專利名稱：新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂多糖(LPS)的生物合成制備領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及用于從細菌細胞，諸如 通過細菌細胞培養(yǎng)獲得的細胞提取LPS的改進的方法和組合物。本發(fā)明的這些方法和組合物用于制備LPS、LPS衍生物，并且特別是用于制備3-0-脫酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)。置量
脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌外膜的外部小葉(external leaflet)的主要的表面分子，并且只存在于所述外部小葉中。LPS阻止了血清補體和吞噬細胞產(chǎn)生的細菌的破壞，并且與用于集落(colonisation)的粘附有關(guān)。LPS是大小約為10，000道爾頓的一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的復雜分子，并且由三個共價連接區(qū)域組成(如圖5所示)
(i)在外部區(qū)域的&特異性多糖鏈⑷-抗原)
(ii)核心寡糖中心區(qū)域
(iii)脂質(zhì)A-充當疏水性固定物(anchor)的最里面的區(qū)域，其包括運載長鏈脂肪酸的氨基葡萄糖二糖單元。發(fā)明概沭
本發(fā)明的一個目的是提供用于提取LPS的組合物和方法，其導致改進的LPS的細菌產(chǎn)率?？梢詮漠a(chǎn)生的細菌細胞的量(生物量)計算LPS產(chǎn)率。改進的LPS產(chǎn)率能夠使在給定的設(shè)備中制備更大量的LPS，或者使用較小設(shè)備制備等量的LPS。本發(fā)明的另一目的是提供用于提取LPS的方法，其顯示出從細菌細胞提取的LPS產(chǎn)率的更大可靠性和/或再現(xiàn)性。本發(fā)明的另一目的是提供用于提取LPS的更快的方法。因此，提供了從革蘭氏陰性菌細胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步驟使用包含水、醇和其它有機溶劑的組合物(LPS提取組合物)從細菌的細胞膜提取LPS。附圖
簡沭
圖I在50°C從細胞肉湯培養(yǎng)基IOlB提取的動力學 圖2來自肉湯培養(yǎng)基IOlB的再現(xiàn)性數(shù)據(jù) 圖3A :具有0%水的80個實驗的提取產(chǎn)率的分布 圖3B :具有1%的水的55個實驗的提取產(chǎn)率的分布 圖4 pH的影響
圖5顯示了 LPS分子的三個共價連接區(qū)域(i)在外部區(qū)域的特異性多糖鏈⑷-抗原)；(ii)核心寡糖中心區(qū)域；和(iii)脂質(zhì)A
圖6顯示了突變體明尼蘇達沙門氏菌(5 Minnesota) R595產(chǎn)生的截短的LPS，并且指出了相對于全長LPS的截斷位置。
具體實施例方式LPS提取的已知技術(shù)包括Galanos方法，其涉及用苯酚、氯仿和石油醚的混合物(PCP)提取LPS，然后蒸發(fā)氯仿和石油醚，添加丙酮和水以沉淀LPS，并且通過離心或過濾回收 LPS (Galanos et al. , Eur. J. Biochem. 9: 245 (1969))。Chen 方法涉及用氯仿和甲醇的混合物(CM)提取LPS，然后進行一系列的甲醇沉淀步驟。Galanos不適合商業(yè)制備LPS，因為其不適于大規(guī)模生產(chǎn)，并且使用引起健康和安全擔憂的溶劑混合物(例如，苯酚氯仿石油醚)。Chen方法產(chǎn)生富含LPS和磷脂的CM相，其通常需要多個沉淀步驟以獲得具有足夠純度以用于免疫刺激應用( 例如用作疫苗佐劑)的LPSOW002/078637公開了使用革蘭氏陰性菌(特別是明尼蘇達沙門氏菌{Salmonella minnesota))的深度粗糙的(deeprough)突變體菌株制備LPS和3D-MPL的方法。W002/078637的方法顯示了從2%變至12%的產(chǎn)率上的顯著可變性。需要改進的LPS提取方法。發(fā)明人已經(jīng)揭示除了醇和其它有機溶劑外，通過在LPS提取步驟中使用水，與其中在LPS提取步驟中不使用水的等效步驟相比，能夠得到較高的LPS產(chǎn)率。本發(fā)明人已經(jīng)證明了可以通過使用包含水的提取組合物從革蘭氏陰性菌提取脂多糖，其產(chǎn)生更多的LPS，具有更大的可靠性并且經(jīng)歷較短的時間(與缺水的等效組合物相比)，并且沒有與其它提取方法相關(guān)的某些缺點。除了增加的LPS產(chǎn)率以外，本發(fā)明人還揭示了通過在LPS提取組合物(水、醇和有機溶劑)中使用水，能夠以比沒有水時更大的可靠性并且在較少時間內(nèi)實現(xiàn)這種較大產(chǎn)率。如本文所用的術(shù)語“LPS產(chǎn)率”是指以干燥細菌細胞重量(DCW)的百分數(shù)的形式獲得的LPS的量。因此，提供了從細菌細胞培養(yǎng)物提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步驟使用包含水、醇和其它有機溶劑的LPS提取組合物從所述細胞提取LPS?！癓PS提取”或“從細菌細胞提取LPS”是指LPS被直接從細菌外膜除去。在本發(fā)明的另一方面中，提供了 LPS提取組合物?！癓PS提取組合物”是指其中從細菌的膜直接提取脂多糖的LPS提取步驟中使用的組合物/混合物。本發(fā)明的LPS提取組合物包含水、醇和其它有機溶劑，并且用于本發(fā)明的LPS提取方法。本發(fā)明的LPS提取組合物是單相提取組合物。“單相”是指液體形成單一均勻溶液而非其中液體是不能混溶的混合物。術(shù)語“水”(H2O)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。該術(shù)語包括純的和基本純的水(H2O)(包括通過蒸餾、去離子、離子交換處理或反滲透獲得的水)，以及包含少量雜質(zhì)的水(本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚水通常包含某些雜質(zhì))。水雜質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且包括無機離子、有機分子、微粒、膠體、溶解的氣體、微生物及其副產(chǎn)物。在特定的實施方案中，水是無菌的，因為其基本上沒有任何活的微生物。在進一步的實施方案中，水是過濾過的。本發(fā)明可以進一步使用水溶液，例如進一步包含堿的水。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物不包含其中溶解了酸的水。因此，在一個實施方案中，水的pH是中性的，即約pH 7。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了 LPS提取組合物，其包含水、醇和有機溶劑，其中水的pH在7以上。在本發(fā)明的特定實施方案中，提供了 LPS提取組合物，其中LPS提取組合物的pH不低于7。在特定的實施方案中，可以通過加入選自的氫氧化鈉(NaOH)、三乙胺(TEA)和碳酸氫鉀(KHCO3)的一種或多種的堿提高水的pH。術(shù)語“水”還包括去離子水。去離子水是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的術(shù)語，但是簡言之，去離子水是其中基本除去了所用礦物離子的水。可以通過電導率測量去離子的水平，并且在特定的實施方案中，去離子水的最大電導率為I μ西門子(siemens)/cm。本發(fā)明的水不必須與LPS提取組合物的其它組分分別添加。例如，LPS提取組合物中的水可以源自包含醇和水二者的醇溶液，并且因此，技術(shù)人員僅需要混合醇和有機溶劑來提供包含醇、有機溶劑和水的LPS組合物。正如已經(jīng)指出的，本發(fā)明人已經(jīng)揭示了向包含醇和其它有機溶劑的提取組合物中添加水導致更大的LPS產(chǎn)率和/或更大的LPS產(chǎn)率的一致性。因此，提供了包含水、醇和其它有機溶劑的LPS提取組合物，其中LPS提取組合物中水的量為約O. I-約I. 5% (v/v)。本發(fā)明的LPS提取組合物可以包含約O. 4%-1. 5%的水(v/v)，例如O. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8、
O.9、I. O、I. I、I. 2、I. 3、I. 4或1.5% (v/v)。特別地，本發(fā)明的LPS提取組合物中水的量為約 I % (v/v)，即 O. 8-1. 2% (ν/ν) ο本發(fā)明的LPS提取組合物包含除了醇以外的有機溶劑。術(shù)語“有機溶劑”是本領(lǐng)域熟知的。有機溶劑為能夠?qū)⒐腆w、液體或氣體溶質(zhì)溶于溶液中的含碳化學制品。 本發(fā)明的LPS提取組合物包含有機溶劑，其可以選自下組氯仿、鏈烷(alkane)、甲苯和石油醚。氯仿是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且由化學式CHCl3表示。鏈烷也是本領(lǐng)域熟知的。鏈烷是沒有任何環(huán)狀結(jié)構(gòu)的飽和烴。本發(fā)明的LPS提取組合物可以包含選自下組的鏈烷異辛烷、乙烷、庚烷和己烷。本發(fā)明的LPS提取組合物中不為醇的有機溶劑的百分數(shù)可以為約60%-約95% (v/V)，并且在本發(fā)明的特定實施方案中，LPS提取組合物包含約75% (v/v)-約90% (v/v)的除了醇以外的溶劑。本發(fā)明的LPS提取組合物特別包含約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89 或 90 % (v/v)的除了醇以外的溶劑。本發(fā)明的LPS提取組合物包含醇。如本文所用的術(shù)語“醇”被定義為任何非環(huán)狀的有機化合物，其中羥基(-0H)與烴基(alkyl)或取代的烴基基團的碳原子連接。為了闡明，本發(fā)明不包括芳香族不飽和醇，例如苯酚(環(huán)狀醇)，并且因此提供了包含水、醇和其它有機溶劑的LPS提取組合物，其中所述醇不為芳香族不飽和醇，例如苯酚。本發(fā)明的LPS提取組合物中醇的百分數(shù)可以為約5%-約40%，并且在本發(fā)明的特定實施方案中，LPS提取組合物包含約10% (v/v)-約30% (v/v)的醇。本發(fā)明的LPS提取組合物特別包含 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30% (v/v)的醇。本發(fā)明的LPS提取組合物中的醇可以選自下列異丙醇、甲醇、乙醇和丁醇。醇的選擇可以取決于許多因素，所述因素包括特定LPS提取組合物中的特定有機溶劑，因為某些醇不溶于某些有機溶劑。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了包含水、氯仿和甲醇的LPS提取組合物。在本發(fā)明的可替換的實施方案中，提供了包含水、鏈烷和乙醇的LPS提取組合物。如本文所定義的本發(fā)明的LPS提取組合物用于本文所述的本發(fā)明的LPS提取方法。因此，提供了從細菌細胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步驟在本文所定義的LPS提取組合物中從所述細胞提取LPS，所述LPS提取組合物包含水、醇和其它有機溶劑。LPS提取方法是技術(shù)人員熟知的?？梢愿淖儽景l(fā)明方法的各種參數(shù)而同時保持在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述參數(shù)包括溫度、時間和pH?？梢栽诩s35°C至約65°C的溫度進行包括在包含水、醇和其它有機溶劑的LPS提取組合物中從細胞提取LPS的步驟(LPS提取步驟)的本發(fā)明的方法。在本發(fā)明的特定實施方案中，在約45°C至約55°C，特別是45、46、47、48、49、50、52、52、53、54或55°C的溫度進行LPS提取步驟。在本發(fā)明的特定方法中，在約50°C進行提取步驟?？梢赃M行包括在包含水、醇和其它有機溶劑的LPS提取組合物中從細胞提取LPS的步驟的本發(fā)明的方法，其中在約7至約9，例如約7. 1、7. 2,7. 3,7. 4,7. 5,7. 6,7. 7,7. 8、7. 9,8. 0,8. 1,8. 2,8. 3,8. 4,8. 5,8. 6,8. 7、8. 8或8. 9的pH進行提取步驟。在本發(fā)明的特定實施方案中，在約7. 8至約9的pH進行LPS提取步驟，并且在本發(fā)明的甚至更特定的方法中，在約pH 8. 6進行提取步驟。包括在包含水、醇和其它有機溶劑的LPS提取組合物中從細胞提取LPS的步驟的本發(fā)明的方法可以進行約O. 5至約30小時。在本發(fā)明的特定實施方案中，LPS提取步驟進行I至20小時，特別是O. 5至I. 5、I至2、I. 5至2. 5或2至2. 5小時，例如O. 75、I、I. 25、
I.5、I. 75、2或2. 25小時。在本發(fā)明的特定方法中，提取步驟進行約一小時。本發(fā)明的方法可以進一步包括下列步驟(i)用乙醇溶液洗滌細胞；以及任選地( )用乙醇第二次地洗滌。在提取步驟之前用乙醇洗滌可以降低在LPS提取步驟中與LPS共同提取的磷脂的量，并因此洗滌能夠降低LPS提取中雜質(zhì)的量。因此，提供了從細菌細胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步驟
(i)用乙醇溶液洗滌細胞；
( )用乙醇第二次地洗滌細胞；以及
(iii)在包含水、醇和其它有機溶劑的LPS提取組合物中從細胞提取LPS。可以使用約75%至約95% (v/v)的乙醇溶液進行本發(fā)明的方法中的洗滌步驟(用水進行洗液的調(diào)節(jié)(balance))。在本發(fā)明的某些實施方案中，用約85% (v/v)的乙醇溶液進行第一次洗滌(i)。在本發(fā)明方法的進一步的實施方案中，用約90% (v/v)的乙醇溶液進行第二次洗漆(ii)。本發(fā)明方法的其它實施方案可以進一步包括用甲醇溶液洗滌細胞的步驟。因此，提供了從細菌細胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步驟
(i)用乙醇溶液洗滌細胞；
( )用乙醇第二次地洗滌細胞；
(iii)用甲醇洗滌細胞；以及
(iv)在包含水、醇和其它有機溶劑的LPS提取組合物中從細胞提取LPS。本發(fā)明的方法用于從細菌細胞(包括從細菌細胞培養(yǎng)物獲得的那些)提取LPS，以便可以使用和/或進一步加工LPS。因此，本發(fā)明方法的其它實施方案進一步包括從LPS溶液蒸發(fā)水、醇和其它有機溶劑的步驟，由此在提取步驟后產(chǎn)生干燥的LPS殘留物。適當?shù)兀峁┝藦募毦毎崛≈嗵?LPS)的方法，所述方法包括下列步驟
(i)用乙醇溶液洗滌細胞；
( )用乙醇第二次地洗滌細胞；
(iii)用甲醇洗滌細胞；
(iv)在包含水、醇和其它有機溶劑的LPS提取組合物中從細胞提取LPS;以及
(v)從LPS溶液蒸發(fā)水、醇和其它有機溶劑，由此產(chǎn)生干燥LPS殘留物。在本發(fā)明的另一方面中，提供了由本發(fā)明方法制備的LPS組合物。已經(jīng)顯示了 LPS的生物活性(諸如致死毒性、熱原質(zhì)性和佐劑性)與脂質(zhì)A部分有關(guān)。相反，免疫原性與特異性多糖組分(0-抗原)有關(guān)。長期已知LPS和脂質(zhì)A 二者的強佐劑作用，但是這些分子的高毒性妨礙了其在疫苗制劑中的應用。因此，已經(jīng)對降低LPS或脂質(zhì)A毒性同時保持其佐劑性做出了重要努力。在1966年從母體^smootti)菌株的培養(yǎng)物分離了明尼蘇達沙門氏菌i^aJmorwllei i/wesoia)突變體R595 (Luderitz et al. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374)。通過曬菌體板(panel of phage)篩選所選菌落對溶菌作用(Iysis)的易感性,并且僅選擇表現(xiàn)出小范圍敏感性(僅易受一種或兩種噬菌體影響)的那些菌落用于下一步研究。該努力導致分離出在LPS生物合成中有缺陷的，并且稱為明尼蘇達沙門氏菌(5 minnesota)R595的深度粗糙的突變體菌株。與其它LPS相比，由明尼蘇達沙門氏菌(5制備的那些是截短的并且具有較簡單的結(jié)構(gòu)(參見圖6)，因為它們
(i)不含有O-特異性區(qū)域-對從野生型光滑表型到突變體粗糙表型的轉(zhuǎn)變負責并且 導致毒力損失的特征
( )核心區(qū)域極短-該特征增加了菌株對多種化學制劑的易感性，以及
(iii)脂質(zhì)A部分被多至7個的脂肪酸高度?；?。因此，本發(fā)明的方法中使用的細菌細胞可以為沙門氏菌屬{Salmonella)或埃希桿菌屬(Bscherichia)的深度粗糙的突變體細菌菌株的細菌細胞。術(shù)語“深度粗糙的突變體細菌菌株”是指具有深度粗糙表型的革蘭氏陰性菌的菌株。深度粗糙表型是其中與脂質(zhì)A相連接的多糖部分僅由2-酮-3-脫氧-D-甘露辛酮糖酸(2-keto-3-deoxy-D-mannooctulonic acid) (KDO)的約2_3個殘基組成的一種表型。特別地，深度粗糙突變體細菌菌株選自沙門氏菌屬{Salmonella)。如果深度粗糙突變體細菌菌株選自沙門氏菌屬{Salmonella)，則其可以為明尼蘇達沙門氏菌{Salmonella minnesota)種，特別是明尼蘇達沙門氏菌{Salmonella minneso ia) R595菌株?？梢允褂闷渌疃却植谕蛔凅w細菌菌株，諸如空腸彎曲菌{Compylobacter jejuni) (Kanipes et al. 2004 Infection and Itmunity72:2452-2455)、大腸桿菌(￡ coif) K12 菌株 CS2429 (Klena et al. 2005 J. Bad.187:1710-1715)、大腸桿菌(￡ coli) D31m4 (Qureshi et al. 1988 J. Biol. Chem.263:11971-11976)、大腸桿菌(疋 co7i)菌株 F515 (Wiese et al. 1997 Biochemistry36:10311-10319)和奇異變形桿菌 iProteus mirabilis)菌株 R45 (Wiese et al. 1997Biochemistry 36:10311-10319)。4’-單磷酰脂質(zhì)A (4’_monophosporyl lipid A) (MPL)(可以通過對從革蘭氏陰性菌的深度粗糙的突變體菌株提取的LPS進行酸水解來獲得)保留了 LPS的佐劑性質(zhì)，同時顯示出了超過1000倍的毒性的降低(由雞胚蛋的致死劑量測量)(Johnson et al. 1987Rev. Infect. Dis. 9 Suppl: S512-S516)。通常將LPS在中等強度無機酸溶液(例如，(λ I MHCl)中回流大約30分鐘的時間。該操作導致在I位脫磷酸(dephosphorylation),以及在6’位脫碳水化合物(decarbohydration),產(chǎn)生MPL。3-0-脫酰單磷酰脂質(zhì)A (3D-MPL)(可以通過MPL的溫和堿水解獲得)具有進一步降低的毒性，同時仍保持佐劑性，參見美國專利第4912094號(Ribi Immunochemicals)。通常在諸如氯仿/甲醇混合物的有機溶劑中通過用諸如pH 10. 5的0. 5 M碳酸鈉的弱堿水溶液飽和進行堿水解。制備3D-MPL的進一步的信息可以在例如在美國專利第4912094號和PCT公開TO02/078637 (Corixa Corporation)中得到。因此，本發(fā)明的方法可以進一步包括使LPS經(jīng)歷連續(xù)的酸水解和堿水解以形成3D-MPL的步驟，并因此在本發(fā)明的進一步的實施方案中，提供了從革蘭氏陰性菌制備LPS衍生物的方法，所述方法包括下列步驟
(i)用乙醇溶液洗滌細胞；
( )用乙醇第二次地洗滌細胞；
(iii)用甲醇洗滌細胞；
(iv)在包含水、醇和其它有機溶劑的LPS提取組合物中從細胞提取LPS； (v)從LPS溶液蒸發(fā)水、醇和其它有機溶劑，由此產(chǎn)生干燥的LPS殘留物；以及
(vi)使LPS經(jīng)歷連續(xù)的酸水解和堿水解以形成3D-MPL。在本發(fā)明的另一方面中，提供了由本文所述的本發(fā)明方法制備的3D- MPL組合物。關(guān)于該申請的所有文獻，包括專利和專利申請都以最大可能并入本文中作為參考。除非上下文另有需要，在下面的本說明書和權(quán)利要求書通篇中，詞語“包括(comprise) ”以及變體,諸如“包括(comprises) ”和“包括(comprising) ”將理解為暗示包括所指明的整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟組，但是不排除任何其它的整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟組。本發(fā)明的方法通過參照下列非限制性實例來進行例示。
實施例實施例I :LPS提取方法
I.I標準洗滌方法(下列洗滌方法與實施例2類似)
該洗滌方法應用于在下列LPS提取實施例1、2和3中使用的細胞肉湯培養(yǎng)基90AU01B和 128A。將滅活肉湯培養(yǎng)基的一部分(通常為200L，含3-5 kg DCW，360_600g LPS1)裝入具有推進器、測溫探頭、氮氣覆蓋的并且在25mbar N2下的300L雙層夾套不銹反應容器中。將肉湯培養(yǎng)基在50°C在攪拌下通過在反應容器的雙層夾套中循環(huán)熱水加熱。通過在裝有孔徑為0. 22Mm (6 mm內(nèi)徑)且表面積為0. 15 m2的7通道圓柱形KERASEP 陶瓷膜(Ref 供應商KERMBB-XM2 (Groupe Novasep France))的正切流動過濾(TFF)單元上過濾(持續(xù)時間 1.5 h)將混合物濃縮至75L。在分析干重殘留物并檢查透明性之后，丟棄透過物(permeate)。在乙醇(158L)和水(18L)中稀釋滲余物(retentate)，產(chǎn)生250 L總體積。在50°C加熱混合物并在該溫度快速攪拌30分鐘。然后通過正切流動過濾(持續(xù)時間 I h)將混合物濃縮至50L，并收集透過物以進行分析。通過在50°C加入乙醇(180L)和水(20L)(持續(xù)時間 I h)以進一步洗滌滲余物。在快速攪拌30分鐘后進行過濾至50L。分析兩次洗滌的透過物的干燥殘留物并丟棄。然后在透析模式下在50°C在TFF單元上用甲醇替換滲余物中含有的乙醇/水Γ90/10)。以每份20 L將總體積為360L的甲醇加入到剩余物混合物中，同時過濾混合物以產(chǎn)生50L細胞的甲醇懸浮液(通常，殘留乙醇含量〈1%)，其基本沒有疏水性雜質(zhì)(磷脂)(持續(xù)時間h)。分析透過物的干燥殘留物并丟棄。典型地，在乙醇洗滌和用甲醇替換乙醇的步驟期間在透過物中除去了 20%的總DCW。此時，可以對滲余物混合物進行取樣以確定在實驗室規(guī)模(137ml)或中試工廠規(guī)模(260L)下進一步加工的DCW和材料。I. 2. 2無水提取方法(中試工廠規(guī)模)(為提取肉湯培養(yǎng)基90B所進行的) 在上述洗滌步驟后，(在144L的含有4kg DCW的肉湯培養(yǎng)基90A上)，將50L洗滌過
的細胞于甲醇中的懸浮液提取至氯仿/甲醇中。加入190L氯仿和20L甲醇。將混合物在50°C進一步加熱16h。在提取和過濾期間抽取定時收集的樣品。然后通過蒸發(fā)濾液的溶劑檢測提取的LPS的量以使產(chǎn)率計算與在肉湯培養(yǎng)基上測量的DCW相比較。
權(quán)利要求
1.LPS提取組合物，其包含水、醇和其它有機溶劑。
2.如權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述LPS提取組合物是單相的。
3.如權(quán)利要求I或2所述的組合物，其中所述LPS提取組合物中水的量為約O.I-約I.5% (v/v)。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的組合物，其中水的量為約1%(v/v)。
5.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的組合物，其中水的量為約O.5% (v/v)。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的組合物，其中所述醇選自下列甲醇、乙醇、異丙醇或丁醇。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的組合物，其中所述LPS提取組合物中醇的百分數(shù)為約 5%-約 40% (v/v)。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中醇的百分數(shù)為約10%(v/v)-約30% (ν/ν) ο
9.如前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述其它有機溶劑選自下組氯仿、鏈烷、甲苯和石油醚。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述鏈烷選自下組異辛烷、乙烷、庚烷和己烷。
11.如前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述LPS提取組合物中其它有機溶劑的百分數(shù)為約60% (v/v)-約95% (ν/ν) ο
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中其它有機溶劑的百分數(shù)為約75%(v/v)-約90%(v/v)。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的組合物，其中LPS提取溶液包含氯仿、甲醇和水。
14.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的組合物，其中所述LPS提取組合物包含鏈烷、乙醇和水。
15.用于從革蘭氏陰性細菌細胞提取LPS的如權(quán)利要求1-14中任一項所述的組合物。
16.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的LPS提取組合物在用于從革蘭氏陰性細菌細胞提取LPS的方法中的用途。
17.從革蘭氏陰性細菌細胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括在如權(quán)利要求1-14中任一項所述的LPS提取組合物中從所述細胞提取LPS的步驟。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中在約35°C-約65°C的溫度進行LPS的提取。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述溫度為約45°C-約55°C。
20.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述溫度為約50°C。
21.如權(quán)利要求16-20中任一項所述的方法，其中在7.8-9的pH進行LPS的提取。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述pH為約8.6。
23.如權(quán)利要求16-22中任一項所述的方法，其中在約I-約30小時內(nèi)進行LPS的提取。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中在約O. 5-約20小時內(nèi)進行LPS的提取。
25.如權(quán)利要求23或24所述的方法，其中在約I小時內(nèi)進行LPS的提取。
26.如權(quán)利要求16-25中任一項所述的方法，其進一步包括下列步驟i.用乙醇溶液或乙醇洗滌細胞；以及任選地ii.用乙醇或甲醇第二次地洗滌細胞。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中在i)和/或ii)中用約75-約95%的乙醇或甲醇溶液(v/V)洗滌細胞。
28.如權(quán)利要求26或27所述的方法，其中在約85%(v/v)的乙醇或甲醇溶液中洗滌步驟i)中的細胞。
29.如權(quán)利要求26或27所述的方法，其中用約90%(v/v)的乙醇或甲醇溶液在步驟ii)中洗滌細胞。
30.如權(quán)利要求16-29中任一項所述的方法，其進一步包括下列步驟用甲醇溶液洗滌細胞。
31.如權(quán)利要求16-30中任一項所述的方法，其進一步包括下列步驟從LPS溶液蒸發(fā)水、醇和其它有機溶劑，由此產(chǎn)生干燥的LPS殘留物。
32.如權(quán)利要求16-31中任一項所述的方法，其中所述細菌細胞為沙門氏菌屬或埃希氏菌屬的深度粗糙的突變體細菌菌株的細菌細胞。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述細菌細胞為大腸桿菌的細菌細胞。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述細菌細胞為明尼蘇達沙門氏菌的細菌細胞。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細菌細胞為明尼蘇達沙門氏菌R595的細菌細胞。
36.由權(quán)利要求16-35中任一項所述的方法制備的LPS組合物。
37.如權(quán)利要求16-35中任一項所述的方法，其進一步包括下列步驟使LPS經(jīng)歷連續(xù)的酸水解和堿水解以形成3D-MPL。
38.由權(quán)利要求37所述的方法制備的3D-MPL組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了從革蘭氏陰性細菌細胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步驟在包含水、醇和其它有機溶劑的組合物(LPS提取組合物)中從細胞培養(yǎng)物提取LPS。
文檔編號C12P19/04GK102933606SQ201180025064
公開日2013年2月13日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者P.查理斯, G.格爾德霍夫, V.曼庫索 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司