專利名稱：含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且pdgf與vdgf耗盡的血小板裂解物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于血小板衍生物的領(lǐng)域，特別是關(guān)于得自人類或動(dòng)物源血小板的生長(zhǎng)因子濃厚液的領(lǐng)域。本發(fā)明還關(guān)于ー種制備這類含有生長(zhǎng)因子的血小板裂解物的方法，及其在試管內(nèi)(in vitro)、活體外(ex vivo)的細(xì)胞培養(yǎng)(例如干細(xì)胞擴(kuò)增及分化)的用途、美容或臨床的應(yīng)用，如與骨移植體的組合應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白體學(xué)分析的證據(jù)顯示，人類血小板包含大量具有重要生理功能的分子，其中又以生長(zhǎng)因子(GF)最受矚目。這些生長(zhǎng)因子堆積在血小板的α-顆粒內(nèi)，主要 包括三種血小板衍生的生長(zhǎng)因子的異構(gòu)體(H)GF-AA、-AB及-ΒΒ)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)形生長(zhǎng)因子-β (TGF-β I及TGF12)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、以及ー些類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)?，F(xiàn)已根據(jù)這些生長(zhǎng)因子的治療標(biāo)的，將復(fù)雜的人類血小板生長(zhǎng)因子混合物以單ー捐輸者(single-donor)血小板凝膠生物材料的形式用于治療方面的應(yīng)用，上述血小板凝膠生物材料是通過(guò)凝血酶對(duì)含血小板的血漿進(jìn)行活化后得到。血小板活化通常會(huì)使包含在血小板內(nèi)的生長(zhǎng)因子釋出，在此同時(shí)，凝血酶會(huì)使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白而形成凝膠基質(zhì)(gel matrix)，這類凝膠基質(zhì)會(huì)將生長(zhǎng)因子抓在里面。這項(xiàng)生物材料一般會(huì)單獨(dú)施用或與移植材料(graft materials)共同施用在組織上，故可將含有生長(zhǎng)因子的血小板凝膠(platelet gels)用于再生醫(yī)學(xué)(regenerativemedicine)，以促進(jìn)軟組織及硬組織的愈合及再生。亦可將從血小板得到的生長(zhǎng)因子濃厚液補(bǔ)充在試管內(nèi)(in vitro)或活體外(ex vivo)的細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。近來(lái)已證明，可能使用富含人類生長(zhǎng)因子的血小板釋出物來(lái)取代胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),而使間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells)或造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells)在活體外(ex vivo)中擴(kuò)增。目前將富含生長(zhǎng)因子的血小板釋出物應(yīng)用于干細(xì)胞擴(kuò)增一事倍受矚目，特別是在公認(rèn)的新“廣效”細(xì)胞(即間質(zhì)干細(xì)胞mesenchymal stem cells, MCS),或造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells))擴(kuò)增中用來(lái)作為胎牛血清(FBS)或胎犢血清(fetal calfserum, FCS)的替代品,這些血清普遍被視為普利子蛋白(prion)及病毒的可能傳染源，也被視為在病患身上造成免疫問(wèn)題的原因，這是胎牛血清或胎犢血清中殘余的牛蛋白和抗原所造成的。最近已發(fā)展出新的策略，包括在公知表現(xiàn)系統(tǒng)中生產(chǎn)重組血小板生長(zhǎng)因子，如將某重組人類個(gè)體(Rh)生長(zhǎng)因子用于治療用途。某些國(guó)家已核準(zhǔn)將基因工程酵母菌所表現(xiàn)的Rh-PDGF-BB用于治療慢性神經(jīng)病變型下肢糖尿病性潰瘍(chronicneuropathiclower-extremity diabetic ulcers),不過(guò)，要達(dá)到臨床成效需要施用高劑量的這種單一生長(zhǎng)因子數(shù)周之久。同樣地，TGF-β超級(jí)家族中的Rh-骨型態(tài)發(fā)生蛋白(Rh-bonemorphogenetic proteins,BMP)BMP-2及BMP-7可從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞制得，并已核準(zhǔn)用于治療某些骨折手術(shù)。然而，可用的重組生長(zhǎng)因子數(shù)目仍然非常有限，部分是因?yàn)檫@些生長(zhǎng)因子在分離、鑒定、選殖及表現(xiàn)方面的難度所致。進(jìn)ー步言之，血小板衍生的制備物的優(yōu)點(diǎn)仍比使用單一重組因子要多，這是因?yàn)樵谀承?yīng)用中，生長(zhǎng)因子的組合可達(dá)到優(yōu)勢(shì)協(xié)同作用(synergistic effect)。目前數(shù)據(jù)顯示生長(zhǎng)因子TOGF及VEGF是直接與異常細(xì)胞增殖及/或分化有關(guān)(例如可參見(jiàn) Ferrara et al. , Nature Medicine, vol. 9, no. 6, 2003, pp. 669-676 ;以及EuropeanMedical Agency 在 2010 年 2 月 18 日刊行的 EMA/92326/2010，和 FDA 于 2008 年3 月 27 日的通Tfi“an ongoing safety review of regranex(becaplermin)，'ノ。由十在以TOGF及VEGF個(gè)別進(jìn)行的治療中，發(fā)展中癌癥的感受性(susceptibility)増加了，因此要避免將這兩種生長(zhǎng)因子用于培養(yǎng)干細(xì)胞或治療病患，特別是當(dāng)該病患已有罹癌風(fēng)險(xiǎn)的時(shí)候。因此，目前確有發(fā)展處理人類血小板材料的方法的需要，這些方法是用以制備已定性且具病毒安全性的エ業(yè)生長(zhǎng)因子制備物，特別是其中I3DGF及VEGF耗盡的制備物。專利申請(qǐng)W02009/087560已揭露可使人類血小板濃厚液接受溶劑及清潔劑組合 (S/D)的處理來(lái)達(dá)到雙重目的(a)脂質(zhì)包膜病毒的去活化，以及(b)從血小板α-顆粒大量釋出生長(zhǎng)因子。之后可通過(guò)結(jié)合S/D處理、油萃取及疏水性交互作用層析(HIC)步驟而得到ー標(biāo)準(zhǔn)化復(fù)雜血小板生長(zhǎng)因子混合物，其包含H)GF-AB、-BB及-AA、TGF-β、EGF、VEGF,以及類胰島素生長(zhǎng)因子-β I (IGF-β I)，其中油萃取及HIC是用以移除S/D試劑而不會(huì)顯著影響PGF及蛋白的含量。所得血小板生長(zhǎng)因子制備物顯示可在試管內(nèi)刺激多種細(xì)胞株，并促使由抽脂取得的脂肪組織當(dāng)中的干細(xì)胞擴(kuò)增。此外，W02009/087560亦揭露了以SP-sepharose陽(yáng)離子交換管柱來(lái)取代HIC,以制備經(jīng)純化的FiDGF-VEGF流析物(fraction)。在這項(xiàng)方案中，PDGF及VEGF確實(shí)可被吸附在管柱上，但TGF-β、EGF、IGF則與在病毒去活化步驟中使用的S/D試劑一同在前緣部分(breakthrough)出現(xiàn)。反言之，W02009/087560揭露的是可通過(guò)DEAE-s印harose陰離子交換取代HIC的方式將TGF- β及EGF純化到一定的程度。在El-Ekiaby et al.所發(fā)表的文獻(xiàn)(El-Ekiaby et al ； , ^Solvent-detergentiiltered(b/D_F)iresh frozen plasma and cryoprecipitate minipools prepared in anewly designed integraldisposable processing bag system，，,Transfusion medicine,2010,20,48-61)當(dāng)中，作者揭露了ー種方法，其可用于單ー來(lái)源(singulet)或迷你集池(mini-pools)的輸血用血漿及冷凍沉淀品的病毒去活化處理，包含下列主要步驟以TnBP及Triton X_45的混合物對(duì)新鮮冷凍血漿(FFP)、冷凍沉淀品貧乏的血漿(Cryo-PoorPlasma, CPP)或冷凍沉淀品進(jìn)行S/D處理；對(duì)經(jīng)S/D處理的血漿材料進(jìn)行油萃?。灰约巴高^(guò)含有經(jīng)活化的活性碳的S/D吸收過(guò)濾器來(lái)過(guò)濾經(jīng)油萃取的血漿材料。如該文獻(xiàn)的討論所述，其所揭露的方法特別是能夠保存血漿蛋白(例如凝血因子)的功能活性，不會(huì)改變VWF多聚體組成物(VWF mu I timer composition),且會(huì)將TnBP及Triton X-45減少到可接受濃度以下，并可通過(guò)重力使所得的經(jīng)純化血漿進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。然而這份文獻(xiàn)是針對(duì)血漿材料的純化，故未揭露或建議ー種可用于從血小板濃厚液純化出生長(zhǎng)因子的方法。在密集研究后，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明包含對(duì)血小板濃厚液進(jìn)行S/D處理、再進(jìn)行油萃取及活性碳萃取或單以活性碳萃取的方法能夠簡(jiǎn)便、快速、有效地制備出ー種含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物，其中溶劑及清潔劑的濃度是符合主管機(jī)關(guān)有關(guān)經(jīng)S/D處理的非經(jīng)ロ血液衍生治療產(chǎn)品的核可標(biāo)準(zhǔn)。更特定言之，本發(fā)明的方法不會(huì)改變主要蛋白(如白蛋白及免疫球蛋白)的含量，且基本不影響I3DGF及VEGF以外的生長(zhǎng)因子的濃度，如TGF-β I、EGF及IGF。進(jìn)ー步來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的方法可溶解脂質(zhì)膜，所以會(huì)將脂質(zhì)包膜病毒及其它病原體(例如，細(xì)菌和寄生蟲(chóng)如原蟲(chóng))等去活化，并可移除在起始血小板濃厚液中存在的血漿及血小板脂質(zhì)。是以，本發(fā)明的方法使之可能提供ー種病毒去活化的血小板衍生的生長(zhǎng)因子混合物，其可被有效地標(biāo)準(zhǔn)化而用于治療性處理、細(xì)胞療法或細(xì)胞培養(yǎng)。最后，臨床上在靜脈內(nèi)使用血小板來(lái)矯治數(shù)量性或功能性血小板數(shù)量低下癥(thrombocytopenia)時(shí)，由于血小板的保存期限是5或7天(部分是因?yàn)榧?xì)菌污染風(fēng)險(xiǎn)與止血功能活性喪失的問(wèn)題)，所以毎年通常都會(huì)廢棄大量保存時(shí)間大于5或7天的血小板單位。本發(fā)明的方法允許使用過(guò)期血小板儲(chǔ)存液來(lái)制備血小板衍生的濃厚液，掲示了ー種極具有經(jīng)濟(jì)目標(biāo)的愿景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是ー種制備含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的方法，其包含下列步驟使起始血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑接觸；使所述起始血小板濃厚液與所述溶劑及/或清潔劑共同培養(yǎng)一段至少5分鐘至6小時(shí)的時(shí)間，其PH值維持在從約6. O至約9. O的范圍內(nèi)，且其溫度是在從2°C至50°C的范圍內(nèi)，優(yōu)選為在從25°C至40°C的范圍內(nèi)；通過(guò)油萃取來(lái)移除所述溶劑及/或清潔劑，以得到一水性蛋白相；以及將所述水性蛋白相與活性碳共同培養(yǎng)，或通過(guò)將經(jīng)溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液?jiǎn)闻c活性碳共同培養(yǎng)來(lái)移除溶劑及/或清潔劑。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法中所使用的溶劑是選自由具有不同烷基鏈的ニ -或三烷基磷酸酯類所組成的群組，優(yōu)選為三正丁基磷酸酯(TnBP)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法中所使用的清潔劑是選自由脂肪酸的聚氧こ烯衍生物、山梨糖醇酐的偏酯類(partial esters)、非離子性清潔劑、脫氧膽酸鈉及磺基甜菜堿類(sulfobetaines)所組成的群組,更優(yōu)選為選自由Triton X-45、Triton X-100、Tween 80及Tween 20所組成的群組。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述溶劑及/或所述清潔劑在將所述血小板濃厚液與溶劑/清潔劑共同培養(yǎng)的步驟中的個(gè)別濃度范圍為從0. 2至5體積％，優(yōu)選為從0. 2至2體積％，其是以所述起始血小板濃厚液的體積為基礎(chǔ)計(jì)算。在本發(fā)明的方法的一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述起始血小板濃厚液是單與2% TnBP接觸，或與I % TnBP及I % Triton X-45接觸，其是以所述血小板濃厚液的體積為基礎(chǔ)計(jì)算。進(jìn)ー步言之，在本發(fā)明ー優(yōu)選實(shí)施方式中，油萃取是以醫(yī)藥等級(jí)油來(lái)進(jìn)行，且所述油的用量為從2至20重量％、或從5至15重量％、或從5至10重量％ ,其是以所述血小板濃厚液與所述溶劑及/或清潔劑的混合物的重量為基礎(chǔ)計(jì)算。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)在與經(jīng)活化的活性碳共同培養(yǎng)之前進(jìn)行油萃取時(shí)，經(jīng)活化的活性碳的用量為在油萃取后回收的水性蛋白相的從50至250g/l，優(yōu)選為從55至200g/l、或從 60 至 150g/l、或從 65 至 100g/l。在另ー實(shí)施方式中，當(dāng)在與經(jīng)活化的活性碳共同培養(yǎng)之前不進(jìn)行油萃取時(shí)，經(jīng)活化的活性碳的用量為經(jīng)溶劑及/或清潔劑處理一次的血小板濃厚液的從250至1250g/l，優(yōu)選為從 275 至 1000g/l、或從 300 至 750g/l、或從 325 至 500g/l。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法在油萃取后、及/或在與活性碳共同培養(yǎng)后包含另ー離心步驟。本發(fā)明的方法可進(jìn)ー步包含另ー選自由層析、納米過(guò)濾(用以移除致病劑)及/或超濾所組成的群組的步驟來(lái)處理所得血小板裂解物。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包含一制備起始血小板濃厚液的初步步驟，所述起始血小板濃厚液是通過(guò)血小板分離術(shù)(apheresis)或通過(guò)血沉棕黃層(buffy-coat)分離法而從全血加已制備，且為新鮮、過(guò)期的儲(chǔ)存液體、或過(guò)期且冷凍的狀態(tài)。本發(fā)明的另ー目的是ー種含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且TOGF及VEGF耗盡的血小 板裂解物，或是ー種通過(guò)本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，這種血小板裂解物包含生長(zhǎng)因子TGF-β、IGF及EGF。在另ー實(shí)施方式中，這種血小板裂解物進(jìn)ー步包含bFGF。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物包含-PDGF-AB,其濃度為低于10ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為低于5ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為低于3ng/ml的前述裂解物；及/或-VEGF,其濃度為低于O. lng/ml的前所述裂解物，更優(yōu)選為低于O. O lng/ml的所述裂解物 '及/或-TGF- β，其濃度為高于50ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于100ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于150ng/ml的前所述裂解物，更優(yōu)選為高于200ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于250ng/ml的所述裂解物；及/或-EGF,其濃度為高于O. 5ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于lng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于I. 5ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于2ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于2. 5ng/ml的所述裂解物；及/或-IGF，其濃度為高于20ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于50ng/ml的所述裂解物，更優(yōu)選為高于100ng/ml的所述裂解物。本發(fā)明的又一目的是通過(guò)本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，或是本發(fā)明的含有病毒去活化且I3DGF及VEGF耗盡的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物的用途；其是用于促進(jìn)骨骼再生或重建，或用于治療骨折骨。本發(fā)明的再一目的是通過(guò)本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，或是本發(fā)明的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途；其是用于試管內(nèi)(in vitro)或活體外(ex vivo)的細(xì)胞培養(yǎng)；優(yōu)選為用于促進(jìn)干細(xì)胞増殖及/或分化。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有生長(zhǎng)因子的血小板裂解物是用于促進(jìn)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞系及/或軟骨細(xì)胞。


圖I :富含TGF- β I且TOGF-AB及VEGF耗盡的生長(zhǎng)因子混合物的制備方法。圖2 S/D-PC-0(a)及每20mL的S/D_PC_0(即在油萃取后回收的水性蛋白相)以
I.5g (b)、3g (c)、3· 5g (d)及 4g (e)經(jīng)活化的活性碳處理后的 PDGF-AB (A) ,VEGF (B)、EGF (C)、IGF-I (D)及 TGF- β I (E)含量。圖3 :在未還原(A)及還原(B)條件下對(duì)血小板流析物所進(jìn)行的SDS-PAGE分析，包括起始PC(第I行)、經(jīng)溶劑-清潔劑處理及一次油萃取后(S/D-PC-0 ;第2行)、經(jīng)活性碳吸收后(S/D-PC-0C ;第3行)。Novex鮮明預(yù)染蛋白標(biāo)記(M)。a :纖維蛋白原；b IgG ；c 白蛋白；d :纖維蛋白原次單兀；e IgG重鏈；f IgG輕鏈。圖4:在添加 10% (v/v) FBS (a)與未添加 FBS (b)、以及添加了 I % (c),3% (d),5%(e)及10% (f)的S/D-PC-0C的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MG63 (A)及SIRC⑶細(xì)胞株的MTS細(xì) 胞增殖數(shù)據(jù)。培養(yǎng)5天后測(cè)定細(xì)胞存活率。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的之ー是ー種制備含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的方法，其包含下列步驟使起始血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑接觸；使所述起始血小板濃厚液與所述溶劑及/或清潔劑共同培養(yǎng)一段至少5分鐘至6小時(shí)的時(shí)間，其pH值維持在從約6. O至約9. O的范圍內(nèi)，且其溫度是在從2°C至50°C的范圍內(nèi)；通過(guò)油萃取來(lái)移除所述溶劑及/或清潔劑，以得到一水性蛋白相；以及將所述水性蛋白相與活性碳共同培養(yǎng)，或通過(guò)將經(jīng)溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液?jiǎn)闻c活性碳共同培養(yǎng)來(lái)移除溶劑及/或清潔劑。本發(fā)明使用了“病毒去活化的”的用語(yǔ)，其是指實(shí)質(zhì)上不帶有感染性病毒的含有生長(zhǎng)因子的血小板裂解物，特別是脂質(zhì)包膜病毒，例如人類免疫不全病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、西尼羅病毒(WNV)、TT病毒、登革熱病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、Epstein Barr病毒(EBV)、人類皰疹病毒_8 (HHV-8)、猴泡沫病毒、嚴(yán)重急性呼吸道癥候群病毒(SARS冠狀病毒)、HlNI及其它流感病毒；以及其它脂質(zhì)包膜病毒，例如反轉(zhuǎn)錄病毒、肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒、乳酸脫氫酶病毒、皰疫群病毒(Herpes group virus)、棒狀病毒(rhabdovirus)、白血病病毒(Ieukovirus)、黏液病毒、α病毒、蟲(chóng)媒病毒(arbovirus)、苜Ij黏液病毒、沙狀病毒(arenavirus)及冠狀病毒?！皩?shí)質(zhì)上不帶有”是指血小板生長(zhǎng)因子制備物的病毒去活化程度至少大于41ogl0，這是強(qiáng)力病毒減毒步驟所定出的標(biāo)準(zhǔn)，由歐洲醫(yī)藥產(chǎn)物評(píng)量機(jī)構(gòu)(European Agencyfor the Evaluation of Medicinal Products, EMEA)的專利醫(yī)藥產(chǎn)物委員會(huì)(Committee forproprietary medicinal products, CPMP)在病毒批核研究基準(zhǔn)(Note for guidance on virusvalidation studies)定出(參考文獻(xiàn) CPMP/BWP/268/95)，且更優(yōu)選為大于51ogl0或更進(jìn)ー步大于61ogl0，因此，它不大可能會(huì)在輸血給患者時(shí)造成脂質(zhì)包膜病毒的血源性感染。本發(fā)明使用了 “TOGF及VEGF耗盡” ー詞，其是指該含有生長(zhǎng)因子的血小板裂解物實(shí)質(zhì)上不含 F1DGF(platelet derived growth factor)及 VEGF(vascular endothelialgrowthfactor)。 在ー特別實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物中的PDGF-AB濃度是低于10ng/ml的裂解物，優(yōu)選為低于5ng/ml的裂解物，更優(yōu)選為低于3ng/ml的裂解物。在一特別實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物中的VEGF濃度是低于O. lng/ml的裂解物，優(yōu)選為低于O. O lng/ml的裂解物。本發(fā)明亦使用了 “經(jīng)活化的活性碳”、“經(jīng)活化的碳”或“活性碳”幾個(gè)詞，其均是指ー經(jīng)處理而非常多孔的形式的碳。因此，經(jīng)活化的活性碳其有非常大的表面積，能提供非常重要的吸收能力。經(jīng)活化的活性碳一般是制自碳源材料，如堅(jiān)果殼、泥炭(peat)、木頭、椰棕(coir)、褐煤(lignite)、煤(coal)及石油浙青(petroleumpitch)。其可用多種方法得到，包含物理性再活化(使用氣體來(lái)使前趨物轉(zhuǎn)變?yōu)榻?jīng)活化的活性碳)及化學(xué)性活化(在碳化作用前將特定化學(xué)物質(zhì)注入原始材料，例如酸、強(qiáng)堿或鹽)。經(jīng)活化的活性碳可以整塊使用，或包在市售濾筒中使用。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，在本發(fā)明中使用的經(jīng)活化的活性碳是由蒸氣及/或化學(xué)處理得到的經(jīng)活化的活性碳粉末?；钚蕴嫉目紫抖瓤蔀槲⒖?孔徑范圍< 10nm)、中孔(孔徑 范圍10-25nm)或大孔(孔徑范圍> 25nm)、或其組合。來(lái)源與處理方式的不同可能會(huì)影響最后所得的孔隙度。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，經(jīng)活化的活性碳的等級(jí)及/或孔隙度要能夠留置溶劑、清潔劑、TOGF及VEGF。適用于本發(fā)明的方法的經(jīng)活化的活性碳可能來(lái)自多個(gè)供貨商，如已預(yù)先包裝的活性碳濾筒、3M/CUN0(CUN0的經(jīng)活化的活性碳)及Pall (經(jīng)活化的活性碳AKS)。當(dāng)使用3M/CUN0的經(jīng)活化的活性碳時(shí)，優(yōu)選為使用(孔隙度)等級(jí)5的經(jīng)活化的活性碳。進(jìn)ー步言之，孔隙度為5的3M/CUN0等級(jí)5經(jīng)活化的活性碳在移除溶劑、清潔劑、PDGF及VEGF的效果方面要比孔隙度為2、3及4的來(lái)得好。同樣地，當(dāng)使用Pall的經(jīng)活化的活性碳時(shí)，AKS等級(jí)6會(huì)比AKS 7和4來(lái)得好，因?yàn)樗峁┝溯^好的溶劑、清潔劑、PDGF及VEGF移除效果。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的經(jīng)活化的活性碳可吸收在從100g/m2至550g/m2范圍內(nèi)的甲基藍(lán)，在ー實(shí)施方式中，可吸收在300g/m2至500g/m2,或在另ー實(shí)施方式中，可吸收100g/m2至300g/m2(甲基藍(lán)近來(lái)是用作測(cè)量經(jīng)活化的活性碳的吸收能力的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。亦可依照待處理的流體的黏度來(lái)選擇活性碳；優(yōu)選為針對(duì)低黏度流體(如黏度低于20cp)設(shè)計(jì)的活性碳。ー種可使用的特殊活性碳為CUNO R55，其中第一個(gè)5是指過(guò)濾精度(filtrationrating,與黏度有關(guān))，第二個(gè)5則是指碳的等級(jí)。“清除溶劑及/或清潔劑”的說(shuō)法是指含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物中的溶劑及/或清潔劑的量極低，且優(yōu)選為無(wú)法偵測(cè)。確實(shí)，所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知溶劑及/或清潔劑濃度升高與長(zhǎng)期毒性是有直接聯(lián)系的，且特別是與神經(jīng)性病癥的發(fā)生有直接聯(lián)系(如揭不于J. P. R. Pelletier, S. Transue, E. L. Snyder. Pathogen inactivationtechniques. Best Practice&Research Clinical Haematology Vol. 19,No. l,pp. 205-242,
2006) o因此，溶劑量“極低”的說(shuō)法是指在本發(fā)明中的溶劑量小于lOOppm，優(yōu)選為小于50ppm,優(yōu)選為小于20ppm,更優(yōu)選為小于lOppm、小于5ppm,且再更優(yōu)選為小于lppm。進(jìn)ー步來(lái)說(shuō)，清潔劑量“極低”的說(shuō)法是指在本發(fā)明中的清潔劑量小于500ppm，優(yōu)選為小于250ppm,優(yōu)選為小于IOOppm,更優(yōu)選為小于50ppm,且再更優(yōu)選為小于lOppm。
本發(fā)明或通過(guò)本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物至少包含下列功能性生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)形生長(zhǎng)因子(TGF-β )超級(jí)家族，其特別包含TGF-β I及/或TGF-β 2 ;胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF);表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有生長(zhǎng)因子的血小板裂解物進(jìn)ー步包含堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。在一特別實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物中的TGF-β I濃度至少與起始血小板濃厚液中的類似，優(yōu)選為高于50ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于100ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于150ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于200ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于250ng/ml裂解物。在一特別實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物中的IGF濃度至少與起始血小板濃厚液中的類似，且優(yōu)選為高于20ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于50ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于100ng/ml裂解物。 在一特別實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物中的EGF濃度為高于O. 5ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于lng/ml裂解物，優(yōu)選為高于I. 5ng/ml裂解物，優(yōu)選為高于2ng/ml裂解物，且優(yōu)選為高于2. 5ng/ml裂解物。在一特別實(shí)施方式中，本發(fā)明或通過(guò)本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物不會(huì)引起血液細(xì)胞相關(guān)的輸血反應(yīng)。“血液細(xì)胞相關(guān)的輸血反應(yīng)”是指這種含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物不帶有完整的活細(xì)胞(例如紅血球、血小板及白血球)，故可避免在患者身上引起一定范圍的已知輸血反應(yīng)，包括免疫(如異體免疫(Alloimmunization))及溶血性并發(fā)癥(如參見(jiàn)Stroncek et Rebulla,“Platelettransfusions，，，The Lancet,August 4,2007 ；vol. 370 :427-438) 確實(shí)，免疫能力正常的受贈(zèng)者通常會(huì)對(duì)捐贈(zèng)者的血液細(xì)胞抗原表現(xiàn)出免疫反應(yīng)，而引起多種取決于相關(guān)血液細(xì)胞及特異抗原的臨床結(jié)果。最普遍的相關(guān)抗原是選自下列種類(I)第一型HLA，血小板及白血球共有者；(2)第二型HLA，在某些白血球有表現(xiàn)者；(3)顆粒性白血球特異抗原；(4)血小板特異抗原(舉例來(lái)說(shuō)，如人類血小板抗原HPA);以及(5)紅血球特異抗原。在一特別實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物是從AB血型供血者的血小板濃厚液制得，故不含抗-A血凝素或抗-B血凝素的抗體，從而特別是避免受血者可能會(huì)發(fā)生的溶血反應(yīng)。在另ー特別實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物是從特定血型的血小板濃厚液制得，而用于與供血者相同血型的患者，其中所述血小板濃厚液是得自小族群的供血者(如A族群或B族群)的供血者。更特定言之，在本發(fā)明的制備方法中，活的血液細(xì)胞(紅血球、白血球及血小板)會(huì)被溶剤-清潔劑摧毀/溶胞，從而減少(且更佳為預(yù)防)患者暴露于外來(lái)抗原及完整血液細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。故本發(fā)明的方法可從由患者得到的血小板(用來(lái)治療患者本身)、或從同種異體的血小板來(lái)制備含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物。在另ー實(shí)施方式中，通過(guò)本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物進(jìn)ー步包含免疫球蛋白，如IgG、IgM及/或IgA。在ー特別實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物中免疫球蛋白IgG的濃度較佳為高于5g/L裂解物，且更佳為約8g/L裂解物。在另ー實(shí)施方式中，通過(guò)本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物可進(jìn)ー步額外進(jìn)行純化步驟，例如離子交換層析，以移除免疫球蛋白，例如IgG、IgM 及/或 IgA0在另ー實(shí)施方式中，本發(fā)明或通過(guò)本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物包含白蛋白、纖維蛋白原及凝血酶原當(dāng)中至少ー種。在一特別實(shí)施方式中，本發(fā)明的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物中的白蛋白濃度優(yōu)選為聞?dòng)?0g/L裂解物。在另ー實(shí)施方式中，本發(fā)明或通過(guò)本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物進(jìn)ー步包含α I-抗胰蛋白酶(α Ι-antitrypsin)、α2_抗胞楽;素(a 2-antiplasmin)、α 2-巨球蛋白(a 2-macroglobulin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)、纖維黏連蛋白(fibronectin)及 C1-INH。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑于本發(fā)明的方法進(jìn)行培養(yǎng)的時(shí)間范圍為從2至4小時(shí)，其是于生理pH值下進(jìn)行，如在從pH 7. O至pH 7. 5范圍內(nèi)·的PH值(當(dāng)起始血小板為新鮮的血小板吋)、或在從pH 6. 8至8. 2范圍內(nèi)的pH值(當(dāng)起始血小板為過(guò)期及/或冷凍血小板吋)進(jìn)行。有利的是，培養(yǎng)溫度為約31°C。在本發(fā)明的方法中所使用的合適溶劑為ニ -或三烷基磷酸酯類，如三-(η- 丁基)磷酸酯、三-(t-丁基)磷酸酯、三-(η-己基)磷酸酯、三-(2-こ基己基)磷酸酯、三-(η-癸基)磷酸酯、ニ-(η-丁基)磷酸酯、ニ-(t-丁基)磷酸酯、ニ-(η-己基)磷酸酯、ニ-(2-こ基己基)磷酸酯、ニ-(η-癸基)磷酸酯及具有不同烷基鏈的ニ烷基磷酸酯類?？墒褂镁哂胁煌榛湹磨嘶蛉榛姿狨ヮ?，例如ニ-(η-丁基)磷酸こ酷。特別優(yōu)選的三烷基磷酸酯為三-(η- 丁基)磷酸酯(TnBP)。在本發(fā)明的方法中所使用的合適清潔劑包括脂肪酸的聚氧こ烯衍生物、山梨糖醇酐的偏酯類(partial esters)(例如品名為“Tween 80” (也稱為“聚山梨醇酯80(polysorbate80) ”)、“Tween 20”的市售產(chǎn)品)及非離子性清潔劑(如以下列品名販賣的氧こ基化的烷基酚“Triton X-100”或“Triton X_45”)。進(jìn)ー步考慮的清潔劑是脫氧膽酸鈉及磺基甜菜堿類，如N-十二基-N，N- ニ甲基-2-銨-I-こ烷磺酸鹽(N-dodecyl-N，N-dimethyl-2-ammonio-l-ethane sulphonate)。特別優(yōu)選的清潔劑為 “Triton X-45”、“TritonX-100，，、“Tween 80”及“Tween 20”。在本發(fā)明的特別實(shí)施方式中，起始血小板濃厚液是與溶劑及清潔劑共同培養(yǎng)，優(yōu)選為與TnBP及Triton X-45共同培養(yǎng)。有利的是，所述溶劑或所述清潔劑的最終濃度、或所述溶劑及所述清潔劑的個(gè)別最終濃度是包含于從0. 2至5體積％的范圍內(nèi)，優(yōu)選為包含于從0. 2至2體積％的范圍內(nèi)，其是以所述血小板濃厚液的體積為基礎(chǔ)計(jì)算。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述起始血小板濃厚液是與2% TnBP共同培養(yǎng)。在另ー優(yōu)選實(shí)施方式中，所述起始血小板濃厚液是與1% TnBP及1% Triton X-45共同培養(yǎng)。所述溶劑及/或清潔劑可通過(guò)以醫(yī)藥等級(jí)油進(jìn)行油萃取及活性碳萃取、或僅通過(guò)活性碳萃取而從生物性流體中萃出，如此則留存的裂解物中的溶劑及/或清潔劑已被耗盡。所述醫(yī)藥等級(jí)油可以是天然油(例如從植物或動(dòng)物萃取出來(lái)的油)或結(jié)構(gòu)類似的合成化合物。合適的天然油包括蓖麻油(castor oil,或稱ricinus oil)、大豆油、葵花油、棉籽油。優(yōu)選的合成化合物為合成性三酸甘油酷。合適的合成性三酸甘油酯范例包括三油精(triolein)、三硬脂精(tristearin)、三棕櫚精(tripalmitin)、三肉宣蘧精(trimyristin)、及其組合。醫(yī)藥等級(jí)油的量為可萃取至少80%脂溶性エ藝化學(xué)物質(zhì)(process chemical)的量，所用油量為從2至20重量％，其是以血小板濃厚液的重量為基礎(chǔ)計(jì)算；優(yōu)選為從5至15重量％，且更優(yōu)選為從5至10重量％?；钚蕴驾腿】捎们拔乃龅慕?jīng)活化的活性碳來(lái)進(jìn)行，所述活性碳可吸收并留置溶劑及/或清潔劑粒子?；钚蕴驾腿】煞峙M(jìn)行(即將活性碳與油萃取后回收的水性蛋白相混合)或在管柱中進(jìn)行(使水性蛋白相通過(guò)前置沉淀活性碳(preably sedimentedcharcoal))，或者透過(guò)預(yù)先填充的市售筒匣來(lái)進(jìn)行。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，活性碳萃取為分批進(jìn)行。
在一優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)在與經(jīng)活化的活性碳共同培養(yǎng)之前進(jìn)行油萃取時(shí)，用以進(jìn)行活性碳萃取的經(jīng)活化的活性碳用量為從50至250g/l水性蛋白相，優(yōu)選為從55至200g/l水性蛋白相，或從60至150g/l水性蛋白相，或從65至100g/l水性蛋白相。在一更一優(yōu)選實(shí)施方式中，用以進(jìn)行活性碳萃取的經(jīng)活化的活性碳用量為75g/l水性蛋白相，其中水性蛋白相是在油萃取后回收得到。在另ー優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)在與經(jīng)活化的活性碳共同培養(yǎng)之前不進(jìn)行油萃取吋，用以進(jìn)行活性碳萃取的經(jīng)活化的活性碳用量為從250至1250g/l經(jīng)溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液，優(yōu)選為從275至1000g/l經(jīng)溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液，或從300至750g/l經(jīng)溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液，或從325至500g/l經(jīng)溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，在油萃取及活性碳萃取后、或僅進(jìn)行活性碳萃取后的溶劑量為小于IOOppm,優(yōu)選為小于50ppm,優(yōu)選為小于20ppm,更優(yōu)選為小于IOppm,小于5ppm,且再更優(yōu)選為小于lppm。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，在油萃取及活性碳萃取后、或僅進(jìn)行活性碳萃取后的清潔劑量為小于500ppm,優(yōu)選為小于250ppm,更優(yōu)選為小于IOOppm,更優(yōu)選為小于50ppm,且再更優(yōu)選為小于lOppm。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可在油萃取后、或在與活性碳共同培養(yǎng)后進(jìn)一歩包含至少ー離心步驟。優(yōu)選地，該離心步驟是在油萃取及活性碳萃取后進(jìn)行，或在単獨(dú)施行活性碳萃取后進(jìn)行，以移除細(xì)胞碎片。有利的是，所述離心步驟是于800至20000Xg進(jìn)行10至30分鐘，且優(yōu)選為于IOOOOXg進(jìn)行15分鐘。 在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法亦可進(jìn)ー步包含至少ー額外步驟，其是選自層析純化及/或超濾、及/或納米過(guò)濾、及/或無(wú)菌過(guò)濾。在油及活性碳萃取、或活性碳萃取后接著可以進(jìn)行層析純化。優(yōu)選地，是將活性碳與在油萃取后回收的水性蛋白相的混合物、或活性碳與經(jīng)溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液的混合物于培養(yǎng)后進(jìn)行離心，收集上清液并將之加入層析支持物，以流析出混合物的成分，或移除某些成分?？捎玫暮线m層析管柱包含反相(疏水性交互反應(yīng))基質(zhì)、或蛋白吸附基質(zhì)如離子交換(陰離子及陽(yáng)離子)基質(zhì)及親和力(如免疫-親和カ或固定化肝素)基質(zhì)、或尺寸排除(size-exclusion)基質(zhì)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中,血小板裂解物中所包含的生長(zhǎng)因子會(huì)被留置在所用的層析支持物上，并進(jìn)一歩被合適的洗提緩沖液洗提出來(lái)。優(yōu)選地，層析條件是選自例如使層析分離/純化在可與目標(biāo)生長(zhǎng)因子的穩(wěn)定性及生理功能兼容的PH值下進(jìn)行，如實(shí)質(zhì)為中性的PH值，如此則可避免生長(zhǎng)因子變性。充填、清洗及洗提的條件是由發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員依其一般常識(shí)來(lái)決定。在通過(guò)油及活性碳萃取或單由活性碳萃取來(lái)移除溶劑及/或清潔劑后，可進(jìn)ー步加入ー步驟，來(lái)使非包膜病毒(如小病毒B19、或者也可能是A型肝炎病毒(HAV))去活化或?qū)⒅瞥?，例如納米過(guò)濾，且更特別是使用75-nm、35-nm、20-nm、15-nm或10-nm孔徑的濾膜來(lái)進(jìn)行納米過(guò)濾。在一特別實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法中用作起始材料的血小板濃厚液是單ー或混合(pooled)的標(biāo)準(zhǔn)血小板濃厚液，例如制備作輸血用途的血小板濃厚液。血小板濃厚液亦可得自全血的血沉棕黃層分離法。一単位得自血沉棕黃層的血小板濃厚液一般為30至50ml。得自血沉棕黃層的血小板可用作起始材料，其為單ー単位或多個(gè)單ー單位的混合，如在形成一治療性單位時(shí)，其為4至6個(gè)單ー單位的混合(如Council of Europe 所編輯的 Guide to the preparation, use and quality assurance of bloodcomponents_13thedition (2007)中的揭不)。血小板濃厚液可通過(guò)血液分離術(shù)、細(xì)胞分離術(shù)(cytapheresis)或血小板分離術(shù)(plateletpheresis)標(biāo)準(zhǔn)程序(如參見(jiàn) Council of Europe 所編輯的 Guide to thepreparation,use and quality assurance oi blood components,13th edition(2007),)得至1J，且可通過(guò)使用 MCS+(Haemonetics)、Trima Accell 或 COBE Spectra(Gambro)或Amicus(Baxter)而得到。與透過(guò)血沉棕黃層分離法程序所得者相較之下，血小板分離術(shù)ー般會(huì)從每個(gè)捐贈(zèng)者身上得到較大的體積(相當(dāng)于300ml血小板濃厚液)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包含一制備起始血小板濃厚液的初步步驟。有利的是，制備起始血小板濃厚液的方法包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)血庫(kù)程序(如血小板分離術(shù)或透過(guò)全血捐輸?shù)难“逯苽浞?及重點(diǎn)照護(hù)程序(如那些使用血球保存剤/分離器或桌上裝置者)。在本發(fā)明的方法中，用作起始材料的血小板濃厚液可以是新鮮(即收集后少于5或7天)、過(guò)期(即收集后多于5或7天)、或過(guò)期且冷凍于_20°C或以下數(shù)周的時(shí)間。在一特別實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法中用作起始材料的血小板濃厚液可進(jìn)ー步包含白血球及/或紅血球。故該起始血小板濃厚液可能包含數(shù)種已分化且未活化的白血球,如淋巴細(xì)胞、嗜中性的顆粒性白血球及單核球。更特定言之,嗜中性球及單核球富含內(nèi)有骨髓過(guò)氧化酶(myeloperoxidase)的顆粒,這種酶會(huì)催化氯化物的氧化作用，而生成次氯酸(hypochlorous acid)及其它反應(yīng)性氧衍生物，其中所述反應(yīng)性氧衍生物是作為殺菌氧化劑，對(duì)微生物及霉菌具有毒性。因此，當(dāng)起始血小板濃厚液包含數(shù)種已分化且未活化的白血球時(shí)，通過(guò)本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物進(jìn)ー步包含抗微生物成分及多種源自白血球的生長(zhǎng)因子。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，用作起始材料的血小板濃厚液中的白血球會(huì)被消滅，優(yōu)選為通過(guò)白血球去除作用(Ieukoreduction)來(lái)進(jìn)行，以避免白血球中的蛋白酶及酸水解酶發(fā)生促發(fā)炎反應(yīng)。白血球去除作用也可降低普利子蛋白(prion)污染的風(fēng)險(xiǎn)。健康人的正常血小板計(jì)數(shù)一般為每mm3血液中包含150000至400000個(gè)血小板，亦即150至400 X IO9個(gè)血小板/し這個(gè)“正常”血小板計(jì)數(shù)在約95%健康人身上是如此，而剩下的5%可能會(huì)有統(tǒng)計(jì)上不正常的血小板計(jì)數(shù)(非常低或非常高)。當(dāng)以血小板分離術(shù)收集血小板時(shí)，在一袋250ml當(dāng)中的血小板計(jì)數(shù)一般是高于每ml有I. 2X IO9個(gè)血小板，其血小板計(jì)數(shù)相當(dāng)于每袋(単位)有多于約3X IO11個(gè)血小板。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，起始血小板濃厚液中血小板的數(shù)目比血液中通常的數(shù)目高出3至10倍。本發(fā)明或通過(guò)本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物可與人工支架(例如以膠原蛋白、幾丁聚醣(chitosan)、陶瓷所制造者)混合，或與得自血 漿的纖維蛋白黏膠或纖維蛋白密封劑混合；舉例來(lái)說(shuō)，其可用于治療目的，即治療性或預(yù)防性的處理，用于在人類及/或動(dòng)物身上治療適應(yīng)癥，而透過(guò)醫(yī)藥、免疫或代謝效用來(lái)回復(fù)、修正或改變其生理功能。本發(fā)明或通過(guò)本發(fā)明的方法所得的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物特別適用于處理人類及/或動(dòng)物的病癥、及/或用干與其身體的體表部分接觸，這是因?yàn)樗娜軇┘扒鍧崉┒家驯磺宄?，且具有病毒安全性。亦可在含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物中加入額外的化合物，其包含但不限于化療劑、抗生素及/或激素。本發(fā)明的另一目的是ー種本發(fā)明或通過(guò)本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物干治療性應(yīng)用及于試管內(nèi)或活體外的細(xì)胞培養(yǎng)的用途。當(dāng)其用于在試管內(nèi)或活體外的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明或通過(guò)本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物存在于培養(yǎng)基中的量是在培養(yǎng)基體積的從1%至30%范圍內(nèi)，優(yōu)選為從2%至20%范圍內(nèi)，又更優(yōu)選為從3%至10%范圍內(nèi)。本發(fā)明的另一目的是ー種醫(yī)藥產(chǎn)品及/或美容產(chǎn)品，其包含本發(fā)明或通過(guò)本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物?！搬t(yī)藥產(chǎn)品”是指血小板凝膠(platelet gel)、血小板黏膠(platelet glue)、富含生長(zhǎng)因子的纖維蛋白黏膠及/或密封劑(sealant)、人工支架。“美容產(chǎn)品”是指數(shù)種施用于人體的制劑當(dāng)中的任ー種，其用于美化、保存或改變外表、或清潔、著色、調(diào)理或保護(hù)皮膚、頭發(fā)、指甲、嘴唇、眼睛或牙齒。本發(fā)明的另一目的是ー種本發(fā)明或通過(guò)本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物于細(xì)胞培養(yǎng)的用途，其是適用于在試管內(nèi)或活體外培養(yǎng)纖維母細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞(keratinocytes)、干細(xì)胞及/或移植細(xì)胞(transplantscells)。本發(fā)明的另一目的是適用于在試管內(nèi)或活體外培養(yǎng)纖維母細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞及/或移植細(xì)胞的培養(yǎng)基，且包含本發(fā)明或通過(guò)本發(fā)明的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物的用途是用于促進(jìn)干細(xì)胞的繁殖及/或分化，特別是間質(zhì)干細(xì)胞。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物的用途是用于促進(jìn)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞系及/或軟骨細(xì)胞系。
本發(fā)明的另一目的為ー種本發(fā)明含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，其是用于促進(jìn)骨骼重建、骨骼再生或傷ロ療愈，以及美容用途。本發(fā)明的上述及其它目的、特征及優(yōu)點(diǎn)將因以下敘述、參考文獻(xiàn)及后附圖式而變得更加顯明。實(shí)施例I.材料與方法I.分離術(shù)血小板(apheresis platelet)的收集起始血小板濃厚液(PC)是征得志愿捐贈(zèng)者同意后使用MCS+多成分系統(tǒng)(Haemonetics, Braintree, USA)收集而來(lái)。全血是透過(guò)使用間歇性流動(dòng)(intermittent flow)的靜脈導(dǎo)管取得，并立即以1/9的比例用檸檬酸右旋葡萄糖溶液配方A(citratedextrosesolution Formula A)進(jìn)行抗凝血處理。通過(guò)連續(xù)離心,使血小板與紅血球及其它血液成分分離，并懸浮于血漿中，再收集到無(wú)菌容器內(nèi)。進(jìn)行數(shù)個(gè)分離循環(huán)，直到所收集的PC的總體積達(dá)到在225及315mL之間的體積范圍為止，預(yù)定的血小板產(chǎn)量目標(biāo)是等于或大于3. OX 1011。PC是于室溫緩慢混合儲(chǔ)存，并在收集的24至72小時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理。2.細(xì)胞計(jì)數(shù)紅血球、血小板及白血球在起始PC中的含量是使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器(ABC VetAutomaticBlood Counter, ABX Diagnostics, Franceノ 來(lái)測(cè)足。3.起始血小板濃厚液的處理a.研究設(shè)計(jì)起始血小板濃厚液是根據(jù)圖I的研究設(shè)計(jì)來(lái)處理。簡(jiǎn)言之，將PC (300mL)移入塑料袋，并如EP 1，685，852所述進(jìn)行處理。將血漿濃厚液(plasma concentrates)與 1% (v/v)(終濃度)三正丁基憐酸酯(TnBP) (MerckKGaA,Darmstadt, Germany)及 I % (v/v)(終濃度)Triton X-45 (Sigma, Missouri, USA)的組合于室溫(RT)恒定溫和攪拌(70rpm) (FINEPCR, Seoul, Korea)的條件下共同培養(yǎng)I小時(shí)。之后加入10% (v/v)(終濃度)大豆油(Sigma, Missouri, USA),先劇烈混合30秒，之后與經(jīng)S/D處理的PC(S/D-PC)于室溫(RT)在70rpm混合15分鐘。之后將該油/S/D-PC混合物倒出45分鐘，以分離出清澈的油相(頂部)、濁相(turbidphase)(中間)及一清澈的水性蛋白相(底部)。通過(guò)重力從袋子底部回收水性蛋白相(約2701^)，并于20-25^在6000父8離心10分鐘使之澄清，并使細(xì)胞碎片或不溶材料沉淀成團(tuán)塊狀。在離心后，回收上清液(S/D-PC-0，約265mL)并于RT在70rpm與回收19. 9g經(jīng)活化的活性碳(3M，St. Paul, MN, USA)混合30分鐘，其對(duì)應(yīng)比例為I. 5g/20mL的S/D-PC-0。之后將混合物離心(6000 X g，10分鐘，RT)而使活性碳沉淀成團(tuán)塊狀，并回收澄清的上清液(S/D-PC-0C)。使樣本經(jīng)此方法處理并于_80°C冷凍，直到要進(jìn)行分析為止。所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)為四次或五次重復(fù)的平均圖形。4.活性碳比例的影響進(jìn)行小規(guī)模預(yù)先實(shí)驗(yàn)，決定要用來(lái)移除TnBP及Triton X_45的活性碳的最適量，并評(píng)估它對(duì)GF及蛋白含量的影響。使用旋轉(zhuǎn)混合器將用量遞增的活性碳(1.5至4め與5/D-PC-O (20mL)于RT在70rpm混合30分鐘。之后將混合物離心(6000 X g, 10分鐘，RT)，使活性碳沉淀成團(tuán)塊狀并回收澄清的上清液，再將之于-30°C冷凍，直到進(jìn)行評(píng)估為止。
5.生長(zhǎng)因子測(cè)定在程序的各個(gè)步驟中取出I-ml樣本。將之于10000 Xg離心15分鐘(Microfuge 22R, Beckman Coulter, Fullerton, CA),使血小板及/或細(xì)胞碎片沉淀成團(tuán)塊狀,并得到無(wú)細(xì)胞的上清液來(lái)進(jìn)行血小板源生長(zhǎng)因子的測(cè)量。之后上清液立即于_80°C冷凍。樣本于37°C解凍，并在I小時(shí)內(nèi)以敏感且具專一性的市售免疫測(cè)定法進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進(jìn)行二重復(fù)測(cè)定，并計(jì)算平均值。結(jié)果乘以樣本所用的稀釋系數(shù)。PDGF-AB.TGF-β I、EGF、VEGF及 IGF-1 是特別使用 Quantikine 套組(R&D Systems ；Minneapolis, MN)來(lái)進(jìn)行ELISA測(cè)定而進(jìn)行量測(cè)。a. PDGF-AB使用Quantikine ELISA kit (#· DHD00B，R&D SYSTEMs, Minneapolis, MN)來(lái)測(cè)定PDGF-AB0樣本以Calibrator稀釋劑(RD6-11)稀釋100倍。將孔盤培養(yǎng)2小時(shí)、清洗、并和與酶共軛結(jié)合的I3DGF-AB抗體于室溫再共同培養(yǎng)3小吋。使用清洗緩沖液(WashBuffer)來(lái)清洗盤孔，之后于室溫加入基質(zhì)溶液(Substrate Solution) 20-30分鐘。盤孔為避光保護(hù)。在各盤孔中加入停止溶液(Stop Solution)，并使用微滴定盤讀取儀來(lái)測(cè)定450nm的吸光值。最小可偵測(cè)的劑量為1.7pg/ml。b.TGF-βΙ使用Quantikine ELISA kit (DB100B，R&D SYSTEMs)來(lái)測(cè)定 TGF-β I。樣本以Calibrator稀釋劑(RD5-26)稀釋100倍。在涂覆有TGF-β -受器II的96孔微滴定盤中制備體積為100-μ I的TGF-β I標(biāo)準(zhǔn)品(890207)稀釋序列。在TGF-β I分析之前，進(jìn)行酸活化及中和反應(yīng)，以將潛性TGF-β I活化到免疫活性形成狀態(tài)。為達(dá)此目的，將0. 5ml樣本與0. Iml 的 IN HCl 混合，于室溫培養(yǎng) 10 分鐘，加入 0. Iml 的 I. 2N Na0H/0. 5MHEPES(N_[2_ 羥基こ基]哌-N0-[2-こ烷磺酸])(Sigma, H-7523)加以中和，再行離心。之后測(cè)定上清液部分的總TGF-βΙ含量。將各等分(50μ1)以二重復(fù)的方式加到微滴定盤中，之后蓋上蓋子，于室溫培養(yǎng)2小吋。之后清洗盤孔，加入與酶共軛結(jié)合的TGF-β I多株抗體，并于室溫持續(xù)培養(yǎng)I. 5小吋。如前述完成測(cè)量。TGF-β I的偵測(cè)限值為4. 61pg/ml。c. EGF使用Quantikine ELISA kit(#. DEG00, R&D SYSTEMs, Minneapolis, MN)來(lái)測(cè)定EGF。樣本以Calibrator稀釋劑(RD6N)稀釋20倍。將200 μ I的標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品或樣本加入盤孔中。將孔盤于室溫培養(yǎng)2小吋。各盤孔經(jīng)過(guò)抽吸，并填入清洗緩沖液來(lái)加以清洗。在各盤孔中加入EGF共軛結(jié)合物，并于室溫培養(yǎng)2小吋。使用清洗緩沖液清洗盤孔，并在各盤孔中加入基質(zhì)溶液(200 μ I)。混合物于室溫避光培養(yǎng)20分鐘。在各盤孔中加入停止溶液(50 μ I)。各盤孔的光學(xué)密度是使用微孔盤讀取儀(VersaMax microplate reader,Molecular Devices, USA)在30分鐘內(nèi)于450nm進(jìn)行測(cè)定。最小可偵測(cè)的劑量為0. 7pg/ml οd. VEGF使用Quantikine ELISA kit (#DVE00, R&D Systems, Minneapolis, MN)來(lái)定量VEGF0樣本以Calibrator稀釋劑(RD6U)稀釋2倍。如制造商所說(shuō)，其最小可偵測(cè)的劑量范圍為小于9. 0pg/ml，且平均MDD為50ng/ml。在各盤孔中加入100 μ I的測(cè)定稀釋劑(RDlW)，接著是100 μ I的標(biāo)準(zhǔn)品(VEGF標(biāo)準(zhǔn)品)。以黏膠條覆蓋孔盤，并于室溫培養(yǎng)2小吋。將盤孔清洗3次，之后和與酶共軛結(jié)合的VEGF于室溫共同培養(yǎng)2小吋。e. IGF-I·使用Quantikine ELISA kit (DG100，得自 R&D SYSTEMs)來(lái)定量 IGF-1。樣本以Calibrator稀釋劑(RD5-22)稀釋100倍。如制造商所說(shuō)，其最小可偵測(cè)的劑量范圍為從O. 007至O. 056ng/ml，且平均MDD為O. 026ng/ml。在各盤孔中加入150 μ I的測(cè)定稀釋劑0 1-53)，接著是5(^1的標(biāo)準(zhǔn)品(890775)。以黏膠條覆蓋孔盤，并于2_8°C培養(yǎng)2小時(shí)。將盤孔清洗3次，之后和與酶共軛結(jié)合的IGF-I于2-8°C共同培養(yǎng)I小吋。如前述完成測(cè)量。6. P-選擇素測(cè)定使用Quantikine kits (R&D Systems)而以 ELISA 測(cè)定法來(lái)測(cè)量 P-選擇素。7.蛋白及脂質(zhì)測(cè)定在油萃取后及在活性碳吸收后，用RocheP800分析儀來(lái)測(cè)定總蛋白、白蛋白、總膽固醇及三酸甘油酯(triglycerides, TG)在起始PC中的量。IgG、IgM及IgA是在 CobasIntegra 800(Roche COBAS INTEGRA 800, RocheDiagnostics, Mannheim,Germany)使用全自動(dòng)乳膠增強(qiáng)免疫比池測(cè)定法(fully automatic latex-enhancedimmunoturbidimetricassay)來(lái)測(cè)重。8.十二燒基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDb—PAGEノSDS-PAGE是使用4_12 %梯度凝膠、反應(yīng)試劑及Invitrogen電泳系統(tǒng)(InvitrogenCorporation,Carlsbad,California,USA)在未還原與還原的條件下進(jìn)行。使用Novex Sharp Pre-Stained Protein Molecular Weight Standard (Invitrogen)來(lái)估
算分子量。9. TnBP 及 Triton X-45 測(cè)定如先前所述進(jìn)行樣本的萃取，以測(cè)定殘余的TnBP及Triton X-45 (19)。以氣相層析(GC-17A, SHIMADZU, Tokyo, Japan)及火焰離子化偵測(cè)(flame ionization detection)來(lái)進(jìn)行 TnBP 定量，另使用 LiChrospher 100RP-18 管柱(ID :4mm，長(zhǎng)度250mm，P/N :724964,Merck KGaA, Darmstadt, Germany)以高效液相層析(SHIMADZU)來(lái)進(jìn)行 TritonX-45 定量。10.細(xì)胞培養(yǎng)S/D-PC-0C在試管內(nèi)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)及取代FBS的能力是使用下列細(xì)胞株來(lái)進(jìn)行評(píng)估(a)人類成骨細(xì)胞MG63 (ATCC CRL 1427，購(gòu)自中國(guó)臺(tái)灣新竹生物資源保存及研究中心，BCRC)及(b) StatensSeruminstitute 兔角膜上皮細(xì)胞(rabbit corneal epithelialcells, SIRC) (ATCC CCL-60，購(gòu)自BCRC)。這些細(xì)胞株是維持在37°C且含有5% CO2的控制環(huán)境中。它們是以姆孔2X IO3個(gè)細(xì)胞的密度在平底96孔盤(Greiner bio-one,Tokyo, Japan)中使用最低必需培養(yǎng)基(minimum Essential medium,MEM) (Gibco, Invitrogen)進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有2. 2g的NaHC03、0. ImM非必須胺基酸、ImM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、2mM的L-麩酰胺酸(L-glutamine)、100U/mL青霉素及100 μ g/mL鏈霉素，且添加了 10 %(v/v) FBS (Gibco, Invitrogen)。在實(shí)驗(yàn)中，ー開(kāi)始是使細(xì)胞貼附18小時(shí),之后在測(cè)試不同的GF添加物之前，于無(wú)血清培養(yǎng)基中使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)6小吋。用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗兩次后，將細(xì)胞在添加了不同濃度(I至10% )的S/D-PC-OC的培養(yǎng)基(分別對(duì)應(yīng)于TGF-β終濃度在O. 31及3. lng/ml之間的范圍)培養(yǎng)高達(dá)5天的時(shí)間。每輪實(shí)驗(yàn)都以不添加任何蛋白/GF添加物或添加了 10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)作為對(duì)照組。11. MTS 測(cè)試在培養(yǎng)五天時(shí)，使用MTS四唑鎗[3-(4，5_ ニ甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)~2~ (4-橫苯基)-2H-四唑鐵，[3- (4, 5-dimethylthiazol_2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(^-sulfophenyjj-2H-tetrazolium)的內(nèi)鹽 unner;(PromegaCorporation,Madison, Wisconsin, USA)依照制造商的指示來(lái)測(cè)定目視在增生的細(xì)胞。這項(xiàng)測(cè)定使用了MTS溶液及電子稱合試劑PMS (吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate))。MTS會(huì)被細(xì)胞生物還原(bioreduced)為不溶于組織培養(yǎng)基的產(chǎn)物甲膜(formazan)。具代謝活性的細(xì)胞 當(dāng)中的去氫酶會(huì)將MTS轉(zhuǎn)換為甲臜。從96孔測(cè)定盤測(cè)量甲臜于490nm的吸光值，其與培養(yǎng)物中存活細(xì)胞的數(shù)目有直接的比例關(guān)系。制備后，將溶液保持在-20°C的避光保護(hù)管中。將MTS及PMS偵測(cè)試劑以20 KMTS PMS)比例混合后，立刻以I 5 (MTS+PMS/培養(yǎng)基)的比例加入細(xì)胞培養(yǎng)物中。12.統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(SD)來(lái)表示。并以雙尾配對(duì)學(xué)生檢定(two-tailedpairedStudent test)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)上的比較。P值小于0. 05是用來(lái)估算平均測(cè)試參數(shù)的明顯差異(the significance of the differences)。當(dāng)p值< 0. 05時(shí)，則認(rèn)為有明顯差異。II.結(jié)果I.細(xì)胞計(jì)數(shù)起始PC 平均含有 1216± 188. 6X IO6 個(gè)血小板/ml (范圍896-1388X IO6 個(gè) /ml)。白血球及紅血球的平均計(jì)數(shù)分別為0. 32 ±0. 10 (范圍0. 20-0. 4) X IO6個(gè)/ml及
O.04 + 0. 01 (范圍0. 02-0. 06) X IO9個(gè)/ml。之后進(jìn)行S/D處理的所有流析物中都偵測(cè)不到血球細(xì)胞。2.活性碳的最適比例測(cè)定預(yù)先實(shí)驗(yàn)顯示活性碳處理在所測(cè)試的各個(gè)比例都會(huì)移除S/D試劑，但也會(huì)大幅降低TOGF-AB及VEGF的含量。因此進(jìn)行下列測(cè)試將用量漸增的活性碳(I. 5、3、3. 5或4g)與20mL的S/D-PC-0混合。在所有進(jìn)行評(píng)估的比例中，殘余的TnBP均< 2ppm，而殘余的TritonX-45則分別為9、3、2及I. 5ppm。圖2顯示S/D-PC-0流析物的活性碳處理對(duì)于PDGF-AB, TGF-β I、EGF、VEGF 及 IGF-I 含量的典型影響。TGF-β I、EGF 及 IGF-I 的濃度保持基本不變，而在所有進(jìn)行評(píng)估的比例中，PDGF-AB及VEGF含量都大幅降低。每20mL的S/D-PC-O對(duì)I. 5g的活性碳的比例可讓TnBP及TritonX-45的量降低至少于IOppm,故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用該比例。3.多種流析物的組成使用19. 9g的活性碳對(duì)265mL的P/D-PC-0萃取物(對(duì)應(yīng)選擇率為I. 5g/20mL)進(jìn)行活性碳處理，其對(duì)GF、p-選擇素、蛋白、膽固醇及TG含量的影響如表I所示(4次實(shí)驗(yàn)的平均值)。在油萃取及活性碳吸收后，TGF-β I、IGF及EGF濃度保持基本恒定(分別為約368、55及2. 4ng/mL)。在S/D-PC-0C中的GF平均整體回收量相對(duì)于在S/D-PC-0中所偵測(cè)到的含量分別為TGF-e I為81. 5%，EGF為94%，而IGF為83. 8%。相對(duì)而言，PDGF及VEGF的平均濃度在活性碳處理當(dāng)中顯著降低(P < O. 01)(分別為約2. 31ng/mL及< O. 009ng/mL)，確認(rèn)了在小規(guī)模實(shí)驗(yàn)中的觀察。P-選擇素含量不會(huì)受活性碳處理的影響太多，只有輕微的降低。白蛋白、IgG、IgA、IgM的平均濃度保持基本不變，但可觀察到纖維蛋白原含量有顯著的小幅降低(P < O. 05)。膽固醇及TG平均含量保持穩(wěn)定。TnBP平均量會(huì)從約738ppm降至 8. 7ppm,而 TritonX-45 則會(huì)從 2628ppm 降至 8. 8ppm(p < O. 001)。表I經(jīng)S/D處理的血小板濃厚液在油萃取后的組成物(S/D-PC-0)及其在活性碳處理后的組成物(S/D-PC-0C) (N = 4)
權(quán)利要求
1.ー種含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且roGF及VEGF耗盡的血小板裂解物。
2.如權(quán)利要求I所述的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物，其包含生長(zhǎng)因子TGF-β、IGF 及 EGF。
3.如權(quán)利要求I或2所述的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子的血小板裂解物，其中 -PDGF-AB在所述裂解物中的濃度為低于10ng/ml，更優(yōu)選為低于5ng/ml，更優(yōu)選為低于3ng/ml ;及/或 -VEGF在所述裂解物中的濃度為低于O. lng/ml，更優(yōu)選為低于0.01ng/ml ;及/或 -TGF-β在所述裂解物中的濃度為高于50ng/ml，更優(yōu)選為高于100ng/ml，更優(yōu)選為高于150ng/ml,更優(yōu)選為高于200ng/ml,更優(yōu)選為高于250ng/ml ;及/或 -EGF在所述裂解物中的濃度為高于O. 5ng/ml，更優(yōu)選為高于lng/ml，更優(yōu)選為高于I. 5ng/ml,更優(yōu)選為高于2ng/ml,更優(yōu)選為高于2. 5ng/ml ;及/或 -IGF在所述裂解物中的濃度為高于20ng/ml，更優(yōu)選為高于50ng/ml，更優(yōu)選為高于100ng/ml。
4.一種制備含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的方法，其包含下列步驟 a)使起始血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑接觸； b)使所述起始血小板濃厚液與所述溶劑及/或清潔劑共同培養(yǎng) -一段至少5分鐘至6小時(shí)的時(shí)間， -其pH值維持在從約6. O至約9. O的范圍內(nèi)，且 -其溫度是在從2 °C至50°C的范圍內(nèi)； c)通過(guò)油萃取來(lái)選擇性移除所述溶劑及/或清潔劑，以得到一水性蛋白相；以及 d)將步驟b)的經(jīng)溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液或步驟c)的水性蛋白相與活性碳共同培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述溶劑是選自由ニ-或三-烷基磷酸酯類、具有不同烷基鏈的ニ -或三-烷基磷酸酯類所組成的群組，優(yōu)選為三正丁基磷酸酯(TnBP)。
6.如權(quán)利要求4至5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述清潔劑是選自由脂肪酸的聚氧こ烯衍生物、山梨糖醇酐的偏酯類、非離子性清潔劑、脫氧膽酸鈉及磺基甜菜堿類所組成的群組，優(yōu)選為 Triton X-45> Triton X-100 或 Tween 80。
7.如權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b)中所述溶劑及/或所述清潔劑的個(gè)別濃度范圍為從O. 2至5體積％，其是以所述起始血小板濃厚液的體積為基礎(chǔ)計(jì)算。
8.如權(quán)利要求4至7任一項(xiàng)所述的方法，其中，所得病毒去活化的生長(zhǎng)因子血小板裂解物是權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)所述的病毒去活化的生長(zhǎng)因子血小板裂解物。
9.如權(quán)利要求4至8任一項(xiàng)所述的方法，其中油萃取是以醫(yī)藥等級(jí)油來(lái)進(jìn)行，所述油的用量為從2至20重量％、或從5至15重量％或從5至10重量％ ,其是以所述血小板濃厚液與所述溶劑及/或清潔劑的混合物的重量為基礎(chǔ)計(jì)算。
10.如權(quán)利要求4至9任一項(xiàng)所述的方法，其中 -當(dāng)進(jìn)行步驟c)的油萃取時(shí)，亦對(duì)步驟c)的水性蛋白相進(jìn)行活性碳萃取，其中活性碳的量為所述水性蛋白相的從50至250g/l，優(yōu)選為從55至200g/l、或從60至150g/l、或從65至100g/l ;以及-當(dāng)不進(jìn)行油萃取吋，則對(duì)步驟b)的經(jīng)溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液進(jìn)行活性碳萃取，其中活性碳的量為所述水性蛋白相的從250至1250g/l，優(yōu)選為從275至IOOOg/I、或從 300 至 750g/l、或從 325 至 500g/l。
11.如權(quán)利要求4至10任一項(xiàng)所述的方法，其中經(jīng)活化的活性碳所吸收的甲基藍(lán)為經(jīng)活化的活性碳的從100至550g/m2范圍內(nèi)，優(yōu)選為從300至500g/m2或從100至300g/m2范圍內(nèi)。
12.如權(quán)利要求4至11任一項(xiàng)所述的方法，其在步驟c)油萃取之后、及/或在步驟d)與活性碳共同培養(yǎng)之后進(jìn)ー步包含至少ー離心步驟。
13.如權(quán)利要求4至12任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)ー步包含步驟(e):層析純化及/或超濾及/或納米過(guò)濾。
14.如權(quán)利要求4至13任一項(xiàng)所述的方法,其在步驟a)之前進(jìn)ー步包含一制備起始血小板濃厚液的初步步驟，優(yōu)選為通過(guò)血小板分離術(shù)或血沉棕黃層分離法而從全血加以制備。
15.如權(quán)利要求4至14任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟a)的起始血小板濃厚液是從混合血小板濃厚液得到。
16.ー種通過(guò)權(quán)利要求4至15任一項(xiàng)所述的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物、或權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)所述的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，其用于美容、促進(jìn)骨骼再生或重建、或治療骨折。
17.—種通過(guò)權(quán)利要求4至15任一項(xiàng)所述的方法得到的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物、或權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)所述的含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且TOGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，其用于試管內(nèi)或活體外的細(xì)胞培養(yǎng)，優(yōu)選為用于促進(jìn)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞系及/或軟骨細(xì)胞。
全文摘要
富含生長(zhǎng)因子(PGF)的人類血小板萃取物可用于傷口療愈及干細(xì)胞擴(kuò)增，近來(lái)日益受到關(guān)注。本發(fā)明關(guān)于一種含有病毒去活化的生長(zhǎng)因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物，優(yōu)選為富含TGF、IGF及EGF者。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)于一種得到上述血小板裂解物的方法，其包含下列步驟使起始血小板濃厚液與一溶劑及/或清潔劑接觸；使所述起始血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑共同培養(yǎng)一段至少5分鐘至6小時(shí)的時(shí)間，其pH值維持在從約6.0至約9.0的范圍內(nèi)，且其溫度是在從2℃至50℃的范圍內(nèi)；通過(guò)油萃取來(lái)選擇性移除上述溶劑及/或清潔劑，以得到一水性蛋白相；以及將該經(jīng)溶劑及/或清潔劑處理的血小板濃厚液或該水性蛋白相與活性碳共同培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102985101SQ201180025490
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者席耶利·布諾夫, 蘇正堯 申請(qǐng)人:國(guó)維聯(lián)合科技股份有限公司