專利名稱：用于預防和治療自身免疫疾病的tnf-a和il-21的雙重拮抗劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于預防和治療自身免疫疾病的組合物，所述組合物包含一種TNF-α和IL-21的雙重拮抗劑。2、相關技術描述免疫系統(tǒng)在保護人體免于遭受抗原這種有害的外來物質時發(fā)揮作用。這類抗原例如細菌、病毒、有毒物質、癌細胞和其他人或動物的血液或組織。免疫系統(tǒng)產生抗體來破壞這類引入的有害外來物。然而，如果免疫系統(tǒng)功能不正常，它就無法區(qū)分自己的正常健康器官和有害的外來抗原，因此它也會破壞正常組織。這種反應被稱為自身免疫疾病。這種反應顯示了過敏性的超敏反應。過敏是抵抗對人體無害的外來物時的反應，但在自身免疫疾病的情況下，反應目標包括正常組織。免疫系統(tǒng)不能區(qū)分正常器官和抗原的原因尚未知。僅有假設理論認為，在那些特定地繼承了易受到自身免疫疾病攻擊的基因的機體內，微生物如細菌或藥物可能導致這種疾病。自身免疫疾病例如橋本氏甲狀腺炎、惡性貧血、阿狄森氏病、I型糖尿病、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、干燥綜合征、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、反應性關節(jié)炎、凸眼性甲狀腺腫、和腹腔疾病一口炎性腹瀉等。治療自身免疫疾病的目的是調節(jié)自身免疫應答和恢復受損的免疫功能。治療方法可能隨自身免疫疾病的類型不同而異。例如，如果血液有問題，那么輸血是必需的。如果觀察到骨、關節(jié)或者肌肉有任何的異常，就需要體育鍛煉或其他功能治療。此外，開具藥物以便調節(jié)免疫應答。這種藥稱為免疫抑制藥，例如皮質類固醇類(如強的松)和非類固醇類(如環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤和他克莫司)等等。盡管全世界有約占地球上人口總數(shù)的1%的2100萬人患有類風濕性關節(jié)炎(RA，一種自身免疫疾病)，這種疾病的病因目前也尚未披露。這種類風濕性關節(jié)炎的癥狀是在動關節(jié)處有對稱性系統(tǒng)慢性炎癥。當它變得嚴重時，甚至會發(fā)生關節(jié)功能障礙。更嚴重的是，這種自身免疫系統(tǒng)功能不正常帶來的炎癥和疼痛不僅在關節(jié)處，也在關節(jié)周圍的其他組織以及進一步在全身的其他器官，包括肺、皮膚、以及眼睛且伴有疼痛和骨質疏松癥，導致嚴重降低生活質量，不能正常地進行日常生活。以前類風濕性關節(jié)炎的治療著重在通過改善生活習慣、外科手術、以及治療劑的給藥來延緩疾病的發(fā)展或者緩解伴隨的疼痛，其抑制了感染，但不期待關節(jié)功能的任何改善。然而，最近的治療是針對于關節(jié)功能的全面復蘇。隨著抗TNF的拮抗劑的發(fā)展，這已經成為可能，所述抗TNF的拮抗劑已被認為是用于治療類風濕性關節(jié)炎最引人注目的發(fā)現(xiàn)。腫瘤壞死因子(TNF)是多效性細胞因子，它不僅在炎癥反應中也在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。它被發(fā)現(xiàn)于類風濕關節(jié)炎患者的關節(jié)以及克羅恩氏病患者的結腸中。腫瘤壞死因子還被報道在破骨細胞中也發(fā)揮重要作用。因此，已開發(fā)的所有治療藥劑的目的均為抑制TNF活性，通過結合屬于TNF超家族的配體來精確地中斷信號轉導或者中斷TNF配體和受體之間的結合。為了抑制TNF信號轉導，已經使用了對抗TNF配體的單克隆抗體或重組蛋白。準確地說，已采用了使用單克隆抗體如英利昔單抗(Remicade)或阿達木單抗(Humira)的治療方法。也已經采用了使用重組蛋白如CTLA_4Ig或依那西普(Enbrel)的治療方法。英利昔單抗、依那西普、以及阿達木單抗是首先被認可的作為類風濕性關節(jié)炎的治療藥劑的生物藥劑，已經使用了 10年，顯示出高效率。除了 TNF，其他細胞因子也被致力于開發(fā)成一種治療藥劑。作為抑制白介素的DMARD (緩解疾病的抗風濕藥)，已經開發(fā)了以IL-6或IL-I為目標的治療藥劑。然而，治療作用不如那些抗TNF的藥劑好。盡管有很好的治療作用，抗TNF的藥劑也有許多需要克服的問題。一個例子就是 給予抗TNF的藥劑具有副作用，就是當TNF的機制停止工作時，會導致免疫系統(tǒng)功能異常，增加真菌或病毒感染的風險。尤其是，休眠肺結核復發(fā)的概率增加。此外，可能造成脫髓鞘障礙，例如多發(fā)性硬化癥或惡性血液病。根據(jù)患風濕性疾病的群體，用抗TNF的藥劑給藥的類風濕性關節(jié)炎患者比用普通治療劑治療的那些患者得皮膚癌的機率更高。在類風濕性關節(jié)炎患者中藥劑的治療作用并不完全相同。三分之二的患者顯示出治療作用，但三分之一的患者并沒有得到改善。這一結果表明治療被醫(yī)療史或遺傳因素所限制。不得不考慮和克服的不僅有疾病帶來的疼痛，而且還有伴隨治療的副作用以及安全問題。對于有類風濕性關節(jié)炎的孕婦而言，在施用抗TNF的藥劑時胎兒的安全是個問題。因此科學家擔負著開發(fā)診斷方法來預測治療作用和副作用的責任。白介素(IL)是一種細胞因子，它充當血紅細胞之間的一種化學信號。IL-2在1992年被FDA批準用于晚期肝癌的治療。當時，它是第一個單一的免疫治療劑。自此以后，IL-2也被用于治療轉移性黑色素瘤。IL-2本身用來治療癌癥或聯(lián)合疫苗治療。IL-2幫助免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用以快速生長或分化細胞。然而，也被報道有副作用如發(fā)冷、發(fā)燒和疲勞，類似伴隨發(fā)冷的癥狀以及神經錯亂。IL-15和IL-21，屬于IL-2家族，已被研究作為單一的癌癥治療藥劑或者佐劑。IL-21是一種具有α螺旋結構的細胞因子。這種細胞因子在使用IL-21受體和Y鏈進行信號轉導中誘導炎性反應。已知IL-21誘導骨髓中NK細胞前體成熟(Parrish-NovakJ等人，Nature，408:57-63，2000)。尤其是，IL-21被報道增加效應物功能，例如細胞因子的產生和 NK 細胞的凋亡活性(StrengellM 等人，J Immunol. , 170:5464-5469, 2003 ；BradyJ等人，J Immunol.，172:2048-2058,2004)。它還提高了 CD8+T細胞加速內源適應性免疫系統(tǒng)內的抗癌應答的作用(Takaki R 等人，J Immunol. , 175:2167-2173, 2005 ；Moroz A 等人，J Immunol, 173:900-909, 2004)。IL-21還被報道能活化從人外周血液分離出來的NK細胞(Parrish-Novak J等，Nature, 408:57-63，2000)并且在誘導NK細胞由造血干細胞(分離自臍帶血)成熟中發(fā)揮重要作用(SoniaA. P等人,Int. immunol. , 18:49-58，2006)。本發(fā)明人試圖開發(fā)一種新的用于自身免疫疾病的治療劑，在克服用作抗TNF的治療藥劑的傳統(tǒng)單一拮抗劑的功效和安全問題的局限性方面，所述治療劑是有利的。準確地說，本發(fā)明人構建了對TNF-alpha(a)和IL-21有拮抗作用的TNFR2-IL21R融合蛋白。然后，本發(fā)明人采用該融合蛋白證實，炎性細胞因子如IL-21和IL-17以及RORc的表達都降低了，但FoxP3的表達和抗炎細胞因子IL-10的分泌增加了。本發(fā)明人進一步證實，TNFR2-IL21R融合蛋白抑制破骨細胞的分化和減少組織蛋白酶K的表達，作用大于用TNFR2-FC或IL21R-FC治療。在CIA (膠原誘導關節(jié)炎)小鼠模型中，本發(fā)明人證實，通過增加免疫抑制性Treg細胞的表達，本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白不僅有關節(jié)炎治療作用還有自身免疫關節(jié)炎的治療作用。通過證實本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白作為一種用于自身免疫類風濕性關節(jié)炎治療藥劑的巨大可能性，本發(fā)明人最終完成了此發(fā)明。發(fā)明概沭本發(fā)明的目的是提供一種用于預防和治療自身免疫疾病的組合物，所述組合物包 含TNFR2-IL21R融合蛋白作為活性成分，所述TNFR2-IL21R融合蛋白為TNF-a和IL-21的雙重拮抗劑。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種融合蛋白，在這種融合蛋白中，包含TNFR2 (腫瘤壞死因子受體2型)蛋白或所述TNFR2的胞外結構域的片段與包含IL21R (白介素21受體)蛋白或所述IL21R的胞外結構域的片段相連接。本發(fā)明還提供了一種編碼所述TNFR2-IL21R融合蛋白的多核苷酸。本發(fā)明進一步提供了一種包含編碼所述TNFR2-IL21融合蛋白的多核苷酸的表達載體。本發(fā)明還提供了一種通過用包含編碼所述TNFR2-IL21R融合蛋白的多核苷酸的表達載體轉染宿主細胞而得到的轉化體。本發(fā)明還提供了一種用于預防和治療自身免疫疾病的組合物，所述組合物包含TNFR2-IL21R融合蛋白作為活性成分。本發(fā)明還提供了一種用于治療自身免疫疾病的方法，該方法包括給患有自身免疫疾病的受試者施用藥物有效劑量的TNFR2-IL21R融合蛋白的步驟。本發(fā)明還提供了一種用于預防自身免疫疾病的方法，該方法包括給受試者施用藥物有效劑量的TNFR2-IL21R融合蛋白的步驟。此外，本發(fā)明提供了本發(fā)明的一種融合蛋白，其用于預防和治療自身免疫疾病。有益效果如上所述，本發(fā)明涉及一種組合物,該組合物包含以對抗TNF- α和IL-21的拮抗作用為特征的TNFR2-IL21R融合蛋白，所述TNF- α和IL-21被認為是自身免疫疾病之一的自身免疫類風濕性關節(jié)炎的主要病因。TNFR2-IL-21R融合蛋白抑制炎性細胞因子的分泌，增加抗炎細胞因子的產生，并對破骨細胞分化具有良好的抑制作用。此外，在CIA小鼠模型中，所述融合蛋白對關節(jié)的浸潤、炎癥和軟骨破壞顯示出很好的緩解作用。本發(fā)明的融合蛋白也被證明增加免疫抑制細胞Treg細胞表達，對自身免疫類風濕性關節(jié)炎有治療作用。因此，本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白可以有效地用作對自身免疫疾病具有預防和治療作用的組合物的活性成分。


結合附圖能最好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的應用，其中圖I為示出了 IL21R-FC結構的圖，其中IL21R基因被克隆到表達載體pYK602-HIS-Fc 中。圖2為一組照片，示出了證明被克隆到表達載體pYK602-HIS_Fc中的IL21R_Fc表達的蛋白質印跡的結果，以及在通過用蛋白質A珠子純化所表達蛋白后使用組氨酸抗體進行的另一個蛋白質印跡的結果。圖3為示出了 TNF-α單拮抗劑結構的圖，其中TNFR2基因已經被克隆到表達載體pYK602-HIS-Fc 中。圖4為一組照片，示出了確認被克隆到表達載體pYK602-HIS_Fc中的TNFR2_Fc單拮抗劑的表達的蛋白質印跡的結果，以及在通過用蛋白質A珠子純化所表達蛋白后使用組氨酸抗體進行的另一個蛋白質印跡的結果?！D5為示出了 PCR引物結構的圖，所述PCR引物用來構建誘導TNFR2-IL21R融合蛋白表達的表達載體。圖6為一組圖，示出了 TNFR2-IL21R融合蛋白的結構，所述TNFR2-IL21R融合蛋白通過在表達載體pYK602-HIS-Fc中克隆TNFR2R基因連同IL21基因而制得。圖7為一組照片，示出了確認被克隆到表達載體pYK602-HIS-Fc中的TNFR2-IL21R融合蛋白的表達的蛋白質印跡的結果。圖8的圖示出了了即1 2-幾211 融合蛋白與其配體了即-0和IL-21的結合親和力。圖9為一組照片和圖，示出了確認在用TNFR2-IL21R融合蛋白處理的Th 17細胞中IL-21、IL-17、RORc、以及β -肌動蛋白的表達的RT-PCR結果，還示出了在分別用TNFR2_Fc、IL21R-Fc,以及TNFR2-IL21R融合蛋白處理的Thl7極化態(tài)下分泌的炎性細胞因子IL-17的定量。圖10為一組圖，示出了 FoxP3的表達以及在用TNFR2-IL21R融合蛋白處理的Thl7極化態(tài)下抗炎細胞因子IL-10的定量。圖11為一組照片和圖，示出了 TNFR2-IL21R融合蛋白對破骨細胞分化的抑制作用。圖12為一組圖，示出了 TNFR2-IL21R融合蛋白對CIA小鼠模型的關節(jié)炎的治療作用。圖12A的圖示出了在給CIA小鼠模型施用本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普后觀察到的臨床評分；丨施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普的時間；關節(jié)炎陰性對照一不作治療的CIA (膠原誘導關節(jié)炎)動物模型組；IL21R/TNFR2-FC :用TNFR2-IL21R融合蛋白治療的CIA動物模型組；依那西普用關節(jié)炎治療藥劑依那西普治療的CIA動物模型組；圖12B的圖示出了給CIA小鼠模型施用本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普后觀察到的發(fā)病率；丨施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普的時間；關節(jié)炎陰性對照一不作治療的CIA (膠原誘導關節(jié)炎)動物模型組；IL21R/TNFR2-FC :用TNFR2-IL21R融合蛋白治療的CIA動物模型組；和
依那西普用關節(jié)炎治療藥劑依那西普治療的CIA動物模型組。圖13為一組照片，示出了 TNFR2-IL21R融合蛋白對CIA小鼠模型的關節(jié)炎緩解作用，其通過免疫組織化學染色法確認CIA :陰性對照一不作治療的CIA (膠原誘導關節(jié)炎)動物模型組；IL21R/TNFR2-FC :用TNFR2-IL21R融合蛋白治療的CIA動物模型組；和依那西普用關節(jié)炎治療劑依那西普治療的CIA動物模型組。圖14為一組照片，示出了 CIA動物模型中TNFR2-IL21R融合蛋白的抗炎作用，其通過免疫組織化學染色法確認CIA 陰性對照一不作治療的CIA動物模型組； IL21R/TNFR2-FC :用TNFR2-IL21R融合蛋白治療的CIA動物模型組；和依那西普用關節(jié)炎治療藥劑依那西普治療的CIA動物模型組。圖15為一組圖，示出了 CIA小鼠模型中CII特異性IgG2a的產生O :施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普前；I :第一次施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普；6 :第六次施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普；9 :第九次施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普；CIA :陰性對照一不作治療的CIA (膠原誘導關節(jié)炎)動物模型組；IL21R/TNFR2-FC :用TNFR2-IL21R融合蛋白治療的CIA動物模型組；和依那西普用關節(jié)炎治療藥劑依那西普治療的CIA動物模型組。圖16為一組照片，示出了 CIA小鼠模型的脾臟中Thl7和Treg細胞的表達，其通過免疫組織化學染色法確認CIA 陰性對照一不作治療的CIA動物模型組；IL21R/TNFR2-FC :用TNFR2-IL21R融合蛋白治療的CIA動物模型組；和依那西普用關節(jié)炎治療藥劑依那西普治療的CIA動物模型組。優(yōu)詵實施方案的說明以下，詳細描述本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種融合蛋白，在這種融合蛋白中，包含TNFR2 (腫瘤壞死因子受體2型)蛋白或所述TNFR2的胞外結構域的片段與包含IL21R (白介素21受體)蛋白或所述IL21R的胞外結構域的片段相連接。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含TNFR2的胞外結構域的片段優(yōu)選地為這樣的多肽所述多肽包含范圍為由SEQ. ID. NO: 2表示的氨基酸序列的第23位 第179位殘基的序列，但不總是限于此。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含IL21R的胞外結構域的片段優(yōu)選地為這樣的多肽所述多肽包含范圍為由SEQ. ID. NO: 2表示的氨基酸序列的第21位 第231位殘基的序列，但不總是限于此。所述融合蛋白優(yōu)選地具有由SEQ. ID. NO: I表示的氨基酸序列，但不總是限于此。還優(yōu)選的是，所述TNFR2-IL21R融合蛋白由20(Γ250個氨基酸組成，但不總是限于此。TNFR2-IL21R融合蛋白優(yōu)選地包含源自抗體重鏈恒定結構域的片段，但不總是限于此。包含在TNFR2-IL21R融合蛋白中的Fe結構域優(yōu)選地選自IgA、IgD、IgE、IgGjPIgM，更優(yōu)選地，它包含全部或部分的CH2和CH3恒定結構域，但不總是限于此。
在TNFR2-IL21R融合蛋白中，IL21R和TNFR2的胞外可溶性結構域的羧基端和氨基端優(yōu)選地包含全部或部分的抗體重鏈恒定結構域，但不總是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白優(yōu)選地包含至少2當量的抗體重鏈恒定結構域，但不總是限于此。其中的兩條Fe重鏈優(yōu)選地通過二硫鍵或其它共價鍵綴合，但不總是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白的TNFR2和IL21R部分優(yōu)選地包含至少2當量的TNFR2和IL21R胞外可溶性結構域，但不總是限于此。本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白優(yōu)選地通過包括以下步驟的方法制備，但不總是限于此I)使用DNA文庫為模板，用IL21R引物進行PCR (聚合酶鏈反應)；2)使用DNA文庫為模板，用TNFR2弓丨物進行PCR ；3)使用步驟I)和步驟2)的PCR產物為模板，用編碼TNFR2-IL21R融合基因的引 物進行PCR ； 4)用限制性酶消化步驟3)的PCR產物；5)用限制性酶消化表達載體pYK-602-HIS-Fc ；6)進行用步驟4)和步驟5)的限制性酶消化的質粒的連接；7)轉化用步驟6)的連接反應完成的TNFR2-IL21R融合蛋白；8)在完成步驟7)的轉化反應后，把所述蛋白接種到LB平板上；9)用步驟8)中產生的菌落進行PCR ；10)用步驟9)中確認的TNFR2-IL21R融合蛋白轉染293E細胞；11)從細胞培養(yǎng)基中純化步驟10)的293E細胞中表達的TNFR2-IL21R融合蛋白；12)去除步驟11)中純化的TNFR2-IL21R融合蛋白的細胞毒性；13)確認步驟12)中純化的TNFR2-IL21R融合蛋白的結合親和力。在本發(fā)明的制備方法中，載體的構建優(yōu)選地通過使用DNA文庫的PCR進行，所述DNA文庫優(yōu)選地構建自肝、胎盤、胰腺和肝組織，但不總是限于此。本發(fā)明還提供了一種編碼TNFR2-IL21R融合蛋白的多核苷酸。本發(fā)明進一步提供了一種包含編碼TNFR2-IL21融合蛋白的多核苷酸的表達載體。本文的表達載體優(yōu)選地為pYK602-HIS_Fc，但不總是限于此。本發(fā)明還提供了一個通過用包含編碼TNFR2-IL21R融合蛋白的多核苷酸的表達載體轉染宿主細胞而得到的轉化體。本文的轉化體優(yōu)選地為大腸桿菌DH5ci，但不總是限于此。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，IL21R和TNFR2基因通過PCR擴增以將IL21R和TNFR2亞克隆到表達載體pYK602-HIS-Fc中。每個擴增的PCR產物均被連接到表達載體pYK602-HIS-Fc 中，以構建 TNFR2_Fc 和 IL21R-Fc (見圖 I 和圖 3)。構建的 TNFR2-F。和IL21R-FC轉染293E細胞。在完成轉染后，產生且經純化的蛋白(IL-21的單拮抗劑)通過蛋白質印跡來確認(見圖2和圖4)。IL21R和TNFR2基因通過使用DNA文庫混合物(腎臟、肝、胰腺和胎盤的混合物)為模版進行PCR擴增。在構建用于擴增IL21R和TNFR2融合基因(見圖5)的引物后，通過使用上述擴增的產品為模版，用編碼TNFR2-IL21R融合蛋白(TNF-α和IL-21的雙重拮抗齊U)的基因進行PCR。擴增的PCR產物繼續(xù)連接到表達載體PYK602-HIS-FC中，從而實現(xiàn)TNFR2-IL21R融合蛋白表達載體的構建(見圖6和圖7)。此外，研究了 TNFR2-IL21R融合蛋白和它的一個配體TNF-α之間的親和力，結果證實TNFR2-IL21R融合蛋白與TNF-a和IL-21有高親和力(見圖8)。本發(fā)明還提供了一種用于預防和治療自身免疫疾病的組合物，所述組合物包含所述TNFR2-IL21R融合蛋白作為活性成分。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含TNFR2胞外結構域的片段優(yōu)選地為這樣的多肽所述多肽包含范圍為由SEQ. ID. NO:2表示的氨基酸序列的第23位 第179位殘基的序列，但不總是限于此。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含IL21R胞外結構域的片段優(yōu)選地為這樣的多肽所述多肽包含范圍為由SEQ. ID. NO:3表示的氨基酸序列的第21位 第231位殘基的序列，但不總是限于此。所述融合蛋白優(yōu)選地具有由SEQ. ID. NO: I表示的氨基酸序列， 但不總是限于此。還優(yōu)選的是，所述TNFR2-IL21R融合蛋白由20(Γ250個氨基酸組成，但不 總是限于此。TNFR2-IL21R融合蛋白優(yōu)選地包含源自抗體重鏈恒定結構域的片段，但不總是限于此。包含在TNFR2-IL21R融合蛋白中的Fe結構域優(yōu)選地選自IgA、IgD、IgE、IgGjPIgM，更優(yōu)選地，它包含全部或部分的CH2和CH3恒定結構域，但不總是限于此。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，TNFR2和IL21R的胞外可溶性結構域的羧基端和氨基端優(yōu)選地包含全部或部分的抗體重鏈恒定結構域，但不總是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白優(yōu)選地包含至少2當量的抗體重鏈恒定結構域，但不總是限于此。其中的兩條Fe重鏈優(yōu)選地通過二硫鍵或其它的共價鍵綴合，但不總是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白的TNFR2和IL21R部分優(yōu)選地包含至少2當量的TNFR2和IL21R胞外可溶性結構域，但不總是限于此。所述自身免疫疾病優(yōu)選地為選自下述的疾病自身免疫類風濕性關節(jié)炎、狼瘡、重癥肌無力、強直性脊柱炎、甲狀腺機能亢進、甲狀腺功能減退癥、潰瘍性結腸炎、克羅恩病、心臟瓣膜疾病、多發(fā)性硬化癥、硬皮病和自身免疫肝炎，更優(yōu)選地為自身免疫類風濕性關節(jié)炎，但不總是限于此。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，Thl7細胞用上面構建的TNFR2-FC，IL21R-Fc以及TNFR2-IL21R融合蛋白處理。結果是，相比于用TNFR2_Fc或IL21R_Fc處理，當用TNFR2-IL21R融合蛋白處理時，炎性細胞因子IL-21和IL17，以及轉錄因子RORc都顯著地減量調節(jié)(見圖9)。相比于用TNFR2-FC或IL21R_Fc處理，當用TNFR2-IL21R融合蛋白處理時，Thl7中分泌的炎性細胞因子顯著降低(見圖9)。分別用TNFR2-Fc、IL21R_Fc、和TNFR2-IL21R融合蛋白處理至Thl7極化態(tài)，然后通過ELASA測定抗炎細胞因子IL-10的水平。結果是，相比于用TNFR2-FC或IL21R-FC處理細胞，當用TNFR2-IL21R融合蛋白處理細胞時，F(xiàn)oxP3的表達以及IL-10的分泌都顯著提高(見圖10)。此外，分別用TNFR2_Fc、IL21R-Fc、以及TNFR2-IL21R融合蛋白處理后，破骨細胞分化受到抑制，這是通過TRAP染色然后通過觀察組織蛋白酶K表達的增加來確認的(見圖11)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，構建CIA (膠原誘導關節(jié)炎)小鼠模型,來證實本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白對于關節(jié)炎的體內治療作用。然后，小鼠模型用本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白治療。結果是，證實了對關節(jié)炎的治療作用(見圖12)。準確地說，關節(jié)中的浸潤和炎癥減少了，軟骨破壞也同樣減少(見圖13)。炎性因子的表達也減少了(見圖14)，以及施用以構建關節(jié)炎誘導小鼠模型的CII特異性IgG2a的產生被抑制(見圖15)。本發(fā)明的融合蛋白的關節(jié)炎治療作用或緩解作用類似于或者更優(yōu)于目前用作關節(jié)炎治療藥劑的依那西普。從用本發(fā)明的TNFR2-IL2IR融合蛋白治療的CIA小鼠模型中提取涉及于免疫應答的脾組織，隨后觀察Thl7和Treg細胞的表達。結果是，表達炎性因子的Thl7細胞(CD4+IL17+)的表達減少，而來自自身免疫應答的免疫抑制細胞Treg細胞(CD4+CD25+Foxp3+)的表達增加(見圖 16)?？傊?，TNFR2-IL21R融合蛋白減少炎性細胞因子IL-17的產生，這比TNFR2_Fc和IL21R-Fc實現(xiàn)的更顯著，比TNFR2-FC和IL21R_Fc更能增加抗炎細胞因子IL-10的產生，在CIA小鼠模型中表現(xiàn)出自身免疫類風濕性關節(jié)炎的治療或緩解作用。因此，本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白可以有效地用作用于預防和治療自身免疫疾病的組合物的活性成分。
可以通過考慮各種因素來確定本發(fā)明TNFR2-IL21R融合蛋白的藥物有效劑量，所述因素如給藥方法、目標區(qū)域、患者病癥等等。因此，必須同時考慮安全性和效率來確定用于人體的劑量。該有效劑量還可以基于通過動物試驗確定的有效劑量來預測。下列文章中描述了用于確定有效劑量時必須考慮的各種因素Hardman和Limbird編，Goodmanand Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics, IOth ed. (2001),PergamonPress ； 和 E.W.Martin 編，Remington’s Pharmaceutical Sciences,18thed. (1990), MackPublishing Co。本發(fā)明的藥物組合物可以包括任何通常使用的載體、稀釋劑、賦形劑、或者它們中的至少兩種的組合。藥學上可接受的載體可以是能夠沒有限制地在人體內遞送本發(fā)明的TNFR2-IL21R 融合蛋白的任何載體,例如在 Merck Index, 13th ed. , Merck & Co. Inc 中描述的化合物，如鹽水、無菌水、林格氏溶液、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂質體以及包含這些組分中的一種或多種的混合物。如果有必要，常規(guī)添加劑如抗氧化齊U、緩沖劑和抑菌劑可以另外添加。本發(fā)明的組合物可以配制成不同形式，包括通過與稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘結劑和潤滑劑混合而成的水性溶液、懸浮液以及注射用乳液、丸劑、膠囊、顆?；蚱瑒?。按照 Remington’s Pharmaceutical Science (Mack PublishingCompany, EastonPA, 18th, 1990)提供的方法,組合物還可以根據(jù)成分進一步制成合適的形式。本發(fā)明的組合物可以另外包含一種或多種與所述活性成分具有相同或相似功能的有效成分。本發(fā)明的組合物可以包含以組成物總重量計的0.0001 - 10重量％的所述蛋白，優(yōu)選0. 001 - I重量％。本發(fā)明的藥物組合物可以經口服或經腸胃外(例如，靜脈內、皮下、腹膜或局部注射)給藥。組合物的有效劑量可以根據(jù)體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給藥方法、排泄以及疾病的嚴重性來確定。劑量為每天0. 00Γ100 mg / kg，優(yōu)選為每天0. ΟΓ Ο mg/ kg，給藥頻率為一天一次或者優(yōu)選一天幾次。本發(fā)明還提供了一種用于治療自身免疫疾病的方法，該方法包括給患有自身免疫疾病的受試者施用藥物有效劑量的TNFR2-IL21R融合蛋白的步驟。本發(fā)明還提供了一種用于預防自身免疫疾病的方法，該方法包括給受試者施用藥物有效劑量的TNFR2-IL21R融合蛋白的步驟。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含TNFR2的胞外結構域的片段優(yōu)選地為這樣的多肽所述多肽包含范圍為由SEQ. ID. NO: 2表示的氨基酸序列的第23位 第179位殘基的序列，但不總是限于此。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含IL21R的胞外結構域的片段優(yōu)選地為這樣的多肽所述多肽包含范圍為由SEQ. ID. NO:3表示的氨基酸序列的第21位 第231位殘基的序列，但不總是限于此。所述融合蛋白優(yōu)選地具有由SEQ. ID. NO: I表示的氨基酸序列，但不總是限于此。還優(yōu)選的是，所述TNFR2-IL21R融合蛋白由20(Γ250個氨基酸組成，但不總是限于此。TNFR2-IL21R融合蛋白優(yōu)選地包含源自抗體重鏈恒定結構域的片段，但不總是限于此。包含在TNFR2-IL21R融合蛋白中的Fe結構域優(yōu)選地選自IgA、IgD、IgE、IgGjPIgM，更優(yōu)選地，它包含全部或部分的CH2和CH3恒定結構域，但不總是限于此。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，IL21R和TNFR2的胞外可溶性結構域的羧基端和氨 基端優(yōu)選地包含全部或部分的抗體重鏈恒定結構域，但不總是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白優(yōu)選地包含至少2當量的抗體重鏈恒定結構域，但不總是限于此。其中的兩條Fe重鏈優(yōu)選地通過二硫鍵或其它的共價鍵綴合，但不總是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白的TNFR2和IL21R部分優(yōu)選地包含至少2當量的TNFR2和IL21R胞外可溶性結構域，但不總是限于此。所述自身免疫疾病優(yōu)選地為選自下述的疾病自身免疫類風濕性關節(jié)炎、狼瘡、重癥肌無力、強直性脊柱炎、甲狀腺機能亢進、甲狀腺功能減退癥、潰瘍性結腸炎、克羅恩病、心臟瓣膜疾病、多發(fā)性硬化癥、硬皮病和自身免疫肝炎，更優(yōu)選地為自身免疫類風濕性關節(jié)炎，但不總是限于此。已經證實，本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白減少炎性細胞因子IL-17的產生，這比TNFR2-FC和IL21R-FC實現(xiàn)的更顯著，比TNFR2_Fc和IL21R_Fc更能增加抗炎細胞因子IL-10的產生。此外，相比于TNFR2-FC和IL21R_Fc，所述融合蛋白對破骨細胞分化的抑制作用更特異，因此所述融合蛋白可以有效地用于治療自身免疫疾病?？梢酝ㄟ^考慮各種因素來確定本發(fā)明TNFR2-IL21R融合蛋白的藥物有效劑量，所述因素如給藥方法、目標區(qū)域、患者病癥等等。因此，必須同時考慮安全性和效率來確定用于人體的劑量。該有效劑量還可以基于通過動物試驗確定的有效劑量來預測。下列文章中描述了用于確定有效劑量時必須考慮的各種因素Hardman和Limbird編，Goodmanand Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics, IOth ed. (2001),PergamonPress ； 和 E. W.Martin 編，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18thed. (1990), MackPublishing Co。本發(fā)明的藥物組合物可以包括任何通常使用的載體、稀釋劑、賦形劑、或者它們中的至少兩種的組合。藥學可接受的載體可以是能夠沒有限制地在人體內遞送本發(fā)明的TNFR2-IL21R 融合蛋白的任何載體,例如在 Mercklndex, 13th ed. , Merck & Co. Inc.中描述的化合物，如鹽水、無菌水、林格氏溶液、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂質體以及包含這些組分中的一種或多種的混合物。如果有必要，常規(guī)添加劑如抗氧化齊U、緩沖劑和抑菌劑可以另外添加。本發(fā)明的組合物可以配制成不同形式，包括通過與稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘結劑和潤滑劑混合而成的水性溶液、懸浮液以及注射用乳液、丸劑、膠囊、顆?；蚱瑒０凑?Remington’s Pharmaceutical Science (Mack PublishingCompany, Easton PA, 18th, 1990)提供的方法,組合物還可以根據(jù)成分進一步制成合適的形式。本發(fā)明的組合物可以另外包含一種或多種與所述活性成分具有相同或相似功能的有效成分。本發(fā)明的組合物可以包含以組成物總重量計的O. 0001-10重量％的所述蛋白，優(yōu)選O. 001-重量1%。本發(fā)明的藥物組合物可以經口服或經腸胃外(例如，靜脈內、皮下、腹膜或局部注射)給藥。組合物的有效劑量可以根據(jù)體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給藥方法、排泄以及疾病的嚴重性來確定。劑量為每天O. 00Γ100 mg / kg，優(yōu)選為每天0. ΟΓ Ο mg/ kg，給藥頻率為一天一次或者優(yōu)選一天幾次。 此外，本發(fā)明提供一種用于預防和治療自身免疫疾病的融合蛋白。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含TNFR2的胞外結構域的片段優(yōu)選地為這樣的多肽所述多肽包含范圍為由SEQ. ID. NO: 2表示的氨基酸序列的第23位 第179位殘基的序列，但不總是限于此。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含IL21R的胞外結構域的片段優(yōu)選地為這樣的多肽所述多肽包含范圍為由SEQ. ID. NO:3表示的氨基酸序列的第21位 第231位殘基的序列，但不總是限于此。所述融合蛋白優(yōu)選地具有由SEQ. ID. NO: I表示的氨基酸序列，但不總是限于此。還優(yōu)選的是，所述TNFR2-IL21R融合蛋白由20(Γ250個氨基酸組成，但不總是限于此。TNFR2-IL21R融合蛋白優(yōu)選地包含源自抗體重鏈恒定結構域的片段，但不總是限于此。包含在TNFR2-IL21R融合蛋白中的Fe結構域優(yōu)選地選自IgA、IgD、IgE、IgGjPIgM，更優(yōu)選地，它包含全部或部分的CH2和CH3恒定結構域，但不總是限于此。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，IL21R和TNFR2的胞外可溶性結構域的羧基端和氨基端優(yōu)選地包含全部或部分的抗體重鏈恒定結構域，但不總是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白優(yōu)選地包含至少2當量的抗體重鏈恒定結構域，但不總是限于此。其中的兩條Fe重鏈優(yōu)選地通過二硫鍵或其它的共價鍵綴合，但不總是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白的TNFR2和IL21R部分優(yōu)選地包含至少2當量的TNFR2和IL21R胞外可溶性結構域，但不總是限于此。所述自身免疫疾病優(yōu)選地為選自下述的疾病自身免疫類風濕性關節(jié)炎、狼瘡、重癥肌無力、強直性脊柱炎、甲狀腺機能亢進、甲狀腺功能減退癥、潰瘍性結腸炎、克羅恩病、心臟瓣膜疾病、多發(fā)性硬化癥、硬皮病和自身免疫肝炎，更優(yōu)選地為自身免疫類風濕性關節(jié)炎，但不總是限于此。本發(fā)明的實際且目前優(yōu)選的實施方案在以下的實施例、實驗例和制備例中示例性地示出。然而，將被理解的是，本領域技術人員在考慮本公開內容后，可以在本發(fā)明的精神和范圍內做出修改和改進。實施例I :IL21R_Fc的構津〈 1-1 >IL2IR-Fc表汰載體的構津為了構建IL21R-FC表達載體，通過使用DNA文庫混合物(腎臟、肝、胰腺和胎盤的混合；購自 21C Frontier Human GENE Bank (Korea ResearchInstitute of Bioscienceand Biotechnology)，克隆 ID:hMU007690，板 NO. IRAH-24-A10，載體pOTB7)作為模板，采用包含 SfiI 位點的正向引物(SEQ. ID. NO:4:5' -agggggccgtgggggcccccgacctcgtctgctacac_3，)和反向引物(SEQ. ID. N0:5:5，-tagcggccgacgcggccaattcctttaactcctctgact-3，)進行PCR，擴增了 IL21R基因。PCR產物用SfiI處理，然后亞克隆到pYK602-HIS_Fc中。PCR反應混合物準備如下?；旌螴OOng的模板DNA、2. 5單位的pfu聚合酶(Genotech, Korea)、10pmole/50 μ I的每個引物和蒸餾水，制得最終體積為50 μ I。PCR進行如下94°C下預變性2分鐘，94°C下變性30秒，58°C下退火30秒，72°C下聚合I分鐘，從變性到聚合循環(huán)30次，并在72 °C下最終延伸10分鐘。擴增的PCR產物和載體用SfiI進行消化，隨后在37°C下反應4小時。然后通過使用凝膠純化試劑盒(QIAGEN，#28706，USA)進行純化。PCR擴增產物與載體的比率為
3(150 μ g) :1(50μ g),lu I T4 DNA 連接酶(#SDL01_R40k, Solgent, Korea)和 2 μ I 10X 連接酶緩沖液被添加進去，使反應溶液總體積為20 μ 1，隨后在16°C下連接16小時。用連接的質粒轉化大腸桿菌DH5CI，然后涂布在包含氨芐青霉素的LB平板上，隨后在37°C保溫箱中孵育16小時。生成的菌落重新懸浮在包含10 μ I的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，隨后使用4飛μ I培養(yǎng)基作為模板進行菌落PCR。結果證明，IL21R基因被成功亞克隆到表達載體pYK602-HIS-Fc中。<1-2>IL21R-Fc 的表汰和鈍化293E細胞在500ml的補加了 50mlFBS的DMEM中培養(yǎng)，然后以70 80%的匯合度接種在150 mm平板上。IL21R_Fc (20 μ g)與PEI (40 μ g)以1:2的比率混合，然后在室溫下反應20分鐘，滴到用于轉染的細胞上。16 20小時后，將培養(yǎng)基替換為20ml無血清DMEM，每2 3天取上清液。獲得的上清液以5000rpm離心10分鐘。把得到的上清液轉移到新的瓶子中，將它儲存在4°C下，直到純化。在第3、5、7、和9天從20個150mm的平板獲得總共11的上清液，將它繼續(xù)純化。所有的上清液用0. 22 μ m頂級過濾器(#PR02890MiIlipore USA)過濾，然后結合到500 μ I蛋白質A珠子(#17-1279-03，GE healthcare, Sweden)上，所述蛋白質A珠子填充于5ml柱子中。在4°C下通過使用Peri-start泵(0. 9ml/分鐘)誘導結合反應過夜。柱子用至少IOOml的PBS洗滌。通過使用0. IM甘氨酸-HCl (#G7126, Sigma, USA)進行洗脫，得到6個級份，接下來用 IMTris (#T-1503-5KG, Sigma, USA) (pH 9.0)中和。然后，定量 IL21R_Fc。通過使用超濾器(amicon ultra, #UFC805024, Mi I lipore, USA)收集和濃縮 2 3 個示出 IL21 R-Fc 表達的級份。將緩沖液替換為約10倍量的新鮮PBS (#70011，Gibco, USA)。結果，如圖2所示，從11上清液(740ng/ μ I)中總共獲得I. O mg IL21R-Fc0實施例2 TNFR2~Fc的構津<2-l>TNFR2~Fc表汰載體的構津為了構建TNFR2-FC表達載體，通過使用DNA文庫混合物(腎臟、胎盤、胰腺和肝的混合物；購自 21C Frontier Human GENE Bank (KoreaResearch Institute of Bioscienceand Biotechnology)，克隆 ID:hMU013725，板 NO. IRAU-86-H09，載體pDNR_LIB)作為模板，采用包含SfiI位點的正向引物(SEQ. ID.N0:6:5，-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATT-3’)和反向引物(SEQ. ID. NO: 7:5’ -TAGCGGCCGACGCGGCCAATTCAGCTGGGGGGCTGGGGC-3’)進行 PCR，擴增了 TNFR2_Fc 基因。PCR產物用SfiI處理，然后亞克隆到pYK602-HIS-Fc中。PCR混合物準備如下?；旌螴OOng 的模板 DNA、2. 5 單位的 pfu 聚合酶(Genotech, Korea) > 10pmole/50 μ I 的每個引物和蒸餾水，制得最終體積為50 μ I。PCR進行如下94°C下預變性2分鐘，94°C下變性30秒，55°C下退火30秒，72°C下聚合I分鐘，從變性到聚合循環(huán)30次，并在72°C最終延伸10分鐘。擴增的PCR產物和載體用SfiI進行消化，隨后在37°C下反應4小時。然后通過使用凝膠純化試劑盒進行純化。PCR擴增產物與載體的比率為3 (150 μ g) :1(50 μ g)，I μ 1T4DNA連接酶和2 μ IlOX連接酶緩沖液被添加進去，使反應溶液總體積為20 μ 1，隨后在16°C下連接16小時。用連接的質粒轉化大腸桿菌DH5CI，然后涂布在包含氨芐青霉素的LB平板上，隨后在37°C保溫箱中孵育16小時。生成的菌落重新懸浮在包含10 μ I的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，隨后使用4飛μ I培養(yǎng)基作為模板進行菌落PCR。結果證明，TNFR2基因被成功亞克 隆到表達載體pYK602-HIS-Fc中。<2~2>TNFR2~Fc的表汰和鈍化293E細胞在500ml的補加了 50mlFBS的DMEM中培養(yǎng)，然后以70 80%的匯合度接種在150 mm平板上。TNFR2_Fc (20 μ g)與PEI (40 μ g)以1:2的比率混合，然后在室溫下反應20分鐘，滴到用于轉染的細胞上。16 20小時后，將培養(yǎng)基替換為20ml無血清DMEM，每2 3天取上清液。獲得的上清液以5000rpm離心10分鐘。把得到的上清液轉移到新的瓶子中，將它儲存在4°C下，直到純化。在第3、5、7、和9天從20個150mm的平板獲得總共11的上清液，將它繼續(xù)純化。所有的上清液用O. 22 μ m頂級過濾器過濾，然后結合到500 μ I蛋白質A珠子上，所述蛋白質A珠子填充于5ml柱子中。在4°C下通過使用Peri-start泵(O. 9ml/分鐘)誘導結合反應過夜。柱子用至少IOOml的PBS洗滌。通過使用O. IM甘氨酸-HCl進行洗脫，得到6個級份,然后用IM Tris (pH9. O)中和。然后，定量經純化的蛋白。通過使用amiconultra收集和濃縮2 3個示出TNFR2_Fc表達的級份。將緩沖液替換為約10倍量的新鮮PBS (#70011，Gibco, USA)。結果，如圖4所示，從11上清液(lmg/μ I)中總共獲得I. 5 mg TNFR2-F。。實施例3 :TNFR2_IL21R融合蛋白的制備〈3-DTNFR2-IL21R融合蛋白表汰載體的構建為了構建TNFR2-IL21R融合蛋白表達載體，通過使用DNA文庫混合物(腎臟、胎盤、胰腺和肝的混合物)作為模板，采用包含SfiI位點的正向引物和反向引物(SEQ.ID. NO:8:5，-tagcggccgacgcggccaacgtgcagactgcatccatgc-3，)進行 PCR,擴增了 TNFR2 基因。同樣通過使用正向引物和反向引物在以下條件下進行PCR擴增了 IL21R基因。兩個PCR產物以I :1的比率混合，作為模版，總體積達lOOng，然后繼續(xù)用三個引物進行PCR，使得TNFR2-IL21R融合蛋白亞克隆到pYK602-HIS-Fc載體中。PCR反應混合物準備如下。混合IOOng的模板DNA、2. 5單位的pfu聚合酶(Genotech, Korea)、10pmole/50 μ I的每個引物和蒸懼水，制得最終體積為50μ I。PCR進行如下94°C下預變性2分鐘，94°C下變性30秒，55°C下退火30秒，72°C下聚合I分鐘，從變性到聚合循環(huán)30次，并在72°C下最終延伸10分鐘。
每一個擴增的PCR產物用SfiI進行消化，隨后在37°C下反應4小時。然后通過使用凝膠純化試劑盒進行純化。PCR產物與載體以3 (150 μ g) : I (50 μ g)的比率混合，I μ 1T4DNA連接酶和2 μ IlOX連接酶緩沖液被添加進去，使反應溶液總體積為20 μ 1，隨后在16°C下連接16小時。用連接的質粒轉化大腸桿菌DH5CI，然后涂布在包含氨芐青霉素的LB平板上，隨后在37°C保溫箱中孵育16小時。生成的菌落重新懸浮在包含10 μ I的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，隨后使用4飛μ I培養(yǎng)基作為模板進行菌落PCR。結果證明，編碼TNFR2-IL21R融合蛋白的基因被成功亞克隆到表達載體pYK602-HIS-Fc中。<3-2>TNFR2~IL21R融合蛋白的表汰和鈍化293E細胞在500ml的補加了 50ml FBS的DMEM中培養(yǎng)，然后以70 80%的匯合度接種在150 mm平板上。TNFR2-IL21R融合蛋白(20 μ g)與PEI (40 μ g)以1:2的比率混合，然后在室溫下反應20分鐘，滴到用于轉染的細胞上。16 20小時后，將培養(yǎng)基替換為20ml無 血清DMEM，每2 3天取上清液。獲得的上清液以5000rpm離心10分鐘。把得到的上清液轉移到新的瓶子中，將它儲存在4°C下，直到純化。在第3、5、和7天從10個150mm的平板獲得總共6001的上清液，將它繼續(xù)純化。所有的上清液用O. 22 μ m頂級過濾器過濾，然后結合到500 μ I蛋白質A珠子上，所述蛋白質A珠子填充于5ml柱子中。在4°C下通過使用Peri-start泵(O. 9ml/分鐘)誘導結合反應過夜。柱子用至少IOOml的PBS洗滌。通過使用O. IM甘氨酸-HCl進行洗脫，得到6個級份，然后用IM Tris (pH9. O)中和。然后，定量經純化的蛋白。通過使用amicon ultra收集和濃縮2 3個示出TNFR2-IL21R融合蛋白表達的級份。將緩沖液替換為約10倍量的新鮮 PBS(#70011, Gibco, USA)。結果，如圖7所示，總共得到I mgTNFR2-IL21R融合蛋白(380 μ g/ml)。實驗例I :測定TNFR2-IL21R融合蛋白和其配體間的結合親和力為了測定上述構建的TNFR2-Fc、IL21R_Fc、和TNFR2-IL21R融合蛋白與他們的配體TNF- α之間的拮抗作用，進行結合親和力試驗。在4 O 下用 IOOng TNF-α (#C001_1MG，enzynomics, Korea)過夜涂布 ELISA板(#439454，Nunc, Denmark)的每個孔。完成涂布后，添加200 μ I含有4%脫脂牛奶(#232100, Difco, France)的PBS到ELISA板的每個孔中，接下來用封閉緩沖液(含4%脫脂牛奶的PBS)在室溫下封閉約I小時，以便抑制非特異性反應。完成封閉后，從ELISA板上除去封閉緩沖液。每個純化的融合蛋白被添加到100 μ I含有1%脫脂牛奶的PBS中，濃度為ΙΟΟηΜ，接著進行連續(xù)稀釋(1/4倍稀釋度)。然后，在室溫下誘導反應大約2小時。接下來，板用 200 μ I PBS 洗滌 5 次。2μ I 的抗人 Fc-HRP (#31413, Thermo, USA)即第二抗體，被添加到4ml的具有1%脫脂牛奶的PBS中，分配到ELISA板的每個孔中(200 μ I/孔)，接下來在室溫下反應I小時。反應完成后，第二抗體從ELISA板中除去，接下來用200 μ I PBS洗漆5次。如下準備100 μ I反應混合液混合10 μ I過氧化氫溶液(H2O2, #H1009-100ML, Sigma, USA)、10 μ I PC 緩沖液[5. Ig 檸檬酸一水合物，7. 3g 磷酸鈉(pH 5.0)/1]以及I片0PD(#P8787-100TAB Sigma USA)，并添加到板的每個孔中，接下來在暗處于室溫下反應10分鐘。確認顏色變化之后，通過添加終止緩沖液(50μ I/孔)終止反應。在490nm下通過使用ELISA讀取器測定Kd值。
結果，如圖8所示，TNF-α配體表現(xiàn)出低Kd值，從而表明配體與TNFR2-IL21R融合蛋白具有聞未和力(圖8)。實驗例2 :TNFR2_IL21R融合蛋白對炎性細胞因子的抑制<2~1>分離外周血單核細朐通過使用經肝素處理的注射器從健康人獲得血液，然后用PBS以1:1的比率稀釋所述血液。以 1:4 的比率添加 Ficoll (Amercham Biosciences, Burkinghamshire, England)到經稀釋的血液中，使血液浮在Ficoll層的上面,接下來在20°C下以2000rpm離心30分鐘。外周血單核細胞(PBMC)從血沉棕黃層分離。分離出來的細胞用PBS洗滌，然后在補充7 10% 胎牛血清(Gibco, Burlingame, CA, USA)的 RPMI 1640 (Gibco BRL)中以 I X IO6 個細胞/ml的密度進行稀釋。<2~2>Thl7細朐的培養(yǎng)
在實驗例<2-1>中獲得的PBMC在補加了 10%FBS的RPMI1640中以5X105個細胞/500 μ I的密度進行稀釋，分布到48孔平板(Nalgen Nunclnternational, IL, USA)的每個孔中。向其中以10 μ g/ml的濃度加入TNF-α和IL-21拮抗劑TNFR2-F。、IL21R-Fc,以及TNFR2-IL21R融合蛋白，接下來培養(yǎng)I小時。I小時后，通過使用移液管收集沉積在底部上的細胞，然后轉移到涂布了濃度為O. 3 μ g/ml的抗-⑶3 (BD Pharmingen, SanDiego, CA, USA)的48孔板中。為了誘導PBMC分化成Thl7細胞，向其中加入IL_6 (R&DSystems, Minneapolis, MN, USA; 20ng/ml)、IL-23 (R&D Systems; lOng/ml)、以及 IL-1 β (R&DSystems; 5ng/ml)，接下來在37°C、5%C02的培育箱中培養(yǎng)。培育72小時，不改變培養(yǎng)基，避免額外刺激。<2~3>RT~PCR通過使用RNA zol-B (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)從實施例〈2-2>中培養(yǎng)72小時的細胞中提取總RNA。I μ g的隨機引物(Genotech, Daejeon, Korea)被添加到總的2yg RNA中，在70°C下保持5分鐘，接下來在冰中速凍。將RNA-引物混合物與4 μ I的5 XM-MULV緩沖液、I μ I的IOmM dNTP、和O. 5 μ I的RNA酶抑制齊[J(Takara, Shiga, Japan)混合,9. 5 μ I蒸懼水添加到其中，使反應溶液總體積為19 μ I。在25°C下誘導反應5分鐘，然后向其中加入I μ I逆轉錄酶M-MULV(Takara，Shiga, Japan)。逐步誘導反應(25°C下5分鐘，42°C下60分鐘，然后在72°C下10分鐘)，以獲取cDNA。提供使用上述生成的cDNA作為模板進行RT-PCR。每一個樣品的RT-PCR反應混合物總體積為25 μ I [2. 5 μ IlOX反應緩沖液，2. 5 μ 10. 5mMdNTP,O. 3 μ ITaq(Takara, shinga, apan)，每個引物(正向引物，反向引物)2 μ I, I μ I cDNA,和
14.7μ I蒸餾水]。雙元熱循環(huán)儀系統(tǒng)(MJ Research)被用于擴增。替代提取的cDNA，將蒸餾水用于陰性對照。通過使用陰性對照(其未產生任何PCR產物)，PCR被證實是無污染的。IL-21的PCR擴增如下進行94°C下預變性3分鐘，94°C下變性30秒，56°C下退火30秒，72°C下聚合30秒，從變性到聚合循環(huán)30次，并在72°C下最終延伸7分鐘。IL-17的PCR擴增如下進行94°C下預變性3分鐘，94°C下變性I分鐘，56°C下退火I分鐘，72°C下聚合I分鐘，從變性到聚合循環(huán)30次，并在72°C下最終延伸7分鐘。RORc和β -肌動蛋白的PCR擴增如下進行94°C下預變性3分鐘，94°C下變性30秒，60°C下退火30秒，72°C下聚合30秒，從變性到聚合循環(huán)30次或26次。通過PCR獲得的擴增產品繼續(xù)在含溴化乙錠的I. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，提供使用Gel-Doc 2000 (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)獲得圖片。通過濃度測量技術，使用Quantity-One program(Bio_rad)定量擴增產品。得到的值被轉換成與β_肌動蛋白的比率，然后比較細胞組之間的mRNA的表達。本文使用的引物序列如下IL-21 5，-CTT ACC TGG CAA GAC CAG TAT GA-3’ (SEQ. ID. NO:9);5’ -GTA GAA GGC AGG GTC TTC GTA ΑΤ-3’ (SEQ. ID. NO: 10);IL-17 5’ -TGA AGT GCT GTC TGG AGC AG-3’ (SEQ. ID. NO: 11);5’ -TCC TCA GAA TCA TCC ATG TC—3’ (SEQ. ID. NO: 12); RORc 5’ -AGT CGG AAG GCA AGA TCA GA-3’ (SEQ. ID. NO: 13);5，-CAA GAG AGG TTC TGG GCA AG-3，(SEQ. ID. NO: 14);β-肌動蛋白5’ -GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG-3’ (SEQ. ID. NO: 15);5’-TGT GTT GGC GTA CAG GTC TTT G_3’ (SEQ. ID. NO:16).得到的值被轉換成與β -actin的比率，然后比較細胞組之間的mRNA的表達。結果，在分化的Thl7細胞中，炎性細胞因子IL-17和IL-21的mRNA表達以及被報道在Thl7極化態(tài)下的表達的特定轉錄因子RORc mRNA很高。然而，當Thl7細胞用TNFR2-IL21R融合蛋白處理時，IL-17、IL-21、和RORc基因的表達顯著地被抑制(圖9)。<2-4>TNFR2-IL21R 融合蛋白減少 IL-17 產牛為了證實IL-17被TNFR2-IL21R融合蛋白減量調節(jié)，通過ELISA定量從實施例〈2-3>中用TNFR2-IL21R融合蛋白處理的Thl7細胞培養(yǎng)基中獲得的上清液中炎性細胞因子IL-17。以2 μ g/ml (100 μ I/ 孔)的濃度添加 IL-10 抗體(R&D Systems)到 96 孔板中進行夾心ELISA，接著在室溫下反應2小時。向其中加入200μ I通過將1%BSA與0. 05%PBST
混合制成的封閉緩沖液，接下來在室溫下反應2小時。將用作標準物的人重組IL-10 (R&D Systems)連續(xù)稀釋到5，00(T78. 125pg/ml。向每個孔中添加在實驗例〈3-1>中獲得的細胞培養(yǎng)基上清液(100 μ I/孔)，以和標準物一起測定，接下來在室溫下反應2小時。在完成反應后，板的每個孔用300 μ 10. 05%的PBST洗滌4次。生物素綴合的抗人IL-10 (R&D Systems)以200ng/m的濃度稀釋,按100 μ I/孔分配到每一個孔中，接下來在室溫反應下2小時。完成反應后，板用PBST洗滌4次。ExtraAvidin-堿性磷酸酶綴合物(Sigma, Louis, MO, USA)以1:2000的濃度稀釋，按100 μ I/孔分配到每一個孔中，接下來在室溫下反應2小時。用PBST洗滌板后，將100 μ I磷酸二鈉鹽六水合物(PNPP)/DEA溶液(lmg/ml)添加到板的每個孔中進一步反應。在完成反應后，向其中添加100 μ 10. 2NNa0H以終止反應，然后測量0D4(I5。結果，如圖9所示，當Thl7被分化時，炎性細胞因子IL-17的產生增加。但是，相比于其它用TNFR2-FC和IL21R-FC處理的細胞組，當用濃度為10 μ g/ml的本發(fā)明TNFR2-IL21R融合蛋白處理這些細胞時，IL-17的產生顯著減少(圖9)。
實駘例3 TNFR2-IL21R融合蛋白增加FoxP3的表汰和IL-10的產牛<3-l>TNFR2~IL21R融合蛋白增加FoxP3的表汰為了研究TNFR2-IL21R融合蛋白是否可以增加Treg的功能，通過流式細胞儀測定FoxP3 (在Treg細胞中生成的轉錄因子)的表達，所述Treg是免疫抑制細胞之一，其與自身抗原保持平衡以保護免受自身免疫性影響，同時抑制Thl7細胞響應。用10 μ g/ml的TNFR2-Fc、IL21R_Fc、以及TNFR2-IL21R融合蛋白處理通過實驗例〈2-2>中描述的方法分化的Thl7細胞，接下來培養(yǎng)I小時。這些細胞在受到如上述相同的刺激后培養(yǎng) 3 天，用 25ng/ml 的 PMA、250ng/ml 的 Ionomycine、以及 Golgistop (BDPharmingen, San Diego, CA, USA)處理5個小時。然后，收集這些細胞并且以20 μ 1/1 X IO6個細胞的濃度用多甲藻素葉綠素蛋白(PerCP)抗人CD4(Bioscience, San Diego, CA, USA)抗體和別藻藍素(APC)抗人⑶25 (e-Bioscience, San Diego, CA, USA)抗體處理，接下來在暗處在4°C下反應30分鐘。用FACS緩沖液(O. 002%疊氮化鈉，0. 2%BSA在PBS中)洗滌細胞。向其中加入Iml透化緩沖液，接下來反應30分鐘。在用透化緩沖液洗滌細胞以·后，以20 μ 1/1Χ IO6個細胞的濃度,用異硫氰酸突光素-抗人FoxP3 (e-Bioscience, SanDiego，CA，USA)處理所述細胞，接下來在暗處在4°C下反應30分鐘。在用透化緩沖液再次洗滌細胞后，去除上清液，然后向其中加入FACS緩沖液，接下來用流式細胞儀分析(BectonDickinson, San Diego, CA, USA)。結果如圖10所示，相比于用TNFR2-FC或IL21R_Fc處理，當用TNFR2-IL21R融合蛋白處理時，最具代表性的Treg轉錄因子FoxP3的表達顯著增加(圖10)。<3-2>TNFR2-IL21R融合蛋白增加IL-10的產牛為了研究TNFR2-IL21R融合蛋白是否可以增加Treg的功能，通過ELISA定量在Treg細胞中產生的抗炎細胞因子IL-10，所述Treg是免疫抑制細胞之一，其與自身抗原保持平衡以保護免受自身免疫性影響，同時抑制Thl7細胞響應。以2μ g/ml (100 μ I/孔)的濃度添加IL-10抗體(R&D Systems)到96孔板中進行夾心ELISA，接著在室溫下反應2小時。向其中加入200 μ I通過將1%BSA與0. 05%PBST混合制成的封閉緩沖液，接下來在室溫下反應2小時。將用作標準物的人重組IL-10 (R&DSystems)連續(xù)稀釋到5，000^78. 125pg/ml。向每個孔中添加在實驗例〈3_1>中獲得的細胞培養(yǎng)基上清液(100μ I/孔)，以和標準物一起測定，接下來在室溫下反應2小時。在完成反應后，板的每個孔用300 μ 10. 05%的PBST洗滌4次。生物素綴合的抗人IL-10 (R&DSystems)以200ng/ml的濃度稀釋，按100 μ I/孔分配到每一個孔中，接下來在室溫反應下2小時。完成反應后，板用PBST洗漆4次。ExtraAvidin-堿性磷酸酶綴合物(Sigma, Louis, MO, USA)以1:2000的濃度稀釋，按100 μ I/孔分配到每一個孔中，接下來在室溫下反應2小時。用PBST洗滌板后，將100 μ I磷酸二鈉鹽六水合物(PNPP)/DEA溶液(lmg/ml)添加到板的每個孔中進一步反應。在完成反應后，向其中添加100 μ 10. 2Ν NaOH以終止反應，然后測量OD4tl5。結果如圖10所示，相比于用TNFR2-FC或IL21R_Fc處理，當將TNFR2-IL21R融合蛋白處理到Thl7極化態(tài)中時，IL-10的產生顯著增加(圖10)。實驗例4 TNFR2-IL21R融合蛋白減少破骨細胞的分化〈4-1>破骨細胞的培養(yǎng)通過使用經肝素處理的注射器從健康人獲得血液，然后用PBS以1:1的比率稀釋所述血液。以1:4的比率添加Ficoll到經稀釋的血液中，使血液浮在Ficoll層的上面，接下來在20°C下以2000rpm離心30分鐘。外周血單核細胞從血沉棕黃層分離。分離出來的細胞用PBS洗漆，然后在補充了 10%胎牛血清的a MEM(Invitrogen, Burlingame, CA, USA)中進行稀釋。這些細胞以5 X IO5個細胞/500 μ I的濃度分配到24孔板，接下來在37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時。2小時后，除去沒有附在底部的細胞。用PBS洗滌后，向其中加入500 μ 110%的αΜΕΜ。用100ng/ml的重組人巨噬細胞/單核細胞菌落形成因子(M-CSF，R&DSystems, Minneapolis, MN, USA)刺激所述細胞,接下來培養(yǎng)3天。3天后,這些細胞用PBS洗滌并且將培養(yǎng)液替換為新鮮的10%的a MEM。細胞再次用25ng/ml的rhM-CSF和30ng/ml的核因子K B受體活化體配體(RANKL, Peprotech, London, UK)刺激。然后，分別以IOyg/ml的濃度，向細胞中加入TNFR2-FC、IL21R-Fc和TNFR2-IL21R融合蛋白，接下來進一步培養(yǎng)。培養(yǎng)基每3天替換一次，并且再次用上述刺激條件處理。觀察細胞分化以確定刺激頻率?！?-2>破骨細朐染色·
分化的細胞用TNF- α 和 IL-21 拮抗劑 TNFR2_Fc、IL21R-Fc 及 TNFR2-IL21R 融合蛋白處理，以通過與上述相同的方法誘導破骨細胞分化。分化的破骨細胞用10%福爾馬林固定。用PBS洗滌細胞三次后，分化的破骨細胞用酒石酸鹽耐酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(Sigma，Louis, MO, USA)檢查。將45ml預熱的消毒蒸餾水(37°C )與試劑盒中的500 μ I率紅色基GBC (fast Garmet GBC Basr)溶液和500 μ I亞硝酸鈉溶液混合。500 μ I萘酌·AS-BI溶液、2ml醋酸溶液、和Iml酒石酸鹽溶液被逐步加入到混合溶液中。攪拌均勻后，將混合物按200 μ I加載到固定的細胞上，接下來在37°C下染色30分鐘。通過觀察染色程度來控制反應時間。至少含有3個核的TRAP-陽性(紅紫色)的多核細胞被視為破骨細胞，其在光學顯微鏡下鑒定到。用4組細胞至少進行三次實驗，結果用平均值土標準差表示。結果，如圖11所示，通過M-CSF和RANKL的刺激，破骨細胞的分化積極進行。然而，相比于用TNFR2-FC和IL21R-FC處理，這樣的分化被TNFR2-IL21R融合蛋白處理有效地抑制(圖11)。<4~3>組織蛋白酶K的表汰從用TNFR2-Fc、IL2IR-FcjP TNFR2-IL21R融合蛋白處理的分化的細胞中提取RNA，通過與實施例〈2-3>中描述的相同方式由所述RNA合成cDNA，以測定組織蛋白酶K的表達。結果，如圖11所示，相比于用TNFR2-Fc和IL21R_Fc處理，通過M-CSF和RANKL刺激誘導的組織蛋白酶K的表達被TNFR2-IL21R融合蛋白處理更為顯著地抑制(圖11)。實驗例5 =CIA小鼠模型中TNFR2-IL21R融合蛋白對關節(jié)炎的治療作用為了研究本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白對關節(jié)炎的治療作用，用TNFR2-IL21R融合蛋白治療CIA (膠原誘導關節(jié)炎)小鼠模型。然后，研究了治療作用。具體而言，為了誘導CIA，6周DBA/1J小鼠(OrientBio，Korea)在尾部注射100 μ gII型膠原(CU))，所述膠原混有相同量的完全弗氏佐劑(CFA)，從而實現(xiàn)初次免疫。每個實驗組有6只小鼠。從免疫后的一個星期(7天)，通過腹腔注射(I.P.)給小鼠施用50ygIL21R/TNFR2-Fc (TNFR2-IL21R融合蛋白)和100 μ g依那西普，每星期三次，持續(xù)三周(共9次)。從初次免疫后，三位研究人員觀察關節(jié)炎癥，每周三次。通過平均關節(jié)炎指數(shù)如下進行評估；分等級地給出分數(shù)；給出的分數(shù)全部相加，再除以4，以得到平均值；將從三位不同的研究人員對于每個小鼠獲得的平均值相加，由此得到平均數(shù)。一條腿給予25%，在此基礎上計算腫脹的腿的數(shù)量，從而得到發(fā)病率O分沒有水腫或者腫脹；I分輕度水腫和發(fā)紅，限于food或踝關節(jié)；2分輕度水腫和發(fā)紅，從踝關節(jié)到跖骨；3分嚴重水腫和發(fā)紅，從踝關節(jié)到跖骨；4分水腫和發(fā)紅，從腳踝到整條腿。結果，如圖12所示，經觀察臨床評分和發(fā)病率，證實在用本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白治療的CIA小鼠模型中有很好的關節(jié)炎治療作用。這樣的治療作用優(yōu)于在用傳統(tǒng)的關節(jié)炎治療藥劑依那西普治療的陽性對照組中觀察到的(圖12)。 實驗例6 :通過免疫組織化學染色證實RNFR2-IL21R融合蛋白對CIA小鼠模型的關節(jié)炎的緩解作用從實驗例5中的用TNFR2-IL21R融合蛋白和依那西普治療的實驗CIA小鼠模型組提取關節(jié)。進行免疫組織化學染色，以研究關節(jié)中的浸潤和炎癥以及軟骨破壞。具體而言，為了進行免疫組織化學染色，從分別用TNFR2-IL21R融合蛋白和依那西普治療的CIA小鼠取得關節(jié)。然后，關節(jié)被固定在10%中性緩沖福爾馬林中，并且用EDTA對骨進行脫鈣。將關節(jié)組織包埋在石蠟中。將石蠟包埋的關節(jié)組織制成7μπι厚的小片，然后放在載玻片上。染色前，通過使用二甲苯進行脫蠟，同時，用乙醇進行脫水(高濃度一低濃度)。然后用蘇木精和曙紅進行染色。通過使用番紅精O和甲苯胺藍法測定軟骨破壞和炎癥，所述番紅精O和甲苯胺藍法可以檢測包含在軟骨內的蛋白聚糖。結果，如圖13所示，相比于沒有用做任何處理，當CIA小鼠模型用TNFR2-IL21R融合蛋白處理時，細胞浸潤顯著降低。同樣通過使用番紅精O和甲苯胺藍法觀察到，當用TNFR2-IL21R融合蛋白進行處理時，炎癥和軟骨破壞也得到緩解(圖13)。實驗例7 :通過免疫組織化學染色證實TNFR2-IL21R融合蛋白對CIA小鼠樽型炎癥的緩解作用從實驗例5中用TNFR2-IL21R融合蛋白和依那西普治療的實驗CIA小鼠模型組提取關節(jié)。進行免疫組織化學染色，以研究炎性因子的表達。具體而言，從分別用NFR2-IL21R融合蛋白和依那西普治療的CIA小鼠取得關節(jié)。然后，關節(jié)被固定在10%中性緩沖福爾馬林中，并且用EDTA對骨進行脫鈣。將關節(jié)組織包埋在石蠟中。將石蠟包埋的關節(jié)組織制成7μπι厚的小片，然后放在載玻片上。染色前，通過使用二甲苯進行脫蠟，同時，用乙醇進行脫水(高濃度一低濃度)。通過免疫組織化學法染色的方法，對炎性細胞因子IL-17、TNF-α、IL-I β、和IL-6以及核因子-κ B受體活化體(RANK)和血管內皮細胞生長因子(VEGF)進行染色，然后在光學顯微鏡下觀察。結果，如圖14所示，相比于其它沒有用融合蛋白治療的CIA小鼠模型組，在用本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白治療的組中，炎性細胞因子IL-17、TNF-α、IL-1 β、和IL-6的表達均減少。此外，幾乎沒有觀察到對血管生成最重要的因子VEGF的表達，以及顯示破骨細胞分化的RANK。在用TNFR2-IL21R融合蛋白治療的組中，炎性細胞因子VEGF和RANK的這種表達情況和依那西普治療組的情況一致，從而表明，本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白也可以有效地用于治療關節(jié)炎(圖14)。實驗例8 =CIA小鼠模型中CH特異性IgG2a的產生用于實驗例5的CIA小鼠模型通過一次注射II型膠原(CII)進行免疫。然后，給該動物施用本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白，每周3次，持續(xù)三周(共9次)。在給藥期間測量血液CII。將與相同數(shù)量的完全弗氏佐劑(CFA)混合的100 Ug CU注射到DAB老鼠的尾部。一個星期后，給小鼠施用本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白三周共9次。在TN FR2-IL21R融合蛋白給藥前(O)、第一次給藥后、第六次給藥后、以及最后一次給藥后的6 12小時之內，從小鼠的眼睛取血。為了測定CU-特異性IgG2a的量，將CII抗體以1:1000的比率稀釋，用稀釋液涂布96孔板，接下來反應2小時。除去涂布緩沖液后，將200 μ I封閉緩沖液添加到每個孔中，接下來在室溫下反應I小時。然后，稀釋實驗組或對照組的血清，然后加入孔中(50 μ I/孔)，接下來在室溫下反應I小時。在用IgG洗滌緩沖液洗滌板5次后，向其中添加抗小鼠IgG HRP (1:75, 000) (50 μ I/孔)，接下來在室溫下反應I小時。完成反應后，用IgG洗滌緩沖液洗滌板5次，接下來與TMB底物溶液反應。通過使用IN H2SOjS止顏色變化，然后用ELISA讀取器測定0D45Q。結果，如圖15所示，在沒有用任何Fe融合蛋白治療的CIA小鼠模型組中，CII-特異性IgG2a的量隨時間的變化不改變。然而，在用TNFR2-IL21R融合蛋白治療的組中，CU-特異性IgG2a的量隨著給藥次數(shù)而減少。此外，在用依那西普治療的組中，在第一次給藥后OD值似乎有略微增加，但是在再次給予依那西普后開始減少(圖15)。實驗例9 =CIA小鼠樽型脾臟中Thl7和Treg細胞表汰的測定為了研究本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白對CIA小鼠模型中Thl7和Treg細胞表達的作用，從用于實驗例5的小鼠提取脾組織。然后，通過免疫染色的共焦顯微術觀察Th 17 (CD4+1L-17+)和 Treg (CD4+CD25+Foxp3+)細胞。具體而言，從實驗例5中的CIA小鼠模型提取脾臟，然后用OCT化合物包埋。通過使用液氮速凍組織，用cryotome切成7μπι的小片，然后放在載玻片上。用丙酮固定放在載玻片上的小片，然后通過使用10%正常山羊血清封閉非特異性反應30分鐘。通過使用PE標記的抗-⑶4抗體、另Il藻藍素標記的抗-⑶25抗體(BD Biosciences)、以及FITC標記的抗-Foxp3Ab抗體進行Treg標記物⑶4、⑶25、和Foxp3的染色。通過使用生物素化的抗-⑶4抗體(BD Biosciences)和PE標記的抗-IL-17抗體進行Thl7標記物CD4和IL-17的染色。所述抗體在PBS(pH 7. 5)以1:100的比率稀釋，接下來與放在載玻片上的組織在4°C下反應過夜。第二天，與生物素化的抗-CD4抗體反應的組織再與鏈霉親和素cy-3在室溫下反應2小時。用PBS洗漆載玻片3次后，在共焦顯微鏡(LSM 510Meta. Zeiss, Gottingen, Germany)下觀察染色的組織。結果，如圖16所示，相比于沒有做任何治療的CIA小鼠模型，在從用本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白治療的CIA小鼠模型中獲得的脾組織中，F(xiàn)oxp3+細胞的數(shù)量增加。與此同時，相比于沒有做任何治療的CIA小鼠模型，在用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普治療的組中，Thl7(CD4+IL-17+)的表達降低(圖16)。本發(fā)明組合物的制備實施例的描述如下。制備例I :藥物制劑的制備
〈1-1>散劑的制備TNFR2-IL21R 融合蛋白2g乳糖Ig通過混合上述所有組分制備散劑，按照用于制備散劑的常規(guī)方法將它們填充到密閉包裝中。<1-2>片劑的制備
TNFR2-1L21R 融合蛋白i OOmg 玉米淀粉IOOmg
乳糖IOOmg
硬脂酸鎂2mg按照用于制備片劑的常規(guī)方法，通過混合上述所有組分制備片劑?！?-3>膠囊劑的制備
TNFR2-I LI IR融合蛋白I OOmg
玉米淀粉IOOmg
乳糖IOOmg
硬脂酸緩2mg通過混合上述所有組分，按照用于制備膠囊劑的常規(guī)方法將他們填充到明膠膠囊中，制備膠囊劑。<1~4>丸劑的制備
TNFR2-1L21R 融合蛋白Ig
乳糖I 5g
甘油Ig
木糖醇0.5g通過混合上述所有組分按照用于制備丸劑的常規(guī)方法，制備丸劑。每每顆藥丸含有4g混合物。〈1-5>顆粒劑的制各
TNFR2-IL21 R融合蚩「3150mg
大豆提取物5 Omg
葡萄糖200mg
淀粉600mg混合上述所有組分，加入IOOmg 30%的乙醇。混合物在60°C下干燥，然后將制備好的顆粒填充到包裝中。
工業(yè)實用性如上文所述，本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白抑制Th 17細胞中炎性細胞因子IL-17 (最具代表性的自身免疫疾病之一的類風濕性關節(jié)炎的主要成因之一)的分泌，增加Treg細胞中FoxP3的表達，增加抗炎細胞因子IL-10的分泌，抑制組織蛋白酶K的表達，并且抑制破骨細胞的分化。因此，表明了本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白顯示出比TNFR2_Fc或IL21R-FC更好的作用。當給CIA(膠原誘導關節(jié)炎)動物模型施用本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白時，它抑制關節(jié)中的浸潤和炎癥，減少軟骨破壞，增加免疫抑制細胞Treg的表達，并顯示出了對自身免疫類風濕性關節(jié)炎的治療作用。因此，本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白可以有效地用作用于預防和治療自身免疫疾病的組合物的活性成分。本領域技術人員將會理解，在前面描述中公開的概念和具體實施方式
可以容易地用作基礎，以進行修改或設計其它與本發(fā)明具有相同目的的實施方案。本領域技術人員將會理解，這種等價的實施方案不偏離在所附權利要求書中說明的本發(fā)明的精神和范圍。 ·
權利要求
1.一種融合蛋白，在所述融合蛋白中，包含TNFR2 (腫瘤壞死因子受體2型)蛋白或所述TNFR2的胞外結構域的片段與包含IL21R (白介素-21受體)蛋白或所述IL21R的胞外結構域的片段相連接。
2.根據(jù)權利要求I所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的特征為具有由SEQ.ID. NO: I表示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權利要求I所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的特征為由20(Γ250個氨基酸組成。
4.根據(jù)權利要求I所述的融合蛋白，其中，所述包含TNFR2的胞外結構域的片段是多肽，所述多肽具有由SEQ. ID. NO:2表示的氨基酸序列。
5.根據(jù)權利要求I所述的融合蛋白，其中，所述包含TNFR2的胞外結構域的片段是多肽，所述多肽包含由SEQ. ID. NO:2表示的氨基酸序列的從N端的第23位 第179位氨基酸殘基。
6.根據(jù)權利要求I所述的融合蛋白，其中，所述包含IL21R的胞外結構域的片段是多肽，所述多肽具有由SEQ. ID. NO:3表示的氨基酸序列。
7.根據(jù)權利要求I所述的融合蛋白，其中，所述包含IL21R的胞外結構域的片段是多肽，所述多肽包含由SEQ. ID. NO: 3表示的氨基酸序列的從N端的第21位 第231位氨基酸殘基。
8.一種多核苷酸，其編碼根據(jù)權利要求7所述的融合蛋白。
9.一種表達載體,其包含根據(jù)權利要求8所述的多核苷酸。
10.一種轉化體，其通過用根據(jù)權利要求9所述的表達載體轉化宿主細胞制得。
11.一種用于預防和治療自身免疫疾病的組合物，所述組合物包含根據(jù)權利要求I所述的融合蛋白作為活性成分。
12.根據(jù)權利要求11所述的組合物，其中，所述自身免疫疾病選自惡性貧血、I型糖尿病、自體免疫關節(jié)炎、狼瘡、多發(fā)性硬化癥、反應性關節(jié)炎、和皮肌炎。
13.根據(jù)權利要求12所述的組合物，其中，所述自身免疫疾病是自身免疫關節(jié)炎。
14.一種用于治療自身免疫疾病的方法，所述方法包括給患有自身免疫疾病的受試者施用藥物有效劑量的根據(jù)權利要求廣權利要求7所述的融合蛋白之一的步驟。
15.一種用于預防自身免疫疾病的方法，所述方法包括給受試者施用藥物有效劑量的根據(jù)權利要求廣權利要求7所述的融合蛋白之一的步驟。
16.一種用于預防和治療自身免疫疾病的融合蛋白，其選自根據(jù)權利要求f權利要求7所述的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及TNFR 2-IL21R融合蛋白，其作為TNF-alpha (α)和IL-21的雙重拮抗劑。包含TNF-α和Il-21(被認為是自身免疫疾病之一的自身免疫類風濕性關節(jié)炎的主要原因)的雙重拮抗劑(TNFR2-IL21R融合蛋白)的組合物可以減少炎性細胞因子的分泌，增加抗炎細胞因子的分泌，抑制破骨細胞分化，作用優(yōu)于單一蛋白質如TNFR2-Fc和IL21R-Fc。本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白，不僅對CIA小鼠模型的關節(jié)炎有很好的治療作用，而且通過增加免疫抑制細胞Treg的表達，對自身免疫類風濕性關節(jié)炎也有很好的治療作用。因此，本發(fā)明的TNFR2-IL21R融合蛋白可以有效地用作用于預防和治療自身免疫疾病的組合物的活性成分。
文檔編號C12N15/62GK102906119SQ201180024858
公開日2013年1月30日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權日2010年3月19日
發(fā)明者樸榮祐, 趙基沅, 劉奭鎬, 柳奵, 尹善河, 樸芝賢, 宋恩貞, 李鐘鎬, 徐敏智, 趙善貞, 曹美羅, 金浩淵, 樸美京, 吳惠左, 樸真實, 禹赟珠, 邊財耿, 柳俊杰 申請人:韓國生命工學研究院, 加圖立大學校產學協(xié)力團