)制型或非復(fù)制型載體，或者使用病毒或非病毒載體。核酸疫苗仍需改進(jìn)和改良。

發(fā)明內(nèi)容
如本發(fā)明所述，以脂質(zhì)體遞送編碼免疫原的RNA用來免疫。所述脂質(zhì)體包含pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)。pKa在該范圍內(nèi)的脂質(zhì)理想上具有叔胺；此類脂質(zhì)和具有季胺基團(tuán)的脂質(zhì)(如DOTAP或DC-Chol)性質(zhì)不同。在生理pH下，pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的胺具有中性或減少的表面電荷，而脂質(zhì)如DOTAP則是強(qiáng)陽(yáng)離子脂質(zhì)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由季胺脂質(zhì)(如D0TAP)形成的脂質(zhì)體不如由叔胺脂質(zhì)(如DLinDMA)形成的脂質(zhì)體適合遞送編碼免疫原的RNA。因此，本發(fā)明提供具有包封水性核心的脂質(zhì)雙分子層的脂質(zhì)體，其中:(i)所述脂質(zhì)雙分子層包含PKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)，優(yōu)選所述脂質(zhì)具有叔胺；以及(ii)所述水性核心包括編碼免疫原的RNA。這些脂質(zhì)體適用于體內(nèi)遞送RNA至脊椎動(dòng)物細(xì)胞，從而它們可用作藥物組合物中的成分用來免疫對(duì)象抵抗各種疾病。本發(fā)明也提供了一種制備包含RNA的脂質(zhì)體的方法，所述方法包括以下步驟:(a)在低于脂質(zhì)的PKa但高于4.5的pH下，混合RNA和所述脂質(zhì)以形成包封所述RNA的脂質(zhì)體；以及(b)提高所得包含脂質(zhì)體的混合物的pH，使其高于所述脂質(zhì)的pKa。脂質(zhì)體本發(fā)明應(yīng)用其中包封有編碼免疫原的RNA的脂質(zhì)體。因而，使RNA (如天然病毒內(nèi)一樣)由脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層與任何外部介質(zhì)分隔，而且發(fā)現(xiàn)以該途徑進(jìn)行包封可保護(hù)RNA不被RNA酶消化。所述脂質(zhì)體可包括一些處在外部RNA(如在脂質(zhì)體的表面上)，但是至少一半的RNA(理想上為全部)被包封在所述脂質(zhì)體的核心中。脂質(zhì)體內(nèi)的包封不同于例如參考文獻(xiàn)I中公開的脂質(zhì)/RNA復(fù)合物。在水性環(huán)境中，各種兩親性脂質(zhì)能形成雙分子層以包封含RNA的水性核心，形成脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)可具有陰離子、陽(yáng)離子或兩性離子親水性頭部基團(tuán)。本發(fā)明的脂質(zhì)體包含pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)，并優(yōu)選pKa在該范圍內(nèi)的脂質(zhì)具有叔胺。例如，其可包含1，2~ 二亞油基氧基_N, N- 二甲基_3-氣基丙燒(DLinDMA ；pKa5.8)和/或1，2- 二亞麻基氧基_N, N-二甲基-3-氨基丙燒(DLenDMA)。另一種合適的具有叔胺的脂質(zhì)是1，2-二油烯基氧基-N，N 二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)。參見圖3和參考文獻(xiàn)2。也可使用參考文獻(xiàn)3中的某些氨基酸脂質(zhì)，也可使用參考文獻(xiàn)4的某些氨基脂質(zhì)。參考文獻(xiàn)5公開了在其頭部基團(tuán)內(nèi)具有叔胺的其它可用脂質(zhì)，其完整內(nèi)容通過引用納入本文中。本發(fā)明的脂質(zhì)體可由單一脂質(zhì)或脂質(zhì)混合物形成，條件是所述脂質(zhì)中的至少一種的pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)(并且優(yōu)選具有叔胺)。在該pKa范圍內(nèi)，優(yōu)選脂質(zhì)的pKa是5.5 6.7，例如在5.6和6.8之間，在5.6和6.3之間，在5.6和6.0之間，在5.5和6.2之間，或在5.7和5.9之間。所述pKa是50%的脂質(zhì)帶電時(shí)的pH，位于脂質(zhì)完全帶電的點(diǎn)和脂質(zhì)完全不帶電的點(diǎn)的中間?？梢杂酶鞣N方法測(cè)量所述pKa，但優(yōu)選使用下述在標(biāo)題為“pKa測(cè)量”部分中公開的方法測(cè)量。通常應(yīng)測(cè)量單一脂質(zhì)的pKa，而不是測(cè)量還包括其它脂質(zhì)的混合物中的脂質(zhì)的PKa (例如，不像參考文獻(xiàn)6中實(shí)施的那樣，該方法評(píng)判SNALP的pKa而不是單一脂質(zhì)的pKa)。當(dāng)本發(fā)明的脂質(zhì)體由脂質(zhì)混合物形成時(shí)，優(yōu)選pKa在所需范圍內(nèi)的那些脂質(zhì)的比例是脂質(zhì)總量的20 80%,例如，在30 70%之間，或在40 60%之間。舉例來說，在如下所示的可用脂質(zhì)體中，總 脂質(zhì)的40%或60%是pKa在所需范圍內(nèi)的脂質(zhì)。剩余部分可由例如膽固醇(例如35 50%膽固醇)和/或DMG (可選PEG化修飾的DMG)和/或DSPC構(gòu)成。此類混合物用于下文。這些％值是摩爾百分比。脂質(zhì)體可包含兩親性脂質(zhì)，其親水部分是被PEG化修飾的(即，通過與聚乙二醇共價(jià)連接來修飾的)。該修飾可增加所述脂質(zhì)體的穩(wěn)定性并防止所述脂質(zhì)體的非特異性吸附。舉例來說，使用諸如參考文獻(xiàn)6和7公開的那些技術(shù)來使脂質(zhì)結(jié)合PEG。PEG為脂質(zhì)體提供外層，所述外層可賦予有利的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。RNA (特別是自復(fù)制RNA)的有效包封、pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的陽(yáng)離子脂質(zhì)、以及PEG化修飾的表面，這三者的結(jié)合可實(shí)現(xiàn)對(duì)于多種細(xì)胞類型的有效遞送(包括免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞)，從而與使用未PEG化修飾的季胺相比，引起更強(qiáng)且更好的免疫應(yīng)答。可使用不同長(zhǎng)度的PEG，例如，在0.5 SkDa之間。用于本發(fā)明的脂質(zhì)可以是飽和的或不飽和的脂質(zhì)。優(yōu)選使用至少一種不飽和脂質(zhì)來制備脂質(zhì)體。圖3顯不二種可用的不飽和脂質(zhì)。若不飽和脂質(zhì)有兩條尾，則兩條尾都可以是不飽和尾，或者可以有一條飽和尾和一條不飽和尾。實(shí)例中使用DSPC、DLinDMA, PEG-DMG和膽固醇的混合物。本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立方面是含DSPC、DLinDMA、PEG-DMG和膽固醇的脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體優(yōu)選包封RNA，如自復(fù)制RNA，例如編碼免疫原的自復(fù)制RNA。脂質(zhì)體顆粒通常分為3組:多層囊泡(MLV);小單層囊泡(SUV);和大單層囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多個(gè)雙分子層，形成若干分離的水性隔室。SUV和LUV具有包封水性核心的單一雙分子層；通常SUV的直徑彡50nm，LUV的直徑>50nm。本發(fā)明的脂質(zhì)體顆粒理想上是直徑在50 220nm范圍內(nèi)的LUV。對(duì)于包含不同直徑LUV的群體的組合物:(i)在數(shù)量上至少80%應(yīng)具有20 220nm范圍內(nèi)的直徑，(ii)所述群體的平均直徑(Zav，由強(qiáng)度表示)理想上在40 200nm范圍內(nèi)，和/或(iii)所述直徑的多分散性指數(shù)應(yīng)〈0.2。希望參考文獻(xiàn)I的脂質(zhì)體/RNA復(fù)合物的直徑在600 800nm范圍內(nèi)，且具有高多分散性。所述脂質(zhì)體大體上可以是球形的。用于制備合適的脂質(zhì)體的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，例如參見參考文獻(xiàn)8 10。參考文獻(xiàn)11描述了一種可用的方法，該方法涉及混合α)脂質(zhì)的乙醇溶液(ii)核酸的水性溶液和(iii)緩沖液，然后進(jìn)行混合、平衡、稀釋和純化。優(yōu)選本發(fā)明的脂質(zhì)體可通過該混合工藝獲得?；旌瞎に嚾缟纤?，本發(fā)明提供用于制備包含RNA的脂質(zhì)體的工藝，所述工藝包括以下步驟:(a)在低于脂質(zhì)的pKa但高于4.5的pH下混合RNA和所述脂質(zhì)；然后(b)提高pH，使其聞?dòng)谒鲋|(zhì)的pKa。因此，陽(yáng)離子脂質(zhì)在步驟(a)的脂質(zhì)體形成過程中帶正電，但之后的pH變化意味著所述正電基團(tuán)的大多數(shù)(或全部)變?yōu)橹行?。該工藝有利于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體，并且通過在步驟(a)過程中避免pH低于4.5，提高了被包封RNA的穩(wěn)定性。步驟(a)中的pH高于4.5，理想上高于4.8。采用在5.0 6.0范圍內(nèi)，或在5.0 5.5范圍內(nèi)的pH，能夠提供合適的脂質(zhì)體。在步驟(b)中提高pH，使其高于所述脂質(zhì)的pKa。理想上提高所述pH至低于9，優(yōu)選低于8。取決于所述脂質(zhì)的pKa，步驟(b)中的所述pH由此可提高到6 8的范圍內(nèi)，例如提高至pH6.5±0.3?？赏ㄟ^將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到合適的緩沖液來實(shí)現(xiàn)步驟(b)的pH提高，例如，轉(zhuǎn)移到磷酸鹽緩沖鹽水中。理想上在脂質(zhì)體形成發(fā)生后實(shí)行步驟(b)的pH提高。步驟(a)中所用的RNA可在水性溶液中，用于與脂質(zhì)的有機(jī)溶液混合(例如，乙醇溶液，如參考文獻(xiàn)11所述)。然后可稀釋所述混合物來形成脂質(zhì)體，這之后可在步驟(b)中提聞pH。RNA本發(fā)明可用 于體內(nèi)遞送編碼免疫原的RNA。所述RNA由位于遞送部位的非免疫細(xì)胞翻譯，引起所述免疫原的表達(dá)，并且還會(huì)引起免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生局部佐劑效應(yīng)的促炎細(xì)胞因子和/或I型干擾素。非免疫細(xì)胞響應(yīng)所述RNA時(shí)也能分泌I型干擾素和/或促炎細(xì)胞因子。所述RNA是正鏈RNA，因此可被非免疫細(xì)胞翻譯，而不需要介入任何復(fù)制步驟(例如反轉(zhuǎn)錄)。所述RNA還能結(jié)合由免疫細(xì)胞表達(dá)的TLR7受體，從而引發(fā)佐劑效應(yīng)。優(yōu)選正鏈RNA是自復(fù)制RNA。自復(fù)制RNA分子(復(fù)制子)在被遞送到脊椎動(dòng)物細(xì)胞(甚至無(wú)任何蛋白質(zhì))時(shí)，能通過從其自身轉(zhuǎn)錄(通過從其自身產(chǎn)生自身的反義拷貝)引起多條子代RNA的產(chǎn)生。因此，自復(fù)制RNA分子通常是正鏈分子，其可在遞送到細(xì)胞后被直接翻譯，而該翻譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，之后，該RNA聚合酶從所述遞送的RNA生成反義和正義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因此，遞送的RNA引起多條子代RNA的產(chǎn)生。這些子代RNA和亞基因組共線性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都能翻譯其自身來提供所編碼免疫原的原位表達(dá)，或者可經(jīng)轉(zhuǎn)錄來提供與遞送的RNA同義的其它轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該同義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過翻譯來提供所述免疫原的原位表達(dá)。該順序轉(zhuǎn)錄的總體結(jié)果是所引入的復(fù)制子RNA在數(shù)量上的巨大擴(kuò)增，并且其編碼的免疫原成為所述細(xì)胞的主要多肽產(chǎn)物。如下所示，RNA不需具有自復(fù)制活性來提供佐劑效應(yīng)，即便這樣可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞因子分泌。所述自復(fù)制活性特別有利于非免疫細(xì)胞實(shí)現(xiàn)所述免疫原的高水平表達(dá)。而它也會(huì)促進(jìn)所述非免疫細(xì)胞的凋亡。實(shí)現(xiàn)自復(fù)制的一種合適的系統(tǒng)是使用基于α病毒的RNA復(fù)制子。這些正鏈復(fù)制子在遞送到細(xì)胞后經(jīng)翻譯以產(chǎn)生復(fù)制酶(或復(fù)制酶-轉(zhuǎn)錄酶)。所述復(fù)制酶作為多蛋白被翻譯，其自切割以提供復(fù)制復(fù)合物，所述復(fù)制復(fù)合物產(chǎn)生所述遞送的正鏈RNA的基因組負(fù)鏈拷貝。這些負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)錄其自身來進(jìn)一步產(chǎn)生所述正鏈親本RNA的拷貝，而且還產(chǎn)生編碼所述免疫原的亞基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因此，所述亞基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯使得所述受感染細(xì)胞原位表達(dá)所述免疫原。合適的α病毒復(fù)制子可以使用來自以下病毒的復(fù)制酶:辛德畢斯病毒(sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、東部馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒等。可使用突變或野生型病毒序列，例如，在復(fù)制子中已使用VEEV的減毒TC83突變體[12]。因此，優(yōu)選的自復(fù)制RNA分子編碼⑴可從所述自復(fù)制RNA分子轉(zhuǎn)錄RNA的RNA依賴性RNA聚合酶和(ii)免疫原。所述聚合酶可以是α病毒復(fù)制酶，例如包含一種或多種α病毒蛋白nsPl、nsP2、nsP3和nsP4的α病毒復(fù)制酶。盡管除了所述非結(jié)構(gòu)復(fù)制酶多蛋白，天然α病毒基因組還編碼結(jié)構(gòu)病毒體蛋白，但優(yōu)選本發(fā)明的自復(fù)制RNA分子不編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此，優(yōu)選自復(fù)制RNA可在細(xì)胞中導(dǎo)致產(chǎn)生其本身的基因組RNA拷貝，但不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生含有RNA的病毒體。無(wú)法產(chǎn)生這些病毒體是指不像野生型α病毒，所述自復(fù)制RNA分子自身不能以感染形式永存。本發(fā)明的自復(fù)制RNA缺失野生型病毒永存所必需的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并且由編碼所需免疫原的基因代替了它們的位置，因此，所述亞基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼所述免疫原，而不是編碼所述α病毒病毒體結(jié)構(gòu)蛋白。因此，本發(fā)明所用的自復(fù)制RNA分子可具有兩個(gè)開放閱讀框。第一個(gè)(5’)開放閱讀框編碼復(fù)制酶；第二個(gè)(3’)開放閱讀框編碼免疫原。在一些實(shí)施方式中，所述RNA可具有額外的(例如下游)開放閱讀框，比如用來編碼其它免疫原(參見下文)或者編碼輔助多肽。

自復(fù)制RNA分子可具有與所述編碼的復(fù)制酶相容的5’序列。自復(fù)制RNA分子可具有不同長(zhǎng)度，但其長(zhǎng)度通常是5000 25000個(gè)核苷酸，例如8000 15000個(gè)核苷酸，或者9000 12000個(gè)核苷酸。因此，所述RNA比siRNA遞送中所見的長(zhǎng)。本發(fā)明所用的RNA可具有5’帽子(例如，7-甲基鳥苷)。該帽子結(jié)構(gòu)能增強(qiáng)RNA的體內(nèi)翻譯。本發(fā)明所用的RNA分子的5’核苷酸可具有5’三磷酸基團(tuán)。在有帽RNA中，其可通過5’-5’橋與7-甲基鳥苷連接。5’三磷酸能增強(qiáng)RIG-1的結(jié)合，從而增強(qiáng)佐劑效應(yīng)。RNA分子可具有3’多聚腺苷尾。該RNA分子還可在靠近其3’端處包含多腺苷聚合酶識(shí)別序列(例如AAUAAA)。本發(fā)明所用的RNA分子通常是單鏈的。單鏈RNA通常能通過與TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR結(jié)合而引發(fā)佐劑效應(yīng)。以雙鏈形式遞送的RNA(dsRNA)能結(jié)合TLR3，而且該受體還能被dsRNA觸發(fā)，該dsRNA在單鏈RNA復(fù)制過程中或在單鏈RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中形成。本發(fā)明所用的RNA分子能通過體外轉(zhuǎn)錄(IVT)方便地制備。IVT可使用(cDNA)模板生成，并在細(xì)菌內(nèi)以質(zhì)粒形式增殖，或通過合成生成(例如通過基因合成和/或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)工程化方法)。例如，DNA依賴性RNA聚合酶(例如噬菌體T7、T3或SP6RNA聚合酶)可用于從DNA模板轉(zhuǎn)錄RNA。可按需求使用合適的加帽和加多聚腺苷反應(yīng)(盡管復(fù)制子的多聚腺苷通常在DNA模板內(nèi)編碼)。這些RNA聚合酶對(duì)轉(zhuǎn)錄的5’核苷酸有著嚴(yán)格的要求，在某些實(shí)施方式中，這些要求須與所編碼復(fù)制子的要求相符，以確保IVT轉(zhuǎn)錄的RNA作為其自編碼復(fù)制酶的底物能有效地發(fā)揮功能。 如參考文獻(xiàn)13中討論的，自復(fù)制RNA可包括(除任何5’帽子結(jié)構(gòu)之外)一個(gè)或多個(gè)具有修飾核堿基的核苷酸。因此，所述RNA可包括m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5_甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫代尿苷)、Um(2’-0-甲基尿苷)、mlA(l_甲基腺苷)、m2A(2-甲基腺苷)、Am(2’-O-甲基腺苷)、ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)、i6A(N6-異戊烯基腺苷)、ms2i6A(2-甲硫基-N6異戊烯基腺苷)、io6A (N6-(順羥異戊烯基)腺苷)、ms2io6A(2-甲硫基_N6_(順羥異戊烯基)腺苷)、g6A(N6-甘氨?；奔柞；佘?、t6A (N6-蘇氨?；奔柞；佘?、ms2t6A (2-甲硫基-N6-蘇氨酰基氨甲?；佘?、m6t6A (N6-甲基-N6-蘇氨?；奔柞；佘?、hn6A (N6-羥基正纈氨?；奔柞；佘?、ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羥基正纈氨?；奔柞；佘?、Ar (p) (2’ -O-核糖基腺苷(磷酸))、I (次黃嘌呤核苷)、mil (1-甲基次黃嘌呤核苷)、m’ Im(l, 2’ _0_ 二甲基次黃嘌呤核苷)、m3C(3-甲基胞苷)、Cm(2T-0-甲基胞苷)、s2C(2_硫代胞苷)、ac4C(N4_乙?；?、f5C(5_ 甲酸基胞苷，5-fonnylcytidine)、m5Cm(5, 2-0- 二甲基胞苷)、ac4Cm(N4 乙?；?T0甲基胞苷)、k2C(賴胞苷)、mlGd-甲基鳥苷)、m2G(N2-甲基鳥苷)、m7G(7-甲基鳥苷)、Gm(2’-0-甲基鳥苷)、m22G(N2，N2-二甲基鳥苷)、m2Gm(N2, 2’-O-二甲基鳥苷)、m22Gm(N2, N2, 2’ -O-三甲基鳥苷)、Gr (p) (2’ -O-核糖基鳥苷(磷酸))、yW(懷丁苷)、o2yff(過氧化懷丁苷)、OHyW(羥基懷丁苷)、OHyW*(欠修飾的羥基懷丁苷)、imG(丫苷)、mimG(甲基鳥苷)、Q (queuosine,辮苷)、oQ (環(huán)氧辮苷)、galQ(半乳糖-辮苷)、manQ (甘露糖-辮苷)>preQo (7-氰基-7-去氮鳥苷)、preQi (7-氨甲基-7-去氮鳥苷)、G (古嘌苷)、D (二氫尿苷)、m5Um(5，2’ _0_ 二甲基尿苷)、s4U(4_硫代尿苷)、m5s2U(5-甲基_2_硫代尿苷)、s2Um (2-硫代-2 ’ -O-甲基尿苷)、acp3U (3- (3-氨基_3_羧丙基)尿苷)、ho5U (5-羥基尿苷)、mo5U (5-甲氧基尿苷)、cmo5U (尿苷5-輕乙酸)、mcmo5U (尿苷5-輕乙酸甲基酯)、chm5U (5-(羧輕甲基)尿苷))、mchm5U (5-(羧輕甲基)尿苷甲基酯)、mcm5U (5-甲氧羰基甲基尿苷)、mcm5Um (S-甲氧基羰甲基-2-0-甲基尿苷)、mcm5s2U (5-甲氧基羰甲基_2_硫代尿苷)、nm5s2U (5-氨甲基-2-硫代尿苷)、mnm5U (5-甲基氨甲基尿苷)、mnm5s2U (5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷)、mnm5se2U (5-甲基氨甲基_2_硒尿苷)、ncm5U (5-氨基甲酰甲基尿苷)、ncm5Um(5-氨基甲酰甲基_2’ -O-甲基尿苷)、cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)、cnmm5Um(5-羧甲基氨甲基-2-L-0甲基尿苷)、cmnm5s2U(5-羧甲基氨甲基_2_硫代尿苷)、m62A(N6，N6-二甲基腺苷)、Tm(2’-0-甲基次黃嘌呤核苷)、m4C(N4-甲基胞苷)、m4Cm (N4, 2-0- 二甲基胞苷)、hm5C (5-羥甲基胞苷)、m3U (3-甲基尿苷)、cm5U (5-羧甲基尿苷)、m6Am(N6, T-O- 二甲基腺苷)、rn62Am(N6, N6, 0_2_ 三甲基腺苷)、m2，7G (N2, 7- 二甲基鳥苷)、m2’ 2’ 7G(N2, N2, 7-三甲基鳥苷)、m3Um(3，2T-0- 二甲基尿苷),m5D(5-甲基二氫尿苷)、f5Cm(5-甲?；?2’ -O-甲基胞苷)、mlGm(l, 2’ -O-二甲基鳥苷)、m’Am(l, 2_0_ 二甲基腺苷)益立諾甲基尿苷(irinomethyluridine))、tm5s2U(S-氨基乙磺?；谆?2-硫代尿苷))、imG-14(4-去甲基鳥苷)、imG2(異鳥苷)、或ac6A(N6-乙酰基腺苷)、次黃嘌呤、次黃嘌呤核苷、8-氧代-腺嘌呤，及其7-取代衍生物、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5- (C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5- (C2-C6)-烯基尿嘧啶、5- (C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羥甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5- (C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5- (C2-C6)-烯基胞嘧啶、5- (C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2- 二甲基鳥嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、7-去氮-7-取代鳥嘌呤、7-去氮-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤、7-去氮-8-取代鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、8-氧代鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、8-氮雜嘌呤、取代的7-去氮嘌呤、7-去氮-7-取代嘌呤、7-去氮-8-取代嘌呤、或者脫堿基核苷酸。例如，自復(fù)制RNA可包含一個(gè)或多個(gè)修飾的嘧啶核堿基，比如假尿苷和/或5-甲基胞嘧啶殘基。然而，在一些實(shí)施方式中，RNA不包含修飾的核堿基，并且可以不包含修飾的核苷酸，即，RNA中的所有核苷酸都是標(biāo)準(zhǔn)的A、C、G和U核糖核苷酸(除可含有7'甲基鳥苷的任何5’帽子結(jié)構(gòu)外)。在其它實(shí)施方式中，RNA可包含含有7’ -甲基鳥苷的5’帽子，且最前的1、2或3個(gè)5’端核糖核苷酸可在核糖的2’位點(diǎn)被甲基化。本發(fā)明所用的RNA理想上在核苷之間僅包含磷酸二酯鍵，但在某些實(shí)施方式中，其可包含氨基磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵和/或甲基磷酸酯鍵。理想上，脂質(zhì)體包含少于10個(gè)不同的RNA種類，例如5、4、3或2個(gè)不同種類；最優(yōu)選脂質(zhì)體包含單個(gè)RNA·種類，即，脂質(zhì)體中的所有RNA分子具有相同的序列和相同的長(zhǎng)度。每個(gè)脂質(zhì)體的RNA含量可以不同。每個(gè)脂質(zhì)體的自復(fù)制RNA分子個(gè)體的數(shù)量通常(50個(gè)，例如每個(gè)脂質(zhì)體〈20個(gè)、〈10個(gè)、〈5個(gè)或者I 4個(gè)。免疫原本發(fā)明所用的RNA分子編碼多肽免疫原。在脂質(zhì)體給藥后，所述RNA在體內(nèi)翻譯，所述免疫原可在受者內(nèi)引起免疫應(yīng)答。所述免疫原可引起免疫應(yīng)答來對(duì)抗細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(或者，在一些實(shí)施方式中，對(duì)抗過敏原；在其它實(shí)施方式中，對(duì)抗腫瘤抗原)。所述免疫應(yīng)答可包括抗體應(yīng)答(通常包含IgG)和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。所述多肽免疫原通常會(huì)引起識(shí)別對(duì)應(yīng)細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(或過敏原或腫瘤)多肽的免疫應(yīng)答，但在一些實(shí)施方式中，所述多肽可作為模擬表位(mimotope)來引起識(shí)別細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲糖類的免疫應(yīng)答。所述免疫原通常會(huì)是表面多肽，例如:粘附素、血細(xì)胞凝集素、包膜糖蛋白、刺突糖蛋白等。自復(fù)制RNA分子能編碼單一多肽免疫原或多種多肽。多種免疫原可以單一的多肽免疫原(融合多肽)或以分開的多種多肽形式存在。若表達(dá)的免疫原是分開的多種多肽，則這些多肽中的一個(gè)或多個(gè)可與上游IRES或其它病毒啟動(dòng)子元件一起提供?；蛘撸喾N免疫原可由多蛋白表達(dá)，所述多蛋白編碼融合于短自催化蛋白酶(例如足口病病毒2A蛋白)的單一免疫原或作為內(nèi)含肽。與參考文獻(xiàn)I和14不同,所述RNA編碼免疫原。為避免疑慮,本發(fā)明不包含編碼螢火蟲熒光素酶的RNA或編碼大腸桿菌(E.coli) β-半乳糖苷酶融合蛋白的RNA或者編碼綠色熒光蛋白(GFP)的RNA。并且，所述RNA不是小鼠胸腺總RNA。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗以下這些細(xì)菌中的一種:腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis):可用免疫原包括但不限于,膜蛋白如粘附素、自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、毒素、獲鐵蛋白和因子H結(jié)合蛋白。參考文獻(xiàn)15中公開了三種可用多肽的組合。
肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae):參考文獻(xiàn)16中公開了可用的多肽免疫原。這些多肽免疫原包括但不限于RrgB菌毛亞基、β-N-乙?；?己糖胺酶前體(spr0057)、spr0096、全身應(yīng)激蛋白GSP-781 (spr2021，SP2216)、絲氨酸/蘇氨酸激酶StkP(SP1732)和肺炎球菌表面粘附素PsaA。產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes):可用免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)17和18中公開的多肽。粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is) 百日咳博德特菌(Bordetella pertussis):可用的百日咳免疫原包括但不限于百日咳毒素或類毒素(PT)、絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)、百日咳桿菌粘附素、凝集原2和3。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):可用的免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)19中公開的多肽，例如溶血素、esxA、esxB、鐵色素結(jié)合蛋白(sta006)和/或staOll脂蛋白。破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani):典型的免疫原是破傷風(fēng)類毒素。白喉?xiàng)U菌(Cornynebacterium diphtheriae):典型的免疫原是白喉類毒素。流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae):可用免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)20和21中公開的多肽。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)無(wú)乳鏈球 菌(Streptococcus agalactiae):可用免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)17中公開的多肽。沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis):可用免疫原包括但不限于PepA、LcrE、ArtJ、DnaK, CT398、OmpH 樣蛋白(OmpH-1ike)、L7/L12、OmcA, AtoS、CT547、Eno, HtrA 和MurG(例如，如參考文獻(xiàn)22中公開的多肽)。LcrE[23]和HtrA[24]是兩種優(yōu)選的免疫原。肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae):可用的免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)25中公開的多肽。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori):可用的免疫原包括但不限于CagA、VacA、NAP、和/或尿素酶[26]。大腸桿菌(Escherichia coli):可用的免疫原包括但不限于源自以下大腸桿菌的免疫原:腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸聚集性大腸桿菌(EAggEC)、彌散粘附性大腸桿菌(DAEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)和/或腸出血性大腸桿菌(EHEC)。ExPEC菌株包括尿致病性大腸桿菌(UPEC)和腦膜炎/膿毒癥相關(guān)的大腸桿菌(MNEC)。參考文獻(xiàn)27和28公開了可用的UPEC多肽免疫原。參考文獻(xiàn)29中公開了所用的MNEC免疫原。一種可用于若干大腸桿菌類型的免疫原是AcfD [30].
炭疽桿菌(Bacillusanthracis)鼠疫桿菌(Yersinia pestis):可用的免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)31和32中公開的那些免疫原。表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermis):產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)或肉毒桿菌(Clostridiumbotulinums)嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)
貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetti)布魯氏菌(Brucella)，例如，牛型布魯氏菌(B.abortus)、犬型布魯氏菌(B.canis)、羊型布魯氏菌(B.melitensis)、沙林鼠型布魯氏菌(B.neotomae)、綿羊型布魯氏菌(B.0vis)、豬型布魯氏菌(B.suis)、鰭腳類布魯氏菌(B.pinnipediae).
弗朗西斯氏菌(Francisella)，例如新殺手弗朗西斯氏菌(F.novicida)、蜃樓弗朗西斯氏菌(F.philomiragia)、土拉熱弗朗西斯氏菌(F.tularensis)。淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)梅毒螺旋菌(Treponemapallidum)杜克氏嗜血桿菌(Haemophilus ducreyi)類腸球菌(Enterococcusfaecalis)或屎腸球菌(Enterococcus faecium)腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)
小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)立克次體(Rickettsia)單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)霍亂弧菌(Vibriocholerae)傷寒沙門菌(Salmonellatyphi)包柔氏螺旋體菌(Borreliaburgdorferi)牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)克雷伯氏菌(Klebsiella)在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗以下這些病毒中的一種:正粘病毒(Orthomyxovirus):可用免疫原可來自甲型、乙型或丙型流感病毒，例如血細(xì)胞凝集素、神經(jīng)氨酸苷酶或基質(zhì)M2蛋白。當(dāng)所述免疫原是甲型流感病毒血細(xì)胞凝集素時(shí)，其可來自任何亞型，例如111、!12、!13、!14、!15、!16、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、!114、H15 或 H16。副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒:病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:肺炎病毒(例如，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腮腺炎病毒屬(例如，腮腺炎病毒)、副粘病毒(例如，副流感病毒)、肺炎后病毒和麻疹病毒(例如，麻疹)。痘病毒(Poxviridae):病毒免疫原包括但不限于衍生自正痘病毒(Orthopoxvirus)如天花(Variola vera)的免疫原，包括但不限于重型天花(Variolamajor)和輕型天花(Variola minor)。小核糖核酸病毒(Picornavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:小核糖核酸病毒，如腸道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心臟病毒和口蹄疫病毒的那些免疫原。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述腸道病毒是脊髓灰質(zhì)炎病毒，例如I型、2型和/或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述腸道病毒是EV71腸道病毒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述腸道病毒是A型或B型柯薩奇(coxsackie)病毒。布尼亞病毒(Bunyavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:正布尼亞病毒(Orthobunyavirus)如加利福尼亞腦炎病毒、白蛉病毒(Phlebovirus)如裂谷熱病毒或內(nèi)羅病毒(Nairovirus)如克里米亞-剛果出血熱病毒。嗜肝RNA病毒(Heparnavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝RNA病毒如甲型肝炎病毒(HAV)的免疫原。線狀病毒(Filovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:線狀病毒，例如埃博拉病毒屬(Ebola virus)(包括扎伊爾(Zaire)埃博拉病毒、象牙海岸(Ivory Coast)埃博拉病毒、雷斯頓(Reston)或蘇丹(Sudan)埃博拉病毒)或者馬爾堡病毒(Marburg virus)。披膜病毒(Togavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:披膜病毒(Togavirus),如風(fēng)疫病毒(Rubivirus)、α病毒(Alphavirus)或動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)。該病毒包括風(fēng)疫病毒(rubella virus)。黃病毒(Flavivirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:黃病毒，如蜱傳腦炎(TBE)病毒、登革熱(1、2、3或4型)病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、開薩諾森林病毒、西尼羅河腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、俄國(guó)春夏腦炎病毒、波瓦生腦炎病毒。瘟病毒(Pestivirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自瘟病毒，如牛病毒性腹瀉(BVDV)、經(jīng)典豬瘟(CSFV)或邊界病(BDV)的那些免疫原。嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝DNA病毒如乙型肝炎病毒的那些免疫原。組合物可包括乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。其它肝炎病毒:組合物可包括衍生自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的免疫原。桿狀病毒(R habdovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自桿狀病毒如狂犬病病毒屬(例如狂犬病毒)和水泡病毒(VSV)的那些免疫原。杯狀病毒(Caliciviridae):病毒免疫原包括但不限于衍生自杯狀病毒,如諾沃克病毒(Norwalk virus)(諾如病毒(Norovirus))和諾沃克樣病毒，如夏威夷病毒(HawaiiVirus)和雪山病毒(Snow Mountain Virus)的那些免疫原。冠狀病毒(Coronavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自SARS冠狀病毒、禽傳染性支氣管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)的那些免疫原。所述冠狀病毒免疫原可以是刺突多肽。逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自腫瘤病毒(Oncovirus)、慢病毒(Lentivirus)(例如 HIV-1 或 HIV-2)或者泡沫病毒(Spumavirus)的那些免疫原。呼腸病毒(Reovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)、輪狀病毒(rotavirus)、環(huán)狀病毒(Orbivirus)、或科羅拉多壁風(fēng)熱病毒(Coltivirus)的那些免疫原。細(xì)小病毒(Parvovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自細(xì)小病毒B19的那些免疫原。皰疫病毒(Herpesvirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:人皰疹病毒，如(僅為示例)單純皰疹病毒(HSV)(例如HSVl型和2型)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、艾伯斯坦-巴爾病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、人皰疹病毒6 (HHV6)、人皰疹病毒7 (HHV7)和人皰疹病毒8 (HHV8)。乳頭狀多瘤空泡病毒(Papovaviruses):病毒免疫原包括但不限于衍生自乳頭狀瘤病毒(Papillomaviruses)和多瘤病毒(Polyomaviruses)的那些免疫原。人乳頭狀瘤病毒可以是血清型 1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63 或 65，例如來自血清型6、11、16和/或18中的一種或多種。腺病毒(Adenovirus):病毒免疫原包括衍生自腺病毒血清型36 (Ad_36)的那些免疫原。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗感染魚的病毒，例如:傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、鮭魚胰腺病病毒(SPDV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、水道貓魚病毒(CCV)、魚類淋巴囊腫病病毒(FLDV)、傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)、錦鯉皰疹病毒、鮭魚小核糖核酸樣病毒(也稱作大西洋鮭魚的小核糖核酸樣病毒)、陸封鮭病毒(landlocked salmon virus，LSV)、大西洋娃魚輪狀病毒(ASR)、蹲魚草毒病病毒(TSD)、銀鮭魚腫瘤病毒(CSTV)或病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)。真菌免疫原可衍生自皮膚真菌(Dermatophytres)，包括:絮狀表皮癬菌(Epidermophyton f 1ccusum)、奧杜安氏小抱子菌(Microsporum audouini)、犬小抱子菌(Microsporum canis)、扭曲小抱子菌(Microsporum distortum)、馬類小抱子菌(Microsporum equinum)、石膏樣小抱子菌(Microsporum gypsum)、矮小小抱子菌(Microsporum nan um)、同心性毛癬菌(Trichophyton concentricum)、馬發(fā)癬菌(Trichophyton equinum)、雞毛癬菌(Trichophyton gallinae)、石膏狀毛癬菌(Trichophyton gypseum)、麥格氏毛癬菌(Trichophyton megnini)、須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、昆克努發(fā)癬菌(Trichophyton quinckeanum)、紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、許蘭毛癬菌(Trichophyton schoenleini)、斷發(fā)毛癬菌(Trichophyton tonsurans)、撫狀毛癬菌(Trichophyton verrucosum)、撫狀毛癬菌的白變種(var.album)、盤狀變種(var.discoides)、赫色變種(var.0chraceum)、紫色毛癬菌(Trichophyton violaceum)和 / 或蜜塊狀發(fā)癬菌(Trichophyton faviforme);或者衍生自煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黃曲霉(Aspergillus flavatus)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、頭狀芽裂殖菌(Blastoschizomyces capitatus)、白假絲酵母(Candidaalbicans)、烯醇酶假絲酵母(Candida enolase)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、光滑假絲酵母(Candida glabrata)、克魯斯假絲酵母(Candida krusei)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)、類星形假絲酵母(Candida stellatoidea)、克魯斯假絲酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假絲酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假絲酵母(Candidalusitaniae)、偽熱帶假絲酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假絲酵母(Candidaguilliermondi)、卡氏枝抱霉(Cladosporium carrionii)、粗球抱子菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)、棒地霉(Geotrichum cIavatum)Λ 莢膜組織胞衆(zhòng)菌(Histoplasmacapsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、微抱子蟲(Microsporidia)、腦炎微孢子蟲屬(Encephalitozoon spp)、表層角結(jié)膜炎微孢子蟲(Septata intestinalis)和腸微孢子蟲(Enterocytozoon bieneusi);較不常見的是:短粒蟲屬(Brachiola spp.)、微抱子蟲屬(Microsporidium spp.)、抱子蟲屬(Nosema spp.)、皮里蟲屬(Pleistophoraspp)、氣管普抱蟲屬(Trachipleistophora spp.)、條抱蟲屬(Vittaforma spp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏月市抱子蟲(Pneumocystis carinii)、苜猜腐酶(Pythiumn insidiosum)、卵狀糖疫癬菌(Pityrosporum ovale)、釀酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、尖端賽多抱子菌(Scedosporium apiosperum)、申克抱子絲菌(Sporothrix schenckii)、白吉利絲孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形蟲(Toxoplasma gondii)、馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、馬拉色菌(Malassezia spp.)、著色真菌屬(Fonsecaea spp.)、王氏霉菌屬(Wangiella spp.)、孢子絲菌屬(Sporothrix spp.)、娃糞霉屬(Basidiobolusspp.)、耳霉屬(Conidiobolus spp.)、根霉屬(Rhizopus spp.)、毛霉屬(Mucor spp.)、犁頭霉屬(Absidia spp.)、被抱霉屬(Mortierella spp.)、小克銀漢霉屬(Cunninghamellaspp.)、瓶霉屬(Saksenaea spp.)、鏈格抱菌屬(Alternaria spp.)、彎抱菌屬(Curvulariaspp.)、長(zhǎng)螺孢菌屬(Helminthosporium spp.)、鐮胞菌屬(Fusarium spp.)、曲霉屬(Aspergillus spp.)、青霉屬(Penicillium spp.)、鏈核霉菌屬(Monolinia spp.)、絲核菌屬(Rhizoctonia spp.)、擬青霉屬(Paecilomyces spp.)、皮司霉屬(Pithomyces spp.)和枝抱霉屬(Cladosporium spp.)。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗來自瘧原蟲(Plasmodium)屬的寄生蟲，例如惡性癥原蟲(P.falciparum)、間日癥原蟲(P.vivax)、三日癥原蟲(P.malariae)或卵形瘧原蟲(P.0vale)。因此，本發(fā)明可用于免疫對(duì)抗瘧疾。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗源自魚虱科(Caligidae)家族的寄生蟲，尤其是那些源自瘡痂魚虱屬(Lepeophtheiiois)和魚虱屬(Caligus)例如海虱如鮭瘡痂魚虱(Lepeophtheirus salmonis)或智利魚風(fēng)(Caligus rogercresseyi)的寄生蟲。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗以下過敏原:花粉過敏原(樹、草本和青草花粉過敏原)、昆蟲或蜘蛛類動(dòng)物過敏原(吸入式、唾液和毒液過敏原，例如螨蟲過敏原、蟑螂和蠓過敏原、膜翅類毒液過敏原)、動(dòng)物毛發(fā)和皮屑過敏原(來自例如狗、貓、馬、大鼠、小鼠等)；以及食物過敏原(例如麥醇溶蛋白)。來自樹、青草和草本植物的重要花粉過敏原，例如源于分類學(xué)的以下目:殼斗目(Fagales)、木樨目(Oleales)Iiv桕目(Pinales)以及懸鈴木科(platanaceae)，包括但不限于樺木(樺屬(Betula))、赤楊(棺木屬(Alnus))、榛木(榛屬(Corylus))、鵝耳櫪木(鵝耳櫪屬(Carpinus))和橄欖(齊墩果屬(Olea))、雪松(柳杉屬(Cryptomeria)和檜屬(Juniperus))、懸鈴木(懸鈴木屬(Platanus))，禾本目包括以下屬的青草:黑麥草屬(Lolium)、貓尾草屬(Phleum)、早熟禾(Poa)、狗牙根屬(Cynodon)、鴨茅屬(Dactylis)、域毛草屬(Holcus)、藹草屬(Phalaris)、黑麥屬(Secale)和蜀黍?qū)?Sorghum)，菊目(Asterales)和蕁麻目(Urticales)包括以下屬的非禾本草本植物:豚草屬(Ambrosia)、艾屬(Artemisia)和墻草屬(Parietaria)。其它重要的吸入式過敏原是來自以下這些過敏原:表皮螨屬(Dermatophagoides)和嗜霉螨屬(Euroglyphus)的屋塵螨、儲(chǔ)糧塵螨例如害嗜鱗螨(Lepidoglyphus)、食甜螨屬(Glycyphagus)和食酪螨屬(Tyrophagus)，來自蟑螂、蠓和跳蚤例如小蠊屬(Blatella)、大爐屬(Periplaneta)、搖蚊屬(Chironomus)和柿頭圣屬(Ctenocephalides)，來自哺乳動(dòng)物比如貓、狗和馬，毒液過敏原包括例如源自螫或咬型的昆蟲，比如來自分類學(xué)的膜翅目的那些昆蟲，包括蜜蜂(蜜蜂科，Apidae)、黃蜂(胡蜂科，Vespidea)和螞蟻(蟻科，F(xiàn)ormicidae)。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原是腫瘤抗原，選自:(a)癌癥-睪丸抗原，如NY-ESO-1、SSX2、SCPl 以及 RAGE、BAGE、GAGE 和 MAGE 家族多肽，如 GAGE-1、GAGE_2、MAGE_1、MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12 (例如，可用于針對(duì)黑色素瘤、肺腫瘤、頭頸部腫瘤、NSCLC瘤、乳腺腫瘤、胃腸道腫瘤和膀胱腫瘤)；(b)突變的抗原，例如p53(與各種實(shí)體瘤如結(jié)直腸癌、肺癌、頭頸部癌有關(guān))、p21/Ras (與例如黑色素瘤、胰腺癌和結(jié)直腸癌有關(guān))、CDK4 (與例如黑色素瘤有關(guān))、MUM1 (與例如黑色素瘤有關(guān))、半胱天冬酶-8 (與例如頭頸部癌有關(guān))、CIA0205(與例如膀胱癌有關(guān))、HLA-A2-R1701、β聯(lián)蛋白(與例如黑色素瘤有關(guān))、TCR(與例如T-細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤有關(guān))、BCR-abl (與例如慢性髓細(xì)胞性白血病有關(guān))、磷酸丙糖異構(gòu)酶、KIA0205、⑶C-27和LDLR-FUT ； (c)過表達(dá)的抗原，例如半乳糖凝集素4 (與例如結(jié)直腸癌有關(guān))、半乳糖凝集素9 (與例如霍奇金病有關(guān))、蛋白酶3 (與例如慢性髓細(xì)胞性白血病有關(guān))、WT1 (與例如各種白血病有關(guān))、碳酸酐酶(與例如腎癌有關(guān))、醛縮酶A (與例如肺癌有關(guān))、PRAME (與例如黑色素瘤有關(guān))、HER-2/neu (與例如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和卵巢癌有關(guān))、乳腺球蛋白、甲胎蛋白(與例如肝細(xì)胞癌有關(guān))、KSA(與例如結(jié)直腸癌有關(guān))、胃泌素(與例如胰腺癌和胃癌有關(guān))、端粒酶催化蛋白、MUC-1 (與例如乳腺癌和卵巢癌有關(guān))、G-250 (與例如腎細(xì)胞癌有關(guān))、p53 (與例如乳腺癌和結(jié)腸癌有關(guān))和癌胚抗原(與例如乳腺癌、肺癌和胃腸道癌如結(jié)直腸癌有關(guān))；(d)共有的抗原，例如黑色素瘤-黑素細(xì)胞分化抗原如MART-l/Melan A、gplOO、MClR、黑素細(xì)胞-刺激激素受體、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相關(guān)蛋白_2/TRP2(與例如黑色素瘤有關(guān))；(e)前列腺相關(guān)抗原，如PAP、PSA、PSMA, PSH-PU PSM-PU PSM-P2,與例如前列腺癌有關(guān)；(f)免疫球蛋白獨(dú)特型(與例如骨髓瘤和B細(xì)胞淋巴瘤有關(guān))。在某些實(shí)施方式中，腫瘤抗原包括但不限于巾15、!10111/]1-40、!1-1^8 424- 虬、!14-1 1\16!1-161(、]^1^-狀1 、艾伯斯坦-巴爾病毒抗原、EBNA、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人T細(xì)胞嗜淋巴病毒抗原、15-1801856218(-3、。1^111111-23!11、1六6-72-4、0六19-9、0六72-4、CAMl7.UNuMa, K_ras、pl6、TAGE, PSCA, CT7、43_9F、5T4、791Tgp72、β -HCG, BCA225、BTAA,CA125、CA 15-3 (CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、C0-029、FGF-5、Ga733 (EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7_Ag、M0V18、NB/70K、NY-CO-1、RCASl、SDCCAG16、TA-90 (Mac-2結(jié)合蛋白\親環(huán)蛋白C相關(guān)蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS及類似物。藥物組合物本發(fā)明的脂質(zhì)體可用作藥物組合物中的組分來免疫對(duì)象對(duì)抗各種疾病。除脂質(zhì)體之外，這些組合物通常還包括藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體的全面討論參見參考文獻(xiàn)33。本發(fā)明的藥物組合物可包括一種或多種小分子免疫增強(qiáng)劑。例如，所述組合物可包括TLR2激動(dòng)劑(例如Pam3CSK4)、TLR4激動(dòng)劑(例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸，如E6020)、TLR7激動(dòng)劑(例如咪喹莫特(imiquimod))、TLR8激動(dòng)劑(例如瑞喹莫德(resiquimod))和/或TLR9激動(dòng)劑(例如IC31)。任何所述的激動(dòng)劑理想上具有<2000Da的分子量。包封RNA時(shí),在一些實(shí)施方式中，所述激動(dòng)劑也與RNA —同包封,但在其它實(shí)施方式中，不包封所述激動(dòng)劑。RNA被顆粒吸附時(shí)，在一些實(shí)施方式中，所述激動(dòng)劑也與RNA —同被吸附，但在其它實(shí)施方式中，不吸附所述激動(dòng)劑。本發(fā)明的藥物組合物可包括處于普通水(例如w.f.1)或緩沖液中的脂質(zhì)體，所述緩沖液為例如:磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液。緩沖鹽濃度一般在5 20mM范圍內(nèi)。本發(fā)明的藥物組合物的pH可在5.0和9.5之間，如在6.0和8.0之間。本發(fā)明的組合物可含有鈉鹽(如氯化鈉)以產(chǎn)生張力。NaCl的濃度通常是IO 土 2mg/mL,例如約 9mg/mL。本發(fā)明的組合物可包含金屬離子螯合劑。這些金屬離子螯合劑可通過清除能加速磷酸二酯水解的離子來延長(zhǎng)RNA的穩(wěn)定性。因此，組合物可包含EDTA、EGTA、BAPTA、噴替酸等中的一種或多種。所述螯合劑的濃度通常在10 500 μ M之間，例如0.1mM。檸檬酸鹽，例如檸檬酸鈉，既可作為螯合劑，又提供有利的緩沖活性。本發(fā)明的藥物組合物的重量摩爾滲透壓濃度可在200m0sm/kg和400m0sm/kg之間，如在240 360m0sm/kg之間或在290 310m0sm/kg之間。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種防腐劑，例如硫柳汞或2-苯氧乙醇。優(yōu)選不含汞的組合物，且可制備不含防腐劑的疫苗。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選是無(wú)菌的組合物。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選無(wú)熱源，如含有〈1EU (內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)/劑量，并優(yōu)選〈0.1EU/劑量。`本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選不含谷蛋白。本發(fā)明的藥物組合物可以以單位劑量形式制備。在一些實(shí)施方式中，單位劑量的體積可在0.1 1.0mL之間，例如約0.5mL?？蓪⑺鼋M合物制備為溶液或懸浮液形式的注射劑。所述組合物可制備來用于肺部給藥，例如用細(xì)噴霧形式通過吸入器給藥。所述組合物可以制備用于鼻部、耳部或眼部給藥，例如以噴霧或滴劑形式給藥。一般將可注射形式用于肌肉內(nèi)給藥。組合物包含免疫有效量的脂質(zhì)體，以及任何其它所需的組分。本文中的術(shù)語(yǔ)“免疫有效量”是指在一次劑量或一系列劑量的一部分中給予個(gè)體的量對(duì)治療或預(yù)防有效。該量的變化取決于如下因素:待治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、待治療個(gè)體的分類群(例如，非人的靈長(zhǎng)動(dòng)物、靈長(zhǎng)動(dòng)物等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗配方、治療醫(yī)生對(duì)醫(yī)學(xué)情況的評(píng)估和其它相關(guān)因素。預(yù)計(jì)所述量將落入可通過常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定的相對(duì)較寬范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物的脂質(zhì)體和RNA含量一般按每劑量RNA的量來表示。優(yōu)選劑量具有彡100 μ g的RNA(例如10 100 μ g，如約10 μ g、25 μ g、50 μ g、75 μ g或100 μ g)，但可見表達(dá)的水平低很多，例如< ^/劑量、< IOOng/劑量、< IOng/劑量、(Ing/劑量等。本發(fā)明還提供一種遞送裝置(例如注射器、噴霧器、噴灑器、吸入器、透皮貼片等)，所述遞送裝置包含本發(fā)明的藥物組合物。該裝置可用于對(duì)脊椎動(dòng)物對(duì)象給予所述的組合物。本發(fā)明的脂質(zhì)體不包括核糖體。治療及醫(yī)學(xué)應(yīng)用方法
對(duì)比參考文獻(xiàn)14中公開的粒子，本發(fā)明的脂質(zhì)體和藥物組合物用于體內(nèi)使用來引起對(duì)抗感興趣的免疫原的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明提供了用于在脊椎動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予有效量的本發(fā)明的脂質(zhì)體或藥物組合物的步驟。所述免疫應(yīng)答優(yōu)選為保護(hù)性的免疫應(yīng)答，并優(yōu)選涉及抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。所述方法可產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答。本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的脂質(zhì)體或藥物組合物，所述脂質(zhì)體或藥物組合物用于在脊椎動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法中。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的脂質(zhì)體在制造用于在脊椎動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。通過利用這些應(yīng)用和方法在脊椎動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可保護(hù)所述脊椎動(dòng)物對(duì)抗各種疾病和/或感染，例如，對(duì)抗如上討論的細(xì)菌和/或病毒性疾病。所述脂質(zhì)體和組合物是免疫原性的，更優(yōu)選為疫苗組合物。如本發(fā)明所述的疫苗可以是預(yù)防性(即，用來預(yù)防感染)或治療性(即，用來治療感染)疫苗，但一般是預(yù)防性疫苗。所述脊椎動(dòng)物優(yōu)選哺乳動(dòng)物，如人或大型獸類哺乳動(dòng)物(例如，馬、牛、鹿、山羊、豬)。當(dāng)預(yù)防性使用所述疫苗時(shí)，人優(yōu)選是兒童(如幼童或嬰兒)或青少年；當(dāng)所述疫苗用于治療用途時(shí)，人優(yōu)選是青少年或成人。計(jì)劃給予兒童的疫苗也可給予成年人，例如，用以評(píng)估其安全性、劑量、免疫原性等。按本發(fā)明所述制備的疫苗可用于治療兒童和成年人。因此，人患者可小于I歲、小于5歲、I 5歲、5 15歲、15 55歲或至少55歲。接受疫苗的患者優(yōu)選老年人(如≥50歲，≥60歲并優(yōu)選≥65歲)、幼兒(如≤5歲)、住院病人、保健護(hù)理人員、武裝人員和軍人、孕婦、慢性病人或免疫缺陷病人。不過，所述疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更廣泛的群體。通常將本發(fā)明的組合物直接給予患者。可通過腸胃外注射實(shí)現(xiàn)直接遞送(例如皮下注射、腹腔注射、靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮內(nèi)注射或注射入組織間隙；不同于參考文獻(xiàn)1，本發(fā)明一般不使用舌內(nèi)注射)?？蛇x擇的遞送途徑包括直腸、口服(例如片劑、噴霧)、口腔、舌下、陰道、局部、透皮或經(jīng)皮、鼻內(nèi)、眼部、耳部、肺部或其它黏膜給藥方式。皮內(nèi)和肌內(nèi)給藥是兩種優(yōu)選的途徑。注射可以通過針頭(例如皮下針頭)進(jìn)行，但也可以選擇使用無(wú)針注射。肌內(nèi)劑量一般為0.5mL。本發(fā)明可用于引起全身和/或黏膜免疫，優(yōu)選引起增強(qiáng)的全身和/或黏膜免疫?？梢酝ㄟ^單劑量方案或多劑量方案給藥。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同的途徑如胃腸道外初始和黏膜加強(qiáng)，黏膜初始和胃腸道外加強(qiáng)等給予多劑量。一般間隔至少I周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約10周、約12周、約16周等)給予多劑量。在一個(gè)實(shí)施方式中，可在出生后約6周、10周和14周給予多劑量,例如按世界衛(wèi)生組織的擴(kuò)大免疫規(guī)劃(Expanded Programon Immunisation, “EPI”)中常用的在6周齡、10周齡和14周齡時(shí)給藥。在一個(gè)可選實(shí)施方式中，間隔約兩個(gè)月(例如間隔約7、8或9周)給予兩個(gè)主要?jiǎng)┝?，然后在第二次主要?jiǎng)┝亢蠹s6個(gè)月 I年(例如在第二次主要?jiǎng)┝亢蠹s6、8、10或12個(gè)月)給予一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)劑量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，間隔約兩個(gè)月(例如間隔約7、8或9周)給予三個(gè)主要?jiǎng)┝?，然后在第三次主要?jiǎng)┝亢蠹s6個(gè)月 I年(例如，在第三次主要?jiǎng)┝亢蠹s6、8、10或12個(gè)月)給予一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)劑量。概述除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法，這些常規(guī)方法在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有充分描述。參見例如，參考文獻(xiàn)34 40等。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“包含”涵蓋“包括”以及“由…組成”，例如，“包含”X的組合物可以僅由X組成或可包括其它物質(zhì)，例如X+Y。與數(shù)值X相關(guān)的 術(shù)語(yǔ)“約”是可選的并表示，例如，x±10%。本文所用術(shù)語(yǔ)“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含” Y的組合物可完全不含Y。如有需要，“基本上”一詞可以從本發(fā)明的定義中省略。提及電荷、陽(yáng)離子、陰離子、兩性離子等時(shí)都是指pH7情況下。TLR3是Toll樣受體3。它是一種單次跨膜受體，其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用。已知的TLR3激動(dòng)劑包括聚(1:C)。“TLR3”是編碼該受體的基因的受認(rèn)可HGNC名稱，并且其專有 HGNC ID 是 HGNC:11849。人 TLR3 基因的 RefSeq 序列是 G1:2459625。TLR7是Toll樣受體7。它是一種單次跨膜受體，其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用。已知的TLR7激動(dòng)劑包括例如咪喹莫特?！癟LR7”是編碼該受體的基因的受認(rèn)可HGNC名稱，并且其專有HGNC ID是HGNC:15631。人TLR7基因的RefSeq序列是G1:67944638。TLR8是Toll樣受體8。它是一種單次跨膜受體，其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用。已知的TLR8的激動(dòng)劑包括例如瑞喹莫德(resiquimod)?！癟LR8”是編碼該受體的基因的受認(rèn)可HGNC名稱，并且其專有HGNC ID是HGNC: 15632。人TLR8基因的RefSeq序列是GI:20302165oRIG-1樣受體(“RLR”)家族包括多種RNA解旋酶，其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用[41]。RLR-1 (也被稱作RIG-1或維甲酸誘導(dǎo)基因I)在靠近其N-末端有兩個(gè)半胱天冬酶(caspase)募集結(jié)構(gòu)域。經(jīng)認(rèn)可的編碼該RLR-1解旋酶的基因的HGNC名稱是“DDX58”(針對(duì)DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)盒多妝 58 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide58)),并且其專有 HGNC ID 是 HGNC:19102。人 RLR-1 基因的 RefSeq 序列是 G1:77732514。RLR2 (也被稱作MDA5或黑色素瘤分化相關(guān)基因5)在靠近其N-末端也具有兩個(gè)半胱天冬酶(caspase)募集結(jié)構(gòu)域。編碼該RLR-2解旋酶的基因的受認(rèn)可HGNC名稱是“IFIHl” (針對(duì)由解旋酶C域 I 誘導(dǎo)的干擾素(interferon induced with helicase C domainl)),并且其專有 HGNCID 是 HGNC:18873。人 RLR-2 基因的 RefSeq 序列是 G1:27886567。RLR-3 (也被稱作 LGP2或遺傳學(xué)和生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白2 (laboratory of genetics and physiology2))沒有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域。編碼該RLR-3解旋酶的基因的受認(rèn)可HGNC名稱是“DHX58” (針對(duì)DEXH(Asp-Glu-X-His)盒多肽 58 (DEXH(Asp-Glu-X-His) box polyp印tide58))，并且其專有HGNC ID 是 HGNC:29517。人 RLR-3 基因的 RefSeq 序列是 G1: 149408121。PKR是雙鏈RNA依賴性蛋白激酶。其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用?！癊IF2AK2”(針對(duì)真核生物翻譯起始因子 2-α 激酶2 (eukaryotic translation initiationfactor2-alpha kinase2))是編碼該酶的基因的受認(rèn)可HGNC名稱，并且其專有HGNCID是HGNC:9437o 人 PKR 基因的 RefSeq 序列是 G1:208431825。


圖1顯示RNA染色凝膠。泳道表示如下:(I)標(biāo)記物(markers)⑵裸復(fù)制子(3)RNA酶處理后的復(fù)制子(4)包封在脂質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制子(5) RNA酶處理后的脂質(zhì)體(6)經(jīng)RNA酶處理后又經(jīng)苯酚/氯仿提取的脂質(zhì)體。圖2是脂質(zhì)體的電子顯微照片。圖 3 顯示 DLinDMA、DLenDMA 和 DODMA 的結(jié)構(gòu)。圖4顯示RNA染色凝膠。泳道表示如下:(I)標(biāo)記物(markers)⑵裸復(fù)制子(3)包封在脂質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制子(4)經(jīng)RNA酶處理后又經(jīng)苯酚/氯仿提取的脂質(zhì)體。圖5顯示RNA遞送后第1、3和6天的蛋白質(zhì)表達(dá)，其中，RNA以病毒體包裝的復(fù)制子形式遞送(方形)、以裸露RNA形式遞送(菱形)或在脂質(zhì)體內(nèi)遞送(+=0.1 μ g，X=I μ g)。圖6顯示四種不同劑量的脂質(zhì)體包封RNA遞送后第1、3和6天的蛋白質(zhì)表達(dá)。圖7顯示接受病毒體包裝的復(fù)制子(VRP或VSRP)、I μ g裸露RNA和I μ g脂質(zhì)體包封的RNA的動(dòng)物體內(nèi)抗F IgG滴度。圖8顯示接受VRP、I μ g裸露RNA和0.1g或I μ g脂質(zhì)體包封的RNA的動(dòng)物體內(nèi)抗F IgG滴度。圖9顯示接受VRP、0.1g或I μ g脂質(zhì)體包封的RNA的動(dòng)物體內(nèi)中和抗體滴度。圖10顯示復(fù)制子以裸露RNA (圓形)、脂質(zhì)體包封的RNA (三角形和方形)或脂復(fù)合體(lipoplex)(倒三 角形)形式遞送后的表達(dá)水平。圖11顯示復(fù)制子以裸露RNA (0.01 lyg)、脂質(zhì)體包封的RNA (0.01 IOyg)或包裝成病毒體(VRP，IO6感染單位或IU)形式遞送后的F-特異性IgG滴度(第二劑量后2周)。圖12顯示復(fù)制子以裸露RNA(1 μ g)、脂質(zhì)體包封的RNA (0.1或I μ g)或包裝成病毒體(VRP，IO6IU)的形式遞送后的F-特異性IgG滴度(圓形)和PRNT滴度(方形)。也顯示了未處理(na'i ve)小鼠的滴度。實(shí)線表示幾何平均數(shù)。圖13顯示在第二劑量后4周，用代表F蛋白內(nèi)主要抗原表位的合成肽再刺激后的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的產(chǎn)量。I軸表示⑶8+⑶4-的細(xì)胞因子+百分比。圖14顯示小牛免疫后超過63天(圖14A)和210天(圖14B)的F-特異性IgG滴度(平均1gltl滴度土標(biāo)準(zhǔn)偏差)。在第63天時(shí)，三條線可由底至頂?shù)乇惠p易區(qū)分:PBS陰性對(duì)照、脂質(zhì)體遞送的RNA以及所述“三角4”產(chǎn)物。圖15顯示相對(duì)于脂質(zhì)體中所用脂質(zhì)的pKa的第六天的SEAP表達(dá)(相對(duì)密度)圖像。圓形表示含DSPC的脂質(zhì)體的水平，方形表示不含DSPC的脂質(zhì)體的水平，有時(shí)方形和圓形會(huì)重合，只剩下可見的方形用于表示給定的PKa。圖16顯不在編碼F蛋白的復(fù)制子的第一劑量后兩周的抗F滴度表達(dá)(相對(duì)于RVO1,100%)。以與圖15中同樣的方式繪制對(duì)應(yīng)于pKa的滴度圖像。星形表示RV02，其使用了 pKa高于其它脂質(zhì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)。三角形表示缺乏DSPC的脂質(zhì)體的數(shù)據(jù)；圓形表示包含DSPC的脂質(zhì)體的數(shù)據(jù)。圖17顯示復(fù)制子以脂質(zhì)體遞送后的總IgG滴度，其中從左向右所用脂質(zhì)體為RV01、RV16、RV17、RV18或RV19。橫線表示均值。每例中，較高的橫線是2wp2 (即第二劑量后2周)，而較低的橫線是2wpl。
圖18顯示13組小鼠體內(nèi)的IgG滴度。每個(gè)圓形是一只小鼠個(gè)體，實(shí)線表示幾何平均值。其中，點(diǎn)狀水平線是本測(cè)試的檢測(cè)限。所述13組從左至右為如下文所述的A M。圖19顯示pDC釋放的(A) IL-6和(B) IFN a (pg/mL)。從左至右的4對(duì)條形是:對(duì)照；用RNA+D0TAP免疫；用RNA+脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine)脂質(zhì)體免疫；以及用脂質(zhì)體內(nèi)的RNA免疫。在每一對(duì)中，黑色條形是野生型小鼠，灰色條形是rsql突變體。
具體實(shí)施例方式RNA復(fù)制子下文使用了多種復(fù)制子。一般而言，這些復(fù)制子基于雜交α病毒基因組，其具有來自委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的非結(jié)構(gòu)蛋白，來自辛德畢斯病毒的包裝信號(hào)以及來自辛德畢斯病毒或VEEV突變種的3’端UTR。該復(fù)制子長(zhǎng)約IOkb，且具有聚腺苷酸尾。將編碼α病毒復(fù)制子的質(zhì)粒DNA (名為:pT7-mVEEV_FL.RSVF或A317、pT7-mVEEV-SEAP或A306、pSP6_VCR-GFP或A50)作為用于體外合成RNA的模板。所述復(fù)制子含有RNA復(fù)制所需的α病毒遺傳元件，但缺失了編碼顆粒組裝所必需的基因產(chǎn)物的那些遺傳元件；所述結(jié)構(gòu)蛋白由所需的蛋白質(zhì)(報(bào)告子(如SEAP或GFP)或者免疫原(如全長(zhǎng)RSV F蛋白))所替換，這樣所述復(fù)制子便無(wú)法誘導(dǎo)產(chǎn)生傳染顆粒。所述α病毒cDNA上游的噬菌體(T7或SP6)啟動(dòng)子促進(jìn)所述復(fù)制子RNA的體外合成，并且緊鄰聚(A)尾下游的丁型肝炎病毒(HDV)核酶通過其自切割活性產(chǎn)生正確的3’末端。用合適的限制性內(nèi)切核酸酶線性化所述HDV核酶下游的質(zhì)粒DNA后，用T7或SP6曬菌體衍生的DNA依賴性RNA聚 合酶體外合成失控轉(zhuǎn)錄物(run-off transcript)。按照生產(chǎn)商(安碧公司(Ambion))提供的說明，在7.5mM(T7RNA聚合酶)或5mM(SP6RNA聚合酶)存在下，讓各三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP和UTP)在37° C轉(zhuǎn)錄2小時(shí)。轉(zhuǎn)錄后，用TURBO DNA酶(安碧公司(Ambion))消化模板DNA。用LiCl沉淀復(fù)制子RNA，并將其復(fù)溶于無(wú)核酸酶的水中。通過ScriptCap m7G加帽系統(tǒng)(埃皮森特生物技術(shù)公司(EpicentreBiotechnologies)),按照使用手冊(cè)的描述,用牛痘加帽酶(VCE)對(duì)未加帽的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加帽；以該方式加帽的復(fù)制子標(biāo)有前綴“V”，例如，vA317是通過VCE加帽的A317復(fù)制子。用LiCl沉淀轉(zhuǎn)錄后加帽的RNA，并將其復(fù)溶于無(wú)核酸酶的水中。RNA樣品的濃度通過檢測(cè)OD260nm測(cè)定。體外轉(zhuǎn)錄物的完整性通過變性瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)。脂質(zhì)體包封將RNA包封在按參考文獻(xiàn)11和42制備的脂質(zhì)體內(nèi)。所述脂質(zhì)體由10%DSPC (兩性離子型)、40%DLinDMA(陽(yáng)離子型)、48%膽固醇和2%連接PEG的DMG(2kDa PEG)組成。這些比例指的是占整個(gè)脂質(zhì)體中的摩爾％。按參考文獻(xiàn)6的方法合成DLinDMA(l，2_ 二亞油基氧基-N，N- 二甲基_3_氨基丙烷)。DSPC (1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿)購(gòu)自基酶公司(Genzyme)。膽固醇獲自西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)。連接PEG的DMG (1，2- 二肉豆蘧?；鵢sn_丙三基-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)，銨鹽)、D0TAP(1，2-二油?；?3-三甲基銨基丙燒，氯鹽)和DC-chol (鹽酸3 β - [N- (N’, N’ - 二甲氨基乙燒)-氨基甲酸基]膽固醇)，來自阿凡提極性脂公司(Avanti Polar Lipids)。簡(jiǎn)要來說，將脂質(zhì)溶解于乙醇(2mL)中，將RNA復(fù)制子溶解于緩沖液(2mL，IOOmM檸檬酸鈉，pH6)中，用2mL緩沖液混合這些物質(zhì)，然后平衡I小時(shí)。用6mL緩沖液稀釋所述混合物，然后過濾。所得產(chǎn)物包含脂質(zhì)體，具有約95%的包封率。例如，在一個(gè)具體的方法中，在乙醇中配制新鮮的脂質(zhì)儲(chǔ)液。稱量37mg DLinDMA、
11.8mg DSPC、27.8mg 膽固醇和 8.07mg PEG-DMG，并在 7.55mL 乙醇中溶解。在 37。C 溫和搖動(dòng)新鮮配制的脂質(zhì)儲(chǔ)液約15分鐘以形成均質(zhì)混合物。然后，將755μ L所述儲(chǔ)液加入
1.245mL乙醇中形成2mL工作脂質(zhì)儲(chǔ)液。將這個(gè)量的脂質(zhì)用于形成含有250 μ g RNA的脂質(zhì)體。還以在IOOmM檸檬酸鹽緩沖液(pH6)中約I μ g/ μ L的濃度由儲(chǔ)液制備2mL RNA工作溶液。在使用三個(gè)20mL的玻璃瓶(有攪拌棒)前，用RNA酶去除液(分子生物產(chǎn)品公司(Molecular BioProducts))沖洗所述玻璃瓶，并用足量MilliQ水清洗，以去除瓶子的RNA酶污染。將所述玻璃瓶中的一個(gè)用于所述RNA工作溶液，其它的瓶用于收集所述脂質(zhì)和RNA混合物(如后文所述)。在37° C加熱所述工作脂質(zhì)和RNA溶液lOmin，然后將其裝入3cc魯爾鎖(Iuer-1ok)注射器。將2mL朽1檬酸鹽緩沖液(pH6)裝入另一個(gè)3cc注射器中。使用FEP管(氟化乙烯-丙烯；所有使用的FEP管都具有2mm的內(nèi)直徑和3mm的外直徑)將裝有RNA和所述脂質(zhì)的注射器連接至T型混流器(ΡΕΕΚ 500 μ m ID連接，藝達(dá)思集團(tuán)健康與科技事業(yè)部(Idex Health Science)) 0所述T型混流器的出口也裝有FEP管。將裝有檸檬酸鹽緩沖液的第三個(gè)注射器連接至一段單獨(dú)的FEP管。然后，用注射泵以7mL/min的流速驅(qū)動(dòng)所有注射器。放置所述管的出口以使所述混合物收集到20mL玻璃瓶中(同時(shí)攪拌)。取出所述攪拌棒，使所述乙醇/水性溶液平衡至室溫lh。將4mL所述混合物裝入連有一段FEP管的5cc注射器，將等量的IOOmM檸檬酸鹽緩沖液(pH6)裝入另一個(gè)連有一段等長(zhǎng)FEP管的5cc注射器。用注射泵以7m L/分鐘的流速驅(qū)動(dòng)所述兩個(gè)注射器，并將最終的混合物收集到20mL玻璃瓶中(同時(shí)攪拌)。之后，使收集自第二混合步驟的混合物(脂質(zhì)體)通過Mustang Q膜(結(jié)合并移除陰離子分子的陰離子交換支持物，獲自波爾公司(PaliCorporation))。在該膜用于脂質(zhì)體之前，先讓4mLlM NaOH、4mLlM NaCl和IOmLlOOmM朽1樣酸鹽緩沖液(PH6)依次通過該膜。將脂質(zhì)體在37° C溫育IOmin后通過所述膜。接著，將脂質(zhì)體濃縮到2mL，使用切向流過濾(TFF)對(duì)10 15體積I XPBS透析，然后回收終產(chǎn)物。所述TFF系統(tǒng)和中空纖維過濾膜購(gòu)自斯派實(shí)驗(yàn)室(Spectrum Labs)(多明格斯牧場(chǎng)(RanchoDominguez)),并按照生產(chǎn)商指南使用。使用具有IOOkD孔徑截止值、8cm2表面積的聚砜中空纖維過濾膜。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所用的制劑用I XPBS稀釋到所需的RNA濃度。圖2顯示通過這些方法制備的脂質(zhì)體的示例性的電子顯微照片。這些脂質(zhì)體包含包封的編碼全長(zhǎng)RSV F抗原的RNA。一批脂質(zhì)體的動(dòng)態(tài)光散射顯示其平均直徑是141nm(根據(jù)密度)或78nm (根據(jù)數(shù)量)。RNA的包封百分比和RNA的濃度利用Quant-1T RiboGreen RNA試劑盒(英杰生命科技有限公司(InvitiOgen))按照生產(chǎn)商的說明來測(cè)定。利用所述試劑盒提供的核糖體RNA標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在添加染料前，在I XTE緩沖液(來自試劑盒)中將所述脂質(zhì)體稀釋到IOX或IOOX。另外，在添加染料(來破壞脂質(zhì)體并由此檢測(cè)總RNA)前，在含有0.5%曲通X (Triton X)的I X TE緩沖液中將脂質(zhì)體稀釋到10X或100X。然后，添加等量的染料至各溶液，然后，將約180 μ L添加染料后的各溶液加入(設(shè)雙重復(fù))96孔組織培養(yǎng)板。在酶標(biāo)儀上讀取熒光(激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)528nm)。所有脂質(zhì)體制劑的體內(nèi)給藥劑量都基于RNA的包封量。
據(jù)顯示包封于脂質(zhì)體內(nèi)保護(hù)了 RNA不被RNA酶消化。實(shí)驗(yàn)使用3.8mAU RNA酶A/微克RNA，在室溫孵育30分鐘。RNA酶用蛋白酶K在55° C滅活10分鐘。然后添加1:1v/V的樣品混合物比25:24:lv/v/v的苯酚:氯仿:異戊醇以從所述脂質(zhì)提取所述RNA進(jìn)入水相。渦旋震蕩數(shù)秒鐘混勻樣品，然后將樣品置于離心機(jī)上以12，000RPM離心15min。移出并使用所述水相(含有所述RNA)來分析所述RNA。在上樣之前(每孔400ng RNA)，將所有樣品和甲醛上樣染料一起孵育，在65° C變性10分鐘，并冷卻至室溫。使用安碧公司(Ambion)的Millennium標(biāo)記物來估計(jì)RNA構(gòu)建物的分子量。在90V跑膠。按照生產(chǎn)商指南，在水中使用0.1%SYBR金，通過在室溫?fù)u晃I小時(shí)對(duì)所述凝膠染色。圖1顯示在無(wú)包封情況下，RNA被RNA酶完全消化(第3泳道)。包封后無(wú)法檢測(cè)到RNA (第4泳道)，即便這些脂質(zhì)體經(jīng)RNA酶處理也未見變化(第4泳道)。脂質(zhì)體經(jīng)RNA酶處理后又經(jīng)苯酚提取，可見未被消化的RNA(第6泳道)。甚至在4° C經(jīng)過I周后，仍然可見沒有任何斷裂的RNA(圖4，箭頭)。在4° C經(jīng)過6周和一個(gè)凍融循環(huán)后，體內(nèi)蛋白表達(dá)不變。因此，脂質(zhì)體包封的RNA是穩(wěn)定的。為評(píng)估所述RNA的體內(nèi)表達(dá)，在所述復(fù)制子內(nèi)編碼了報(bào)告酶(分泌型堿性磷酸酶，SEAP)而不是免疫原。以1:4在IX磷雜-光(Phospha-Light)稀釋緩沖液中稀釋血清，在該稀釋液中使用化學(xué)發(fā)光堿性磷酸鹽底物來檢測(cè)表達(dá)水平。在第O天，以0.1 μ g或I μ gRNA劑量對(duì)8 10周大的BALB/c小鼠(5只/組)進(jìn)行肌內(nèi)注射(50 μ L/腿)。不含所述脂質(zhì)體的相同載體(溶于無(wú)RNA酶的1XPBS)也以Iyg給藥。還測(cè)試了病毒體包裝的復(fù)制子。本文所用的病毒體包裝的復(fù)制子(稱為“VRPs”)按參考文獻(xiàn)43的方法獲得，其中，所述α病毒復(fù)制子衍生自突變VEEV或者嵌合體，所述嵌合體衍生自VEEV基因組且經(jīng)基因工程操作而含有辛德畢斯病毒3’端UTR和辛德畢斯病毒包裝信號(hào)(PS)，通過共電穿孔使其與編碼辛德畢斯病毒衣殼和糖蛋白基因的缺損型輔助RNA包裝入BHK細(xì)胞。如圖5所示，就I μ g劑量而言，包封使SEAP水平增加約l/21og，在第6天，0.1yg包封劑量的表達(dá)達(dá)到了 Iyg未包封劑量所見的水平。到第3天時(shí)，表達(dá)水平超過了那些使用VRP(SB)所達(dá)到的水平。因此，相比裸露RNA對(duì)照，配制在脂質(zhì)體中的RNA的表達(dá)增力口，甚至在較低的劑量(IOX)也是如此。表達(dá)與VRP對(duì)照相比也更高，但表達(dá)動(dòng)力學(xué)非常不同(參見圖5)。相對(duì)于裸露RNA，由電穿孔遞送所述RNA使得表達(dá)增加，但這些水平都低于由脂質(zhì)體遞送的RNA。為評(píng)估所述脂質(zhì)體組顯示的效果是僅僅歸因于脂質(zhì)體組分，還是與包封有聯(lián)系，所述復(fù)制子以包封形式(用兩種不同的純化方法，0.1yg RNA)給藥，或在脂質(zhì)體形成后與其混合(非包封的“脂復(fù)合體”，0.1 μ g RNA)給藥，或者以裸露RNA(1 μ g)給藥。圖10顯示所述脂復(fù)合體顯示了最低表達(dá)水平，顯示包封對(duì)蛋白表達(dá)是必要的。使用脂質(zhì)體遞送的體內(nèi)研究證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。小鼠接受不同的組合:(i)編碼全長(zhǎng)RSV F蛋白的自復(fù)制RNA復(fù)制子(ii)編碼GFP的自復(fù)制RNA復(fù)制子(iii)編碼GFP的RNA復(fù)制子，其敲除nsP4以排除自復(fù)制(iv)全長(zhǎng)RSV F蛋白。共有13組接受以下組合物:
權(quán)利要求
1.一種具有包封水性核心的脂質(zhì)雙分子層的脂質(zhì)體，其特征在于:(i)所述脂質(zhì)雙分子層包含PKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)；以及(ii)所述水性核心包括編碼免疫原的RNA。
2.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)具有叔胺。
3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述在5.0 7.6范圍內(nèi)的pKa在5.7 5.9之間。
4.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)具有如本文中的式 RVOl、RV02、RV03、RV04、RV05、RV06、RV07、RV08、RV09、RVl1、RV12、RV16 或RV17所示。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其直徑在20 220nm范圍內(nèi)。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA分子編碼(i)能從所述RNA分子轉(zhuǎn)錄RNA的RNA依賴性RNA聚合酶，以及(ii)免疫原。
7.如權(quán)利要求5所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA分子有兩個(gè)開放閱讀框，所述開放閱讀框中的第一個(gè)開放閱讀框編碼α病毒復(fù)制酶，而第二個(gè)開放閱讀框編碼所述免疫原。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA分子的長(zhǎng)度是9000 12000個(gè)核苷酸。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述免疫原能引起體內(nèi)免疫應(yīng)答以對(duì)抗細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述免疫原能引起體內(nèi)免疫應(yīng)答以對(duì)抗呼吸道合胞病毒糖蛋白F。
11.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體。
12.一種用于在脊椎動(dòng)物體內(nèi)引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述脊椎動(dòng)物有效量的如權(quán)利要求1 10所述的脂質(zhì)體或者如權(quán)利要求11所述的藥物組合物的步驟。
13.一種用于制備包含RNA的脂質(zhì)體的方法，所述方法包括脂質(zhì)體形成過程中的如下步驟:(a)在低于脂質(zhì)的pKa但聞?dòng)?.5的pH下混合RNA和所述脂質(zhì)；然后(b)提聞pH,使其聞?dòng)谒鲋|(zhì)的pKa。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于:步驟(a)中所用的RNA在水性溶液中，以與所述脂質(zhì)的有機(jī)溶液混合來獲得混合物，然后稀釋所述混合物以形成脂質(zhì)體；以及在步驟(b)中，在脂質(zhì)體形成后提高所述pH。
全文摘要
在脂質(zhì)體內(nèi)遞送編碼免疫原的RNA以用于免疫目的。所述脂質(zhì)體包含pKa在5.0～7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)，優(yōu)選所述脂質(zhì)具有叔胺。在生理pH下，這些脂質(zhì)體的表面電荷基本呈中性，并且所述脂質(zhì)體對(duì)免疫有效。
文檔編號(hào)C12N15/86GK103153284SQ201180042459
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月6日
發(fā)明者A·吉爾 申請(qǐng)人:諾華有限公司